楊 瑾，文 藝，高素霞，劉玉霞，魯傳濤，王 飛，劉紅彥

（1. 河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，河南鄭州 450046；2. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，河南鄭州 450002）

丹參（Salvia miltiorrhizaBge.）為唇形科多年生草本植物，以干燥根和根莖入藥，具有活血調(diào)經(jīng)、消腫止痛、鎮(zhèn)靜安神等功效；藥理研究表明，丹參具有顯著的抗炎、抗血栓作用[1]，是治療心腦血管疾病的常用藥物之一。丹參主要產(chǎn)于河南、山東、四川、陜西、安徽、湖北等地[2]。河南省丹參種植面積約2萬hm2，隨著人工種植面積的擴(kuò)大，病害問題日益加劇，根腐病、枯萎病、根結(jié)線蟲病、白絹病等土傳病害發(fā)生且逐年加重[3?8]。其中，丹參根腐病在丹參整個(gè)生長期均可發(fā)生，主要危害丹參根部，導(dǎo)致丹參品質(zhì)和產(chǎn)量下降，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致絕產(chǎn)，已成為危害丹參生產(chǎn)的主要病害[9]。

丹參根腐病的病原在不同丹參產(chǎn)區(qū)有所差異，尖孢鐮孢菌（Fusarium oxysporum）能夠侵染丹參根部并造成枯萎和根腐癥狀，腐皮鐮孢菌（F. solani）是引起山東、四川丹參根腐病的優(yōu)勢病原菌，而引起陜西商洛丹參根腐病的病原菌主要是鐮孢屬真菌（Fusariumsp.）和1 種分類地位還不能完全確定的病菌[2?5]。前期調(diào)查發(fā)現(xiàn)，河南省丹參種植區(qū)丹參根腐病田塊發(fā)病率達(dá)100%，嚴(yán)重降低了丹參的產(chǎn)量，但有關(guān)其病原的研究尚未見報(bào)道。鑒于此，對河南丹參產(chǎn)區(qū)丹參根腐病的病原種類進(jìn)行系統(tǒng)地鑒定，旨在為丹參根腐病的防治提供技術(shù)支持和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 丹參根腐病田間調(diào)查及取樣

2018—2019 年在河南省禹州、澠池、方城、嵩縣4 個(gè)丹參產(chǎn)區(qū)調(diào)查根腐病的發(fā)生情況，共調(diào)查16 塊丹參田，其中澠池和嵩縣各有一塊丹參連作3 a 的田塊。每塊田采用五點(diǎn)取樣法，每點(diǎn)調(diào)查20 m2，統(tǒng)計(jì)丹參根腐病的發(fā)病率，描述癥狀并采集樣品，共取丹參根腐病樣品30份。

1.2 供試培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g，瓊脂18 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL。

1.3 丹參根腐病病原菌分離及純化

采用組織分離法[10]進(jìn)行病原菌分離，選取具有典型根腐病癥狀的樣品，在病健交界處切取5 mm×5 mm 大小的組織塊，用75%乙醇消毒10～15 s，5%次氯酸鈉消毒3 min，無菌水沖洗3 遍，用滅菌濾紙吸干，接種在含有硫酸鏈霉素（50 μg/mL）的PDA 培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)3 d。分離物多次純化后保存于25%甘油，置于-80 ℃冰箱待用。

1.4 柯赫氏法則驗(yàn)證

1.4.1 離體接種 采用根段接種法[11]，選取健康丹參根，無菌水沖洗干凈，切成長5 cm 的根段，放在鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿放置1個(gè)根段，用手術(shù)刀在根段中間劃一道傷口，將培養(yǎng)7 d 的分離物用打孔器打取直徑為8 mm 菌餅，接種于傷口。每個(gè)分離物重復(fù)3 皿，以接種PDA 瓊脂塊為對照（CK），28 ℃保濕培養(yǎng)7 d，觀察發(fā)病情況。

1.4.2 盆栽接種 將純化培養(yǎng)的病原菌在PDA 上培養(yǎng)5 d，無菌水沖洗后制成1×106個(gè)/mL 的分生孢子懸液，將孢子液灌入盆栽45 d 的丹參根部，每株接種20 mL，每個(gè)病原菌接種8 盆，其中4 盆進(jìn)行根部切傷，4 盆進(jìn)行無傷接種，設(shè)置無菌水接種作對照。接種后，記錄發(fā)病時(shí)間、發(fā)病率和癥狀表現(xiàn)，并對不同菌株的致病力進(jìn)行評價(jià)。

