李學堅，銀江林，袁經權**，蘇 健，趙小超，黎永紅，黃 艷，張雯艷，張桂珍

(1.廣西中醫(yī)藥大學科學實驗中心，廣西南寧 530222；2.那坡康正天然植物提取有限責任公司，廣西百色 533900；3.廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院，廣西南寧 530022)

0 引言

左旋多巴(L-dopa)收載于世界各國藥典，在帕金森綜合癥的臨床治療中起十分重要的作用[1]。1961年Birkmayer發(fā)現(xiàn)L-dopa有抗帕金森綜合癥作用[2]，1968年美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準應用于臨床，1973年上市銷售，市場需求日漸增長。L-dopa的生產途徑有化學合成法、生物酶催化法、生物發(fā)酵法和植物提取法?；瘜W合成法因L-dopa和D-dopa手性拆分技術難度大，成本高，僅有歐洲、日本等發(fā)達國家采用；生物酶催化法和生物發(fā)酵法因技術不成熟，產量低，目前沒有量產；植物提取法因原料豐富易得，工藝簡單，逐步成為主流[3]。植物提取法最初以蠶豆莢皮、蠶豆及藜豆為原料，后多采用貓豆；工藝也從酸提-鉛沉法[4]、稀醋酸法[5]發(fā)展到酸浸-離子交換法[6]。廣西以其貓豆資源優(yōu)勢，近二十年逐漸成為世界L-dopa的主要產區(qū)[7]，生產工藝為用稀HCl水溶液浸提，浸提液上001×7(732)陽離子交換樹脂柱，將L-dopa富集于柱上；交換飽和后用水洗柱，再用濃氨水將L-dopa從柱上洗脫；洗脫液用HCl中和，減壓濃縮，析出粗品；粗品用稀HCl溶液加熱溶解至飽和，冷卻析出結晶，過濾，烘干，即得L-dopa產品[8]；用過的陽離子交換柱，須用NaOH溶液和HCl溶液再生才能用于下一次交換。在上柱、洗柱及柱再生工序有大量工藝廢水產生；每生產1 kg L-dopa，可產生1.5-2.0 t高含淀粉、蛋白質、HCl和NaOH的廢水，環(huán)保壓力大，所有傳統(tǒng)生產廠家因環(huán)境評價不合格而面臨關停。目前國內外為解決L-dopa生產工藝排放黑臭廢水的研究鮮有報道。中國學者大多著重于新技術、新手段的應用，如汪桂芳等[9]利用膜分離技術提高分離效果，楊衛(wèi)華[10]采用重組酪氨酸酚裂解酶催化合成左旋多巴。波蘭Polanowska等[11]為了環(huán)境保護和縮短工藝流程，嘗試用0.2%醋酸水為溶劑從蠶豆中提取左旋多巴，但只是完成實驗室提取試驗，沒有精制出產品，也沒有進行工藝中試。

本研究摒棄傳統(tǒng)工藝，創(chuàng)新性地開發(fā)一種新的生產工藝，雖然水的濃縮、蒸發(fā)量較大，但不產生含淀粉、蛋白質、HCl和NaOH的廢水，能全面解決傳統(tǒng)工藝的黑、臭、高COD工業(yè)廢水問題，且產品得率、產品質量與傳統(tǒng)工藝相當，可減少企業(yè)環(huán)保壓力。

1 材料與方法

1.1 儀器

Alliance 2695型四元泵帶紫外檢測器高效液相色譜儀(Waters公司)，GM705H型破壁料理機(上海飛利浦(中國)投資有限公司)，HB43-S型水分測定儀(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)，DHG9246A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)。

