劉歡 劉濟明 駱暢 唐子燕 梁格林 代麗 李如琪

(貴州大學，貴陽，550025)

米槁(CinnamomummigaoH. W. Li)是樟科樟屬的1種高大喬木，成年株高可達25 m，是我國西南部少數(shù)民族地區(qū)的特有植物種，也是貴州省苗族的代表性藥用植物，具有重要的生態(tài)、經(jīng)濟、科學研究價值[1]。隨著以米槁藥材為原料的貴州民族藥品的開發(fā)、應用，米槁資源的需求量不斷增大[2]。目前，種子繁殖是米槁良種生產(chǎn)繁育最主要的方法，但野生米槁種子的保存完好率、萌發(fā)率較低[3]，種子育苗不能滿足市場需求，故急需開拓新的繁殖技術，填補米槁資源緊缺的空白。近年來，對米槁的研究多集中在藥林間作[4]、自然更新[5]、果實揮發(fā)油[6]等方面，鮮少有對米槁無性繁殖的研究?；诖?，本研究選取最適合米槁扦插生根的生長調(diào)節(jié)劑GGR-6及其最適質(zhì)量分數(shù)，以米槁1年生嫩枝穗條為試驗材料，通過對比分析GGR-6處理插穗生根過程的生理動態(tài)變化，探究其扦插繁殖的生根機制，為提高米槁繁殖率、加速苗木繁育提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為貴州省種源米槁，所用扦插穗條取自貴州省羅甸縣逢亭鎮(zhèn)逢亭村米槁育苗基地2年生米槁實生苗。選取生長健壯、無病蟲害的米槁1年生枝條，用穗條的中部制穗，每插穗留1～2片1/2葉。試驗扦插基質(zhì)為珍珠巖。于2016年6月—10月在貴州大學林學院苗圃進行米槁扦插試驗。

1.2 試驗處理

對扦插基質(zhì)進行消毒，插前插穗用30 mg·L-1的GGR-6生長調(diào)節(jié)劑浸泡4 h，同時以清水浸泡插穗作為對照(CK)。采用隨機區(qū)組設計，每個處理重復3次，每個重復30根插穗。從開始扦插后每隔10 d每個重復隨機抽取足量插穗，直至插后60 d，共采集7次。采集樣品需小心地從基質(zhì)內(nèi)拔出插穗，蒸餾水沖干凈后擦干迅速帶回，將各重復的插穗基部韌皮部剝下并經(jīng)過液氮處理后磨碎裝入離心管，于冰箱-20 ℃保存[7]。

1.3 扦插后管理

扦插后使用遮陰網(wǎng)將光強控制在自然光照的60%左右，扦插溫度控制在25～30 ℃，空氣濕度控制在80%以上。每隔10 d噴灑1 000 mg·L-1的多菌靈溶液進行滅菌，并對扦插苗進行常規(guī)管理。

1.4 米槁生根過程相關生理指標的測定

對試驗樣品進行營養(yǎng)物質(zhì)、酶活性、內(nèi)源激素的測定。采用蒽酮比色法測定可溶性糖、淀粉質(zhì)量分數(shù)，采用考馬斯亮藍G-250法測定可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)[8]。參照蔡楚恒[9]的方法測定過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、吲哚乙酸氧化酶(IAAO)的活性。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)進行內(nèi)源激素的測定。測定前將保存于-20 ℃冰箱中的樣品取出0.5 g，用液氮磨碎，裝入10 mL離心管中，再加入2 mL提取液分次將研缽沖洗干凈，全部轉入離心管中，在4 ℃條件下10 000 r·min-1離心10 min，取上清液轉入10 mL離心管，用干冰及泡沫箱送至成都百奧諾維生物科技有限公司進行內(nèi)源激素質(zhì)量分數(shù)的測定。用插穗中吲哚乙酸(IAA)、脫落酸(ABA)、赤霉素(GA)、玉米素核苷(ZR)的質(zhì)量分數(shù)及IAA與ABA質(zhì)量分數(shù)比值、IAA與ZR質(zhì)量分數(shù)比值評定米槁插穗的生根能力。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)均采用平均值±標準誤(n=3)表示，使用Excel2013、Origin2018進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計及圖表繪制，利用SPSS 20.0軟件進行顯著性分析，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)法進行LSD檢驗(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 米槁插穗生根過程中營養(yǎng)物質(zhì)動態(tài)