致病力標(biāo)準(zhǔn)[12]如下：

強(qiáng)致病力菌株：傷根及未傷根接種均發(fā)病，地上部分枯萎，主根和須根腐爛數(shù)大于總根數(shù)的1/2，且發(fā)病率>75%；中級致病力菌株：傷根及未傷根接種均發(fā)病，主根和須根腐爛占總根數(shù)的1/4～1/2，發(fā)病率>50%且≤75%；弱致病力菌株：傷根及未傷根接種均發(fā)病，主根和須根腐爛占總根數(shù)的1/4，發(fā)病率≤50%；條件致病菌：只有傷根接種的植株發(fā)病。

從接種后發(fā)病的丹參根部再次進(jìn)行病原分離，將分離物與接種菌株進(jìn)行一致性比對，完成柯赫氏法則驗(yàn)證。

1.5 病原菌鑒定

1.5.1 形態(tài)鑒定 將純化的病原菌接種在PDA 平板上，28 ℃下培養(yǎng)5 d，描述菌落形態(tài)，并在顯微鏡下觀察產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和分生孢子形態(tài)，測量分生孢子的大小，并與文獻(xiàn)[13]描述進(jìn)行比對。

1.5.2 分子鑒定 采用CTAB 法提取菌絲DNA，利用真菌rDNA-ITS 區(qū)ITS1/4 引物[14]對其進(jìn)行PCR 擴(kuò)增和測序，將獲得的鐮孢菌屬菌株ITS 序列在Fusarium-ID 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST 比對，使用延伸因子EF-1α 引物（EF1/2）[15]和層出鐮孢菌特異性引物PRO1/2[16]對鐮孢菌種類做進(jìn)一步鑒定，并上傳序列，獲得登錄號。

2 結(jié)果與分析

2.1 丹參根腐病的田間調(diào)查情況

2018—2019 年，河南省禹州、澠池、方城、嵩縣共16 塊丹參田根腐病的田塊發(fā)病率為100%，病株率在3.5%～85.0%。禹州、澠池、方城、嵩縣4 個(gè)丹參產(chǎn)區(qū)丹參根腐病的平均病株率分別為7.2%、34.2%、32.2%、37.1%；連作田塊發(fā)病最重，病株率達(dá)到了85.0%。初發(fā)病時(shí)丹參地上部植株僵化矮小，葉片邊緣紫紅色，后變?yōu)辄S色，最后枯死脫落，葉片脫落后，莖稈逐漸枯死，急性癥狀表現(xiàn)為莖稈與葉片同時(shí)干枯，地下部分須根先發(fā)病變褐、腐爛，蔓延導(dǎo)致主根變褐，最后呈干腐狀。在葉片發(fā)黃時(shí)期，對莖稈解剖后可見髓部變褐，主根上也能發(fā)現(xiàn)木纖維變褐（圖1）。河南產(chǎn)區(qū)丹參根腐病在6—8 月高溫、高濕季節(jié)為盛發(fā)期，透氣性差的黏性土壤病株率高。

圖1 丹參根腐病的田間癥狀Fig.1 Symptoms of root rot on S.miltiorrhiza in the field

2.2 丹參根腐病病原菌的分離純化

將從4 個(gè)產(chǎn)區(qū)采樣并經(jīng)分離獲得的30 個(gè)菌株多次純化后編號為F1—F30，按照菌落形態(tài)分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類（表1）。其中，Ⅰ類菌落為圓形，菌絲羊毛狀，氣生菌絲淡紫色，產(chǎn)淡紫色色素；Ⅱ類菌落為圓形，菌絲叢卷毛狀、稀疏、白色，不產(chǎn)色素；Ⅲ類形態(tài)為圓形，菌絲體具條紋，絨毛狀，中間稀疏并貼培養(yǎng)基生長，產(chǎn)淡紫色色素。

表1 丹參根腐病分離菌株的來源及形態(tài)類別Tab.1 Source information and morphological classification of strains of root rot on S.miltiorrhiza

2.3 柯赫氏法則驗(yàn)證結(jié)果

2.3.1 離體接種 F2、F15 和F21 菌株接種7 d，丹參根開始變褐、腐爛，14 d 后整個(gè)根段長滿菌絲并完全腐爛；F1、F5、F8、F14、F17 和F25 菌株接種7 d，丹參根出現(xiàn)根裂現(xiàn)象，14 d 后根部變褐（圖2）；其余菌株接種后未發(fā)病。結(jié)果表明，F(xiàn)1、F2、F5、F8、F14、F15、F17、F21、F25共9株菌株對丹參有致病性。

圖2 9株致病菌株對丹參根段離體接種結(jié)果Fig.2 The in vitro infection of nine pathogenic strains on S.miltiorrhiza roots