1.2 材料

聚丙烯酰胺(PAM，非離子型，廣州東歌化工科技有限公司)；聚合氯化鋁(PAC，鞏義市碧波供水材料有限公司)；HCl、NaOH和MgCl2(西隴科學股份有限公司)；甲醇(Thermo Fisher)；維生素C(VC，東營市華璇生物科技有限公司)；單寧酸(廣州市德晟化工有限公司)；蒙脫石(粵江新材料(廣州)有限公司)；食品級95%酒精(廣西崇左東亞糖業(yè)有限公司)；含量測定用試劑為色譜純，水為重蒸水；其余制劑為分析純。貓豆(又名狗爪豆)，經廣西中醫(yī)藥大學韋松基教授鑒定為豆科藜豆屬狗爪豆Mucunapruriens(Linn.) DC.var.Utilis (Wall.ex Wight) Bak.ex Burck的成熟、干燥種子[12]。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

常溫下用含VC水將干貓豆打成水漿，加PAM，靜置沉淀(第一次沉淀)，濾取濾液；濾液加熱煮沸，冷至室溫，加PAM，靜置沉淀(第二次沉淀)，濾取濾液，濃縮，靜置析出L-dopa粗品；濾取粗品，用pH值為3.5的HCl水溶液煮沸溶解至飽和，趁熱濾取濾液，冷卻，結晶析出L-dopa，濾取結晶，烘干得L-dopa原料藥產品。

1.3.2 供試液制備方法

1.3.2.1 含VC水的制備

常溫下操作，將1 g VC加入1 000 mL水中，充分攪拌使之完全溶解；用HCl調節(jié)pH值為4.5-5.0。

1.3.2.2 PAM溶液的配制

取1 g非離子型PAM加入到1 000 mL去離子水中，快速攪拌使之全部溶解。即配即用。與料液(水漿或濾液)混合時，要快速、充分地攪拌均勻。

1.3.2.3 貓豆水漿的制備

常溫下操作，將含VC水和干貓豆一起放入破壁料理機中，不加熱，轉速7 500 r/min打漿10 min，得混懸狀水漿。

1.3.3 L-dopa含量測定

按《歐洲藥典》中提及的方法[13]進行。

1.3.4 澄清效果測定

1.3.4.1 澄清效果指標

在規(guī)定料液溫度下操作；先將料液與沉淀劑快速、充分地攪拌均勻，再保溫靜置至規(guī)定時長，一次性倒入布氏漏斗，用2層Φ11 cm中速定性濾紙在-0.1 MPa真空度下抽濾10 min，測量濾液體積(VF)。

1.3.4.2 不同沉淀劑對澄清效果的影響

60 g貓豆，打成1 800 mL水漿，分成9等份，每份200 mL，分別與不同沉淀劑(各自預先溶于5 mL水)快速混勻，靜置，沉淀1 h，抽濾，測量濾液體積(VF)；取濾液測定L-dopa含量(C)。

1.3.5 基于貓豆原料的L-dopa轉移率計算

L-dopa轉移率T=(W產品×C產品)/(W原料×C原料)×100%，

式中：W產品為L-dopa產品質量；

C產品為L-dopa產品中L-dopa的含量；

W原料為貓豆原料的質量；

C原料為貓豆原料中L-dopa的含量。

2 結果與分析

2.1 操作溫度對水漿沉淀澄清的影響

預試驗結果表明，水漿溫度超過65℃，無論加入何種沉淀劑，水漿均呈大粘度的稀薄液體，難以過濾。因此工藝全部在室溫下操作，水漿溫度22-28℃。

2.2 不同沉淀劑對水漿沉淀澄清的影響

數據表明，不添加沉淀劑的水漿難以自然沉淀；加入PAC和PAM的沉淀效果最好。添加熟石膏粉、MgCl2、明礬、蒙脫石、PAC，水漿中L-dopa含量降低，且添加明礬、蒙脫石、PAC的水漿顏色變深；其余添加沉淀劑對水漿中的L-dopa 含量沒有影響(表1)。因此本工藝選用PAM作沉淀劑。

表1 不同沉淀劑對水漿沉淀效果的影響(x±s,n=3)Table 1 Effect of different precipitants on soymilk precipitation (x±s,n=3)