2.1.1 可溶性糖質(zhì)量分數(shù)變化

從圖1可以看出，在米槁插穗生根過程中，不同處理的可溶性糖質(zhì)量分數(shù)變化趨勢基本一致，呈V字型。以扦插20 d為臨界點，插穗體內(nèi)新陳代謝的加快使扦插的前20 d，2組不同處理的插穗可溶性糖質(zhì)量分數(shù)持續(xù)下降，說明不定根形成時期需要消耗大量的可溶性糖為其提供能量。扦插20 d后，處理組的可溶性糖質(zhì)量分數(shù)開始持續(xù)升高，對照組則在扦插30 d后呈現(xiàn)上升-下降-上升的變化。在扦插后的0～30 d，GGR-6處理的插穗體內(nèi)可溶性糖質(zhì)量分數(shù)始終低于清水對照組。扦插30 d后，不定根的形成使可溶性糖質(zhì)量分數(shù)回升，但清水處理的插穗愈傷組織發(fā)育、生根速率低于對照組，因此又出現(xiàn)1次可溶性糖質(zhì)量分數(shù)的下降，最終可溶性糖累積量低于對照組。

圖1 扦插過程中營養(yǎng)物質(zhì)質(zhì)量分數(shù)的變化

2.1.2 淀粉質(zhì)量分數(shù)變化

米槁扦插后淀粉質(zhì)量分數(shù)隨生根進程的變化而發(fā)生改變。在扦插的前30 d，由于愈傷組織形成及根原基發(fā)育需要淀粉分解形成可溶性糖提供能量，導致插穗體內(nèi)的淀粉質(zhì)量分數(shù)逐漸減少。在扦插后的0～20 d，GGR-6處理的插穗體內(nèi)淀粉質(zhì)量分數(shù)高于對照組。在扦插后20～30 d，2種處理的插穗體內(nèi)淀粉質(zhì)量分數(shù)相近。扦插后的30～50 d，不定根形成使插穗體內(nèi)的淀粉質(zhì)量分數(shù)開始回升。扦插50 d后，不定根的增多、伸長、生長使插穗體內(nèi)的淀粉被消耗。在這期間，處理組的淀粉質(zhì)量分數(shù)始終低于對照組，并在40 d時到達最低值，說明GGR-6處理促進了插穗根原基的發(fā)生及不定根的生長。

2.1.3 可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)變化

米槁插穗生根過程中，插穗體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)呈現(xiàn)下降-上升的規(guī)律，與可溶性糖質(zhì)量分數(shù)的變化趨勢一致，為V字型。在扦插的前40 d，愈傷組織與根原基的形成過程消耗了大量的營養(yǎng)物質(zhì)，導致可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)持續(xù)下降。扦插40 d后，插穗體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)開始逐漸上升。在扦插后的40～50 d，可溶性蛋白大量積累，為不定根的生長提供了物質(zhì)基礎。扦插50 d后，不定根數(shù)量的增多及其增粗生長使可溶性蛋白被分解，導致插穗中的可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)上升變緩。在整個扦插期間，清水對照組插穗體內(nèi)的可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)明顯低于處理組，說明GGR-6處理對插穗體內(nèi)可溶性蛋白的合成有促進作用，加速了不定根的發(fā)生及生長。

2.2 米槁插穗生根過程中相關氧化酶的活性動態(tài)

2.2.1 POD活性變化

米槁插穗生根過程中，POD的活性隨扦插天數(shù)的不同呈規(guī)律性變化。GGR-6處理的插穗體內(nèi)POD活性呈現(xiàn)上升-下降-上升的變化趨勢，在30 d時達到最低值。扦插初期，由于扦插環(huán)境的改變，插穗脫離母體后受到一定的損傷，導致POD活性升高；扦插中期，插穗逐漸適應扦插環(huán)境，POD活性開始下降。在之后的生根進程中，GGR-6處理組插穗的POD活性急劇上升，高于清水處理組，說明高活性的POD有利于不定根的形成。受插穗體內(nèi)外源生長調(diào)節(jié)劑的影響，清水處理組的插穗POD活性小于GGR-6處理組。