2.3.2 盆栽接種 對照丹參植株正常生長，主根呈鮮紅色（圖3A）。接種F1、F2、F5菌株的致病癥狀相同，傷根處理組顯癥時(shí)間依次為19、14、18 d，發(fā)病率分別為50%、75%、50%，發(fā)病初期葉片發(fā)黃萎蔫，接種后45 d 地上部一側(cè)枯萎，須根腐爛，主根發(fā)黑腐爛（圖3B），接種F1 和F5 菌株的丹參植株主根腐爛數(shù)占1/4，接種F2 菌株的丹參植株主根腐爛數(shù)占1/2；未傷根處理組顯癥時(shí)間分別為34、30、32 d。接種菌株F8、F14、F15、F17、F21 的致病癥狀相同，傷根處理組顯癥時(shí)間依次為18、18、19、17、14 d，發(fā)病率分別為50%、50%、50%、75%、100%，發(fā)病初期葉緣向背面翻卷，葉片由紫紅色逐漸變黃，接種后45 d 地上部全部枯萎，莖基部發(fā)黑，植株生長緩慢，傷根一側(cè)逐漸枯萎甚至死亡，須根腐爛（圖3C），接種F8、F14 和F15 的丹參植株主根腐爛數(shù)占1/4，接種F17 盆栽丹參植株主根腐爛數(shù)占1/2，接種F21 的丹參植株主根腐爛數(shù)占3/4；未傷根處理組顯癥時(shí)間分別為34、33、33、31、30 d。菌株F25傷根處理后第20 天開始顯癥，發(fā)病率為25%，一側(cè)葉片由紫紅色逐漸變黃，接種后45 d 植株莖基部發(fā)黑，植株生長緩慢，部分須根腐爛，主根黃白色（圖3D）；不傷根處理植株未發(fā)病。綜合比較傷根及未傷根處理組顯癥時(shí)間、發(fā)病程度和病株率發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)21為強(qiáng)致病力菌株，F(xiàn)2、F17 為中級致病力菌株，F(xiàn)1、F5、F8、F14、F15為弱致病力菌株，F(xiàn)25為條件性致病菌。

圖3 盆栽丹參接種病原菌45 d后的癥狀Fig.3 Symptoms of potted S.miltiorrhiza inoculated with pathogenic strains 45 d later

從以上接種植株的發(fā)病部位再次分離獲得的病原菌，與接種前病原菌形態(tài)一致，完成柯赫氏法則驗(yàn)證，可以確定F1、F2、F5、F8、F14、F15、F17、F21、F25共9株菌株均為丹參根腐病的病原。

2.4 丹參根腐病病原菌鑒定

2.4.1 形態(tài)學(xué)鑒定 菌株F1、F2 和F5 在PDA 培養(yǎng)基上菌落為圓形，菌絲羊毛狀，氣生菌絲淡紫色，產(chǎn)淡紫色色素（圖4A）；大型分生孢子罕見，呈細(xì)長鐮刀形（21.79～32.68 μm×2.62～4.25 μm），小型分生孢子假頭狀，棒形（4.38～12.36 μm×2.13～3.52 μm），無厚垣孢子（圖4B、C），符合鐮孢菌屬（Fusarium）真菌特征。

菌株F8、F14、F15、F17 和F21 在PDA 培養(yǎng)基上菌落為圓形，菌絲叢卷毛狀、稀疏、白色，不產(chǎn)色素（圖4D），產(chǎn)鐮刀狀大型分生孢子（37.02～54.62 μm×4.62～5.29 μm）和卵圓形小型分生孢子（8.93～16.96 μm×2.41～3.28 μm），小型分生孢子居多，呈假頭狀，產(chǎn)孢細(xì)胞單瓶梗（圖4E、F），符合腐皮鐮孢菌（F.solani）的特征。

菌株F25菌落形態(tài)為圓形，菌絲體具條紋，絨毛狀，中間稀疏并貼培養(yǎng)基生長，產(chǎn)淡紫色色素（圖4G），產(chǎn)鐮刀狀大型分生孢子（27.95～56.58 μm ×3.51～4.72 μm）和卵圓形小型分生孢子（4.23～10.96 μm × 2.53～3.38 μm），著生于側(cè)生瓶狀小梗上（圖4H、I），符合尖孢鐮孢菌（F. oxysporum）的特征。

圖4 菌株F1（A—C）、F8（D—E）、F25（G—I）的菌落形態(tài)及分生孢子特征Fig.4 Colony and spores morphological characteristics of isolaties F1（A—C），F(xiàn)8（D—E），F(xiàn)25（G—I）