2.3 第一次沉淀工序的參數優(yōu)選

表2 第一次沉淀工序的因素和水平Table 2 Factors and levels of the 1st precipitation process

表3 第一次沉淀工序的試驗設計與結果Table 3 Test design and results of the 1st precipitation process

表4 第一次沉淀工序的方差分析Table 4 Variance analysis of the 1st precipitation process

極差分析顯示，因素影響大小為A>C>B，結果提示選A3B2C3。方差分析顯示，A有顯著影響(P<0.01)，B、C影響不明顯(P>0.05)。對數據進行單因素分析，A1→A2變化明顯(P<0.05)，A2→A3變化不明顯(P>0.05)，拐點在A2，因此選A3較妥；B、C因素變化拐點不明顯(P>0.05)，可結合實際情況選擇，越接近極差分析結果越佳。綜合考慮，選擇A3B2C2，即常溫下操作，1 kg貓豆用35 L含VC水磨成水漿；1 L水漿加0.15 g PAM，快速、充分攪拌混合，常溫靜置1.5 h，即可進行過濾。

2.4 第二次沉淀工序的參數優(yōu)選

采用L9(34)正交試驗法。按第一次沉淀工序優(yōu)化參數制備濾液，將濾液加熱煮沸15-30 min，使水溶性蛋白和淀粉變性析出，冷卻降溫到所需溫度。沉淀劑仍選用PAM，PAM在超過65℃的水中會出現(xiàn)分解，因此考察溫度定為25-50℃。取煮沸后冷卻降溫的濾液9份，每份200 mL，按表5的用量和溫度操作，加入PAM溶液，快速攪拌混勻，保溫靜置沉淀一定時間，抽濾，測量濾液體積(VF)，結果如表6，方差分析結果如表7。

表5 第二次沉淀工序的因素和水平Table 5 Factors and levels of the 2nd precipitation process

表6 第二次沉淀工序的試驗設計與結果Table 6 Test design and results of the 2nd precipitation process

表7 第二次沉淀工序的方差分析Table 7 Variance analysis of the 2nd precipitation process

極差分析顯示，因素的影響大小排序為A>C>B，應選A2B3C1。方差分析顯示，A影響非常顯著(P<0.01)，C影響顯著(P<0.05)，B影響不明顯(P<0.1)。對數據進行單因素分析，A1→A2變化明顯(P<0.05)，A2→A3變化不顯著(P>0.05)，拐點出現(xiàn)在A2，因此選A3較妥；B、C的變化拐點不明顯(P>0.05)。綜合考慮，選A3B3C1，即在室溫(25℃)下操作，1 L濾液加0.1 g PAM，快速攪拌混合，靜置2 h，即可進行過濾。

2.5 濃縮工序參數的優(yōu)選

按第一、二次沉淀工序優(yōu)化參數制備8 000 mL濾液，分為8等份，各自減壓濃縮至不同體積，冷卻至室溫，靜置6 h，濾取結晶，烘干，稱重，含量測定，計算基于貓豆的L-dopa轉移率，結果如表8。數據表明，當濃縮液體積是貓豆重量的2-2.5倍量時，L-dopa析出效果最好，過濾性亦佳。

表8 濃縮程度對結晶的影響Table 8 Effect of concentration degree on L-dopa crystallization

2.6 精制方法研究

沿用傳統(tǒng)工藝的成熟精制方法[14]。往耐酸容器中加入適量pH值為3.5的鹽酸水溶液(預先溶有3%的VC)，加熱至沸，加入L-dopa粗品溶解至飽和，加入粗品質量4%的藥用級活性炭粉，攪拌，保溫40 min；趁熱濾取飽和液，自然冷卻至常溫，析出結晶；濾取結晶，干燥后得到L-dopa產品。