2.2.2 PPO活性變化

從圖2可以看出，GGR-6處理組插穗體內(nèi)的PPO活性在持續(xù)上升，清水處理組插穗體內(nèi)的PPO活性變化曲線為上升-下降-上升的雙峰曲線，在扦插20 d時到達第1個峰值，隨后在經(jīng)歷短暫時期的下降后又開始回升。可見，PPO活性隨插穗生根的進程呈現(xiàn)規(guī)律性變化。在扦插初期，插穗傷口導致PPO活性升高從而促進傷口愈合，清水處理組插穗的傷口對環(huán)境的應激反應更加劇烈，因此清水處理組插穗的PPO活性高于GGR-6處理組。在扦插30 d后，GGR-6處理組的PPO活性持續(xù)升高，利于插穗形成吲哚乙酸-酚酸復合物；清水處理組的PPO活性下降，導致生根較晚。在扦插40 d后，2個不同處理的插穗PPO活性均在升高，說明高活性的PPO有利于不定根的生長。

圖2 扦插過程中氧化酶活性的變化

2.2.3 IAAO活性變化

在扦插后的0～10 d內(nèi)，插穗體內(nèi)的IAAO活性降低，即分解IAA的能力降低，有利于插穗切口的愈合。在扦插后的10～30 d，2個不同處理的插穗體內(nèi)IAAO活性逐漸升高后趨于平緩，這一時期清水處理組的IAAO活性高于GGR-6處理組。在扦插30 d后，GGR-6處理的插穗體內(nèi)IAAO活性高于清水處理的，并在50 d時達到最大值。清水處理組插穗的IAAO活性在30 d時下降并維持在該水平直到試驗結束，這一階段是不定根形成、生長的關鍵時期，IAAO的活性越高，分解的IAA越多，從而誘導了根原基的形成。清水處理組插穗的IAAO活性低于處理，生長素質(zhì)量分數(shù)過高，抑制了不定根的產(chǎn)生，即IAA對植物表現(xiàn)出低質(zhì)量分數(shù)促進、高質(zhì)量分數(shù)抑制。由此說明，IAAO活性大小能影響插穗不定根的發(fā)生。

2.3 米槁插穗生根過程中內(nèi)源激素質(zhì)量分數(shù)及其比值變化

2.3.1 IAA質(zhì)量分數(shù)變化

IAA的質(zhì)量分數(shù)變化曲線與IAAO活性變化曲線相似。GGR-6處理、清水處理2種不同處理的插穗體內(nèi)IAA質(zhì)量分數(shù)變化相反。GGR-6處理的插穗體內(nèi)IAA質(zhì)量分數(shù)呈上升-下降-上升趨勢，在扦插后20 d時達到最大值，此時愈傷組織開始出現(xiàn)；扦插后20～50 d，插穗體內(nèi)的IAA質(zhì)量分數(shù)開始持續(xù)下降，說明誘導根原基形成不定根的過程需要消耗大量的IAA。清水處理組插穗體內(nèi)的IAA質(zhì)量分數(shù)變化幅度較小。在扦插后0～30 d內(nèi)，IAA質(zhì)量分數(shù)緩慢下降；在扦插30 d時到達最低值，隨后又開始緩慢上升。插穗扦插成活后(50 d后)，2組處理的插穗體內(nèi)IAA質(zhì)量分數(shù)都快速上升。