2.4.2 分子生物學(xué)鑒定

2.4.2.1 rDNA-ITS 序列比對分析 F8、F14、F15、F17 和F21（NCBI 收錄號為MT371372、MT371374、MT371375、MT371377、MT371378）與Fusarium-ID數(shù)據(jù)庫中登錄號為FD 01865 的Fusarium solani同源性達(dá)到98%。菌株F1、F2、F5 和F25 僅能比對到鐮孢菌屬而無法確定具體的種。

2.4.2.2 EF-1α 序列比對分析 將引物EF1/2 擴(kuò)增出的序列在Fusarium-ID 數(shù)據(jù)庫中比對并構(gòu)建進(jìn)化樹（圖5），發(fā)現(xiàn)F1、F5（NCBI 收錄號為MT371382、MT371387）與F. proliferatum（FD 01389）親緣關(guān)系支持率為96%，F(xiàn)2（NCBI 收錄號為MT371384）與F.proliferatum（FD 01379）親緣關(guān)系支持率為89%。F8（NCBI 收錄號為MT371383）與F. solani（FD 01472）親緣關(guān)系支持率為87%，F(xiàn)14、F15、F17（NCBI收錄號為MT371385、MT371386、MT371388）與F.solani（FD 01458）親緣關(guān)系支持率達(dá)到93%，F(xiàn)21（NCBI 收錄號為MT371389）與F. solani（FD 01489）親緣關(guān)系支持率達(dá)到92%，F(xiàn)25（NCBI 收錄號為MT371390）與F. oxysporum（FD 00791）親緣關(guān)系支持率達(dá)到100%。

圖5 基于EF-1α序列鐮孢菌屬的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree based on EF-1α sequence of Fusarium species

2.4.2.3 特異性引物（PRO1/2）驗(yàn)證 以F21 為對照，利用層出鐮孢菌特異性引物（PRO1/2）對F1、F2、F5 菌株的DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示，F(xiàn)1、F2、F5菌株均能擴(kuò)增出1 個(gè)550 bp 的片段，F(xiàn)21 菌株未擴(kuò)增出條帶（圖6）。

圖6 層出鐮孢菌特異性引物PRO1/2擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜Fig.6 Electrophoretogram of DNA products amplified by PCR-primer PRO1/2 from F.proliferatum DNA

結(jié)合形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，確定了F1、F2、F5 均為F. proliferatum，F(xiàn)8、F14、F15、F21 均為F.solani，F(xiàn)25為F.oxysporum。

3 結(jié)論與討論

鐮孢菌屬真菌在自然界中分布廣泛，可侵染多種作物引起枯萎病或根腐病[17?21]，在其分子鑒定中，rDNA-ITS 和EF-1α 2 個(gè)位點(diǎn)應(yīng)用最多[22]，與ITS 序列相比，EF-1α 對鐮孢菌屬內(nèi)親緣關(guān)系近的種有更高的鑒別力[23?24]。本研究結(jié)合病原菌形態(tài)和分子鑒定以及柯赫氏法則驗(yàn)證，確定了引起河南產(chǎn)區(qū)丹參根腐病的病原為F.solani、F.proliferatum和F.oxysporum，其中F.proliferatum侵染丹參造成根腐病是首次報(bào)道，為丹參根腐病病原研究提供了基礎(chǔ)。

不同地區(qū)分離出的致病菌種類不同，且同一產(chǎn)區(qū)有多種病原，說明不同產(chǎn)區(qū)丹參根腐病病原分布存在差異，且存在復(fù)合侵染的現(xiàn)象。通過回接驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，不同病原菌致病力存在差異，由強(qiáng)到弱分別為F. solani、F. proliferatum、F. oxysporum，同種病原菌不同菌株的致病力也存在差異。

傷根接種比非傷根接種發(fā)病快、癥狀嚴(yán)重。因此，農(nóng)事操作和地下害蟲對丹參根部的傷害可能加重丹參根腐病的發(fā)生程度。丹參連作地塊，根腐病的發(fā)病率高達(dá)85.0%，明確了根腐病的發(fā)生是丹參連作障礙的重要因素之一。6—8月雨水較多，為丹參根腐病發(fā)病盛期，土壤黏重的地塊發(fā)病率高，因此種植丹參應(yīng)避免田間積水。

本研究對河南不同產(chǎn)區(qū)丹參根腐病進(jìn)行了系統(tǒng)調(diào)查，為丹參根腐病的診斷和防治提供了依據(jù)，但根腐病病原種類分布、復(fù)合侵染和致病力差異方面還需進(jìn)一步研究。