2.7 工藝中試驗證

將本工藝在廣西那坡康正天然植物提取有限責任公司進行3批中試生產，產品按《歐洲藥典》進行含量測定。結果如表9所示,工藝運行平穩(wěn)，產品得率和產品質量與傳統(tǒng)工藝相當，工藝只產生少量含HCl的工業(yè)廢水。

表9 中試生產結果Table 9 Results of trial-production

3 討論

L-dopa不溶于乙醇、石油醚、乙酸乙酯等有機溶劑；在水中微溶，常溫下600 mL水可溶解1 g[15]。預試驗表明，貓豆其他成分對L-dopa有增溶作用，水中溶解度可超過3 mg·mL-1，因此只要有足量的水，貓豆磨成水漿10 min，豆中的L-dopa可溶解轉移入水中。L-dopa易溶于酸水，但如用pH<3.5強酸水提取，會因強酸水溶解太多雜質而導致L-dopa無法從濃縮液中析出。

本工藝的技術難點在于盡可能減少提取液中的雜質和提高產品得率。工藝采用室溫下水提、煮沸凝固析出水溶性淀粉和水溶性蛋白、加PAM沉淀劑等措施，目的是最大限度地減少提取液中的雜質。貓豆皮含有大量纖維，是第一次沉淀過濾的良好助濾材料，但形成的濾渣含水率較高，帶走較多提取液；兩次PAM沉淀過濾，累計損失約15%提取液，相當于損失約15%的L-dopa；濃縮析出粗品工序，有15%-20%的L-dopa殘留于母液，造成L-dopa的重大損失。沉淀、過濾、析出粗品工序尚有待優(yōu)化以提高L-dopa轉移率，最終提高產品得率。

在濃縮析出L-dopa工序的母液中尚含有少量L-dopa，可通過加入乙醇析出。工廠實際將母液直接烘干成為低含量L-dopa產品出售，既避免黑臭工藝廢水的產生，又省去防爆設備購置及防爆車間建設。

酪氨酸是L-dopa產品的相關物質之一，《歐洲藥典》要求其含量≤0.5%，《美國藥典》要求≤0.1%[16]。長期的生產數據表明，L-dopa結晶母液的pH值越接近中性，結晶中酪氨酸含量越低。本工藝全程控制pH值為5-6，經精制，產品中的酪氨酸含量很容易達到《中國藥典》和《歐洲藥典》要求，部分產品可達到《美國藥典》要求。

PAM能與分散于水溶液中的懸浮顆粒架橋、附著結團，有極強的絮凝、沉淀作用，廣泛應用于自來水生產、食品行業(yè)廢水處理等領域[17]。工藝使用PAM作沉淀劑，可確保毒性安全。貓豆水漿加熱至沸時，遇到MgCl2或熟石膏，水漿中的蛋白質可凝固成豆腐狀，但過濾性不佳，濾餅含水率高，L-dopa損失大，因此沒有進一步研究。

本工藝不產生黑、臭、高COD工業(yè)廢水，每生產1 kg L-dopa，僅產生10-20 L含HCl工藝廢水。試生產結果表明本工藝綠色環(huán)保，L-dopa產品得率可接受；沉淀濾渣可用于動物飼料或生產淀粉、蛋白質產品，貓豆資源可全部利用。濃縮工序的水蒸發(fā)量很大，將在后續(xù)研究中引進膜分離技術去除大部分水后再進行濃縮。此外，與貓豆同屬的蠶豆，其葉、花、幼果、成熟種子和根中的L-dopa含量均很高，尤以鮮葉(22.4 mg·g-1)為最[18]；作者后續(xù)研究將以葉、花、幼果和根為生產原料進行試驗，探究新工藝的通用性和可行性。

4 結論

本研究開發(fā)的新生產工藝解決了傳統(tǒng)工藝的黑、臭、高COD工業(yè)廢水污染問題，且產品得率和產品質量與傳統(tǒng)工藝相當，適合于工業(yè)化規(guī)模生產。