2.3.2 ABA質(zhì)量分數(shù)變化

在扦插初期，GGR-6處理的插穗體內(nèi)ABA的質(zhì)量分數(shù)下降，在扦插10 d時ABA質(zhì)量分數(shù)最低；扦插后10～20 d，植物對環(huán)境的應激反應使插穗體內(nèi)的ABA質(zhì)量分數(shù)增加，營養(yǎng)物質(zhì)得以積累，利于扦插成活；在扦插20 d以后，GGR-6處理組插穗體內(nèi)的ABA質(zhì)量分數(shù)持續(xù)降低，較低質(zhì)量分數(shù)的ABA有利于愈傷組織的形成及不定根的發(fā)生。清水處理組的插穗ABA質(zhì)量分數(shù)呈現(xiàn)上升-下降的規(guī)律，在40 d時達到最大值。扦插前期，清水處理組的插穗為了增強抗逆性，導致ABA質(zhì)量分數(shù)增高；扦插40 d后，ABA的質(zhì)量分數(shù)開始下降，這時出現(xiàn)不定根。清水處理組的ABA質(zhì)量分數(shù)在扦插各時期均高于GGR-6處理組，不定根出現(xiàn)的時間比GGR-6處理組晚，說明ABA能抑制不定根的形成。

2.3.3 GA質(zhì)量分數(shù)變化

清水處理的插穗體內(nèi)GA質(zhì)量分數(shù)變化趨勢與GGR-6處理的一致，但總體變化幅度小于GGR-6處理的。在扦插初期，插穗脫離了母體，植物細胞在新環(huán)境中生長緩慢，GA質(zhì)量分數(shù)下降。扦插后0～10 d，清水處理組的GA質(zhì)量分數(shù)下降幅度大于GGR-6處理組，并在扦插10 d時到達最低值。扦插后的10～30 d內(nèi)，2種不同處理的插穗體內(nèi)GA質(zhì)量分數(shù)出現(xiàn)上升，在30 d時，達到了1個小高峰，這時愈傷組織開始出現(xiàn)。經(jīng)歷短暫的上升后，GA質(zhì)量分數(shù)再次下降，說明少量的GA有利于不定根的發(fā)生。在扦插40 d后，GA質(zhì)量分數(shù)同IAA一樣，開始回升。40 d后屬于不定根的伸長期，說明這2種激素有促進不定根生長的作用。

2.3.4 ZR質(zhì)量分數(shù)變化

插穗內(nèi)的ZR質(zhì)量分數(shù)呈現(xiàn)出下降-上升的動態(tài)變化。扦插初期，各處理插穗內(nèi)的ZR質(zhì)量分數(shù)均出現(xiàn)了下降，清水處理組降低的幅度大于GGR-6處理組。在扦插后10～20 d，GGR-6處理、清水處理2種不同處理的插穗體內(nèi)ZR質(zhì)量分數(shù)有一次短暫的上升。扦插30 d前，GGR-6處理組插穗內(nèi)的ZR質(zhì)量分數(shù)一直高于清水處理組，這一時期愈傷組織開始形成，在GGR-6生長調(diào)節(jié)劑的作用下，ZR的合成加強，促進了愈傷組織的形成。清水處理組插穗內(nèi)的ZR質(zhì)量分數(shù)從扦插30 d開始快速上升，GGR-6處理組的從40 d開始平緩升高但低于清水處理組，說明插穗體內(nèi)ZR質(zhì)量分數(shù)較高，對不定根的形成有抑制作用，從而導致清水處理組的插穗生根晚于處理組。

2.3.5 激素比值變化

從圖3可以看出，扦插初期插穗對環(huán)境的抗逆反應使ABA質(zhì)量分數(shù)上升，導致扦插后40 d內(nèi)2組不同處理的插穗體內(nèi)IAA與ABA質(zhì)量分數(shù)比值均持續(xù)下降。GGR-6處理的插穗IAA與ABA質(zhì)量分數(shù)比值在0～10 d有短暫的上升，說明外源植物生長調(diào)節(jié)劑有利于插穗體內(nèi)IAA的積累，較高的IAA與ABA質(zhì)量分數(shù)比值有利于愈傷組織的形成。插穗體內(nèi)的IAA與ABA質(zhì)量分數(shù)比值在扦插后的10～20 d，經(jīng)歷短暫下降后保持平穩(wěn)。扦插40 d后，不同處理的插穗體內(nèi)IAA與ABA質(zhì)量分數(shù)比值逐漸上升。在扦插不同時期，GGR-6處理組插穗內(nèi)的IAA與ABA質(zhì)量分數(shù)比值均高于清水處理組，說明高IAA與ABA質(zhì)量分數(shù)比有利于插穗生根。

圖3 扦插過程中內(nèi)源激素質(zhì)量分數(shù)及比值變化

在米槁插穗生根過程中，GGR-6處理組插穗的IAA與ZR質(zhì)量分數(shù)比值與清水處理組的變化趨勢一致，均呈現(xiàn)先上升后下降的波動變化，其中清水處理組插穗的IAA與ZR質(zhì)量分數(shù)比值變化比較劇烈，出現(xiàn)2次高峰。在扦插20 d后，經(jīng)GGR-6處理的插穗IAA與ZR質(zhì)量分數(shù)比值高于清水處理組，同時GGR-6處理組插穗愈傷組織的形成早于清水處理組，說明IAA與ZR質(zhì)量分數(shù)比值高有利于愈傷組織的形成。在扦插30 d后，插穗體內(nèi)IAA與ZR質(zhì)量分數(shù)比值開始下降并趨向于平穩(wěn)變化，此階段為不定根的伸長生長階段。此階段插穗體內(nèi)ZR的質(zhì)量分數(shù)升高，使IAA與ZR質(zhì)量分數(shù)比值降低。總體來看，GGR-6處理組的IAA與ZR質(zhì)量分數(shù)比值高于清水處理組，說明IAA與ZR質(zhì)量分數(shù)比值高對扦插生根有促進作用。

3 結論與討論

植物插穗內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)是插穗生根前維持生命活動的重要能源，插穗內(nèi)所儲存的可溶性糖、淀粉、可溶性蛋白等營養(yǎng)物質(zhì)對其生根具有重要影響[10]。愈傷組織的形成、根原基的發(fā)生、不定根的伸長及生長等生根過程需要消耗大量的營養(yǎng)物質(zhì)。所以掌握扦插不同時期插穗體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的變化規(guī)律，有助于提高扦插生根效率[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，在扦插初期(0～30 d)，插穗內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)質(zhì)量分數(shù)有所下降，說明插穗在生根前無法從土壤中吸收營養(yǎng)，只能通過消耗營養(yǎng)物質(zhì)來維持生根過程中的各種生理活動。在不定根的形成、生長階段(40～50 d)，由于插穗不定根形成后從基質(zhì)中吸收一定養(yǎng)分，并且伴隨新葉的產(chǎn)生，光合產(chǎn)物的增多，減少了體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，故插穗體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)均有上升。插穗生根過程中可溶性淀粉質(zhì)量分數(shù)在扦插50～60 d時下降，主要是由于不定根的伸長生長消耗了大量的營養(yǎng)、能量?？傮w來看，GGR-6處理組的插穗體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)質(zhì)量分數(shù)高于清水對照組，說明GGR-6預處理能加快米槁插穗的生根進程。因此，外源植物生長調(diào)節(jié)劑通過調(diào)節(jié)插穗的生理生化基礎促進插穗的愈傷組織形成及不定根生長進程，這與鄭巧巧等[12]的研究結果一致。

植物扦插過程中，酶類在生長、發(fā)育、不定根形成及其他新陳代謝中發(fā)揮著重要的作用，其中吲哚乙酸氧化酶、多酚氧化酶、過氧化物酶的作用尤為顯著[13]。吲哚乙酸氧化酶通過分解吲哚乙酸、調(diào)節(jié)插穗體內(nèi)吲哚乙酸質(zhì)量分數(shù)影響插穗的生根進程。多酚氧化酶能夠催化酚類物質(zhì)與吲哚乙酸快速縮合，形成1種吲哚乙酸-酚酸復合物，該復合物是1種生根輔助因子，對不定根的形成有顯著的促進作用[14]。多酚氧化酶通過氧化吲哚乙酸間接影響不定根的生長、伸長[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，在扦插前期(0～30 d)，由于插穗的傷呼吸及對新環(huán)境的抗逆反應，且插穗具有低活性的吲哚乙酸氧化酶更利于愈傷組織的形成及生根[16]，從而導致了除了GGR-6處理組插穗的過氧化物酶活性在短暫的時間段高于清水處理組外，清水處理組插穗的氧化酶活性均高于GGR-6處理組。扦插30 d時是不定根形成的關鍵時期，GGR-6處理組插穗的3種氧化酶活性普遍高于清水處理組，說明經(jīng)過外源生長素的處理，插穗酶活性的變化更利于生根[17]。

植物內(nèi)源激素對難生根樹種的扦插生根起著重要作用，可以調(diào)節(jié)插穗內(nèi)抗氧化酶和養(yǎng)分的動態(tài)變化，促進根原基的形成[18]。本研究測定了米槁插穗生根過程中的內(nèi)源激素變化，研究結果顯示，米槁扦插生根過程中，吲哚乙酸質(zhì)量分數(shù)呈現(xiàn)上升-下降-上升的變化規(guī)律。在扦插初期，外源生長素的作用使插穗基部生長素積累，吲哚乙酸質(zhì)量分數(shù)上升，且插穗內(nèi)高質(zhì)量分數(shù)的吲哚乙酸能夠促進愈傷組織的形成。在愈傷組織形成時期，GGR-6處理的插穗吲哚乙酸、赤霉素質(zhì)量分數(shù)均高于清水處理組，因此，GGR-6處理組插穗的生根早于清水處理組。插穗體內(nèi)較低質(zhì)量分數(shù)的脫落酸有利于愈傷組織形成及誘導根原基形成不定根，同時促進插穗內(nèi)的淀粉水解為糖，為不定根的生長提供能量[19]。GGR-6處理組插穗在扦插初期的脫落酸質(zhì)量分數(shù)下降，在根原基的形成、不定根發(fā)生進程中，脫落酸質(zhì)量分數(shù)持續(xù)下降并趨于平穩(wěn)。在扦插40 d后，不定根形成過程中，清水處理組的插穗體內(nèi)脫落酸質(zhì)量分數(shù)開始劇烈下降。玉米素核苷在生根前期一直波動變化，且有下降的趨勢，說明不定根的形成需要消耗玉米素核苷。插穗的不定根形成后，新根重新合成細胞分裂素[20]，導致玉米素核苷質(zhì)量分數(shù)上升，以滿足插穗生根需要。在扦插生根過程中，插穗內(nèi)源激素作用的發(fā)揮不是單一的，而是相互協(xié)同參與插穗生根的整個過程，不同激素質(zhì)量分數(shù)比值的動態(tài)變化更能反映插穗的生根能力。本研究發(fā)現(xiàn)，高質(zhì)量分數(shù)比的IAA與ABA與生根呈正相關，這與盧楠等[21]的研究結果一致。因此，許多研究用IAA與ABA質(zhì)量分數(shù)比值衡量插穗的生根情況。然而，在扦插生根過程中，IAA與ZR質(zhì)量分數(shù)比值也有著重要的調(diào)節(jié)功能，吲哚乙酸和玉米素核苷的協(xié)同作用，促進了愈傷組織的形成，不定根的產(chǎn)生、伸長、生長[22]。上述研究表明，插穗的內(nèi)源激素通過動態(tài)聯(lián)合來調(diào)控不定根的發(fā)生過程，生長調(diào)節(jié)劑則通過調(diào)節(jié)內(nèi)源激素的質(zhì)量分數(shù)來間接影響不定根形成和發(fā)育[23-24]。

研究通過對比分析2種不同處理的插穗在扦插生根過程中生理機理的動態(tài)變化，證明了營養(yǎng)物質(zhì)質(zhì)量分數(shù)、內(nèi)源激素質(zhì)量分數(shù)、氧化酶活性與米槁的扦插生根有關，且GGR-6加速了這些物質(zhì)的代謝進程，促進了米槁的扦插生根。但米槁扦插生根的機制較為復雜，需要進一步對其生根機制進行深入解析。