王瑋婷，殷雪琴，夏金娥，張夏炎 （海軍軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院藥劑科 上海 200433）

在全球范圍內(nèi)，乳腺癌是女性癌癥死亡的主要原因，2018 年約有210 萬女性疑似患有乳腺癌，占女性癌癥的25%[1]。在我國，乳腺癌在女性腫瘤中發(fā)病率居首位，死亡率居第5 位，近幾十年來乳腺癌負擔迅速增長[2]。目前，雌激素敏感的乳腺癌患者主要以內(nèi)分泌治療為主，然而，缺乏激素受體的乳腺癌細胞通常使用化療藥物，如紫杉醇和阿霉素[3]。但是，化療藥物對腫瘤細胞和正常細胞均表現(xiàn)出毒性反應，這限制了其臨床應用。此外，細胞毒等抗腫瘤藥物表現(xiàn)出的細胞耐藥性進一步限制其應用。因此，迫切需要尋找毒性較小、效果較好的治療藥物。

五味子乙素（schisandrin B, Sch B）是從五味子中提取的主要活性成分[4]。據(jù)報道[5]，Sch B 可通過抑制NF-κB 激活及MAPK/ Erk/p38/c-Jnk 信號通路激活而有效減輕炎癥反應，NASSER 等[6]發(fā)現(xiàn)，Sch B 可通過抑制PI3K/AKT 和STA3/JAK2 信號通路磷酸化，從而降低細胞內(nèi)ROS 的產(chǎn)生發(fā)揮抗前列腺癌作用，Wang 等[7]發(fā)現(xiàn)，Sch B 可通過TGF-b信號通路靶向miR-101-5p 抑制大鼠肝纖維化。Dai 等[8]發(fā)現(xiàn)，Sch B 可通過STAT3 的磷酸化和核轉(zhuǎn)位發(fā)揮抗乳腺癌活性，但是Sch B 如何影響乳腺癌細胞增殖凋亡能力及具體機制尚不清楚。本研究以Sch B 為研究對象，探討其對人乳腺癌MDAMB-231 細胞凋亡的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人乳腺癌細胞株MDA-MB-231(中科院細胞庫，目錄號：SCSP-5043)；甘草查爾酮A(純度≥98%，批號76296-75-6，上海麥克林生化科技有限公司)；CCK-8 試劑盒、Annexin V-FITC/PI 凋亡試劑盒、JC-1 熒光探針、DCFH-DA 熒光探針、Hoechst 33342 染色劑、PBS（大連美侖生物）；1640 培養(yǎng)基、胎牛血清( FBS) （美國HyClone 公司）；ECL 發(fā)光液、BCA 蛋白定量試劑盒(美國Thermo 公司)；Bcl-2、 Bax、 CHOP、 GPR78、 ATF4、 PERK、 p-PERK、p-eIF2α、eIF2α、β-actin、二抗(美國 Cell Signaling Technology 公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)與藥物處理

人乳腺癌細胞系MDA-MB-231 細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 μg/ml 鏈霉素及100 U/ml 青霉素的L-15 培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細胞2～3 d 可傳代培養(yǎng)。Sch B藥物處理時，首先取生長狀態(tài)良好的對數(shù)期細胞進行實驗，細胞分為對照組和藥物組，根據(jù)細胞存活率檢測結(jié)果計算IC50，藥物組分為Sch B 低劑量組劑量（1/2 倍IC50），Sch B 中劑量組（1 倍IC50），Sch B高劑量組（2 倍IC50）。

1.3 CCK-8 檢測細胞存活率

取狀態(tài)良好的對數(shù)期MDA-MB-231 細胞，以8×103/100 μl 細胞密度接種于96 孔板，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。將細胞分為空白組（含培養(yǎng)基，不含細胞）、對照組（含培養(yǎng)基，含細胞，不含藥物）和藥物處理組，藥物處理組分別以終濃度為1.25、2.5、5、10、20、40、80、160 μmol/L 的Sch B處理細胞24 h，每組3 個復孔。24 h 后每孔加入CCK-8 溶液(10 μl), 于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)1 h，用酶標儀在450 nm 處測定吸光度（OD）值，計算細胞存活率，并計算藥物IC50值。

細胞存活率=[(OD藥物-OD空白)/(OD對照-OD空白)]×100%

細胞克隆形成分析：取生長良好的對數(shù)期MDAMB-231 細胞，消化成單細胞懸液，以每孔3×103個細胞接種于6 孔板，輕輕搖動使細胞分散均勻，過夜貼壁。分為對照組和藥物組，對照組加等體積的培養(yǎng)基，藥物組分別加以終濃度為（10、20、40 μmol/L）Sch B 培養(yǎng)基，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d。然后用PBS清洗2 次，室溫下用4%多聚甲醛固定15 min，1%結(jié)晶紫染色10 min。顯微鏡觀察克隆形成情況，觀察3 個視野中克隆數(shù)量。

1.4 流式細胞術檢測細胞凋亡

將生長良好的對數(shù)期MDA-MB-231 細胞，以每孔2.5×105個/ml 細胞密度接種于6 孔板，置培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。待細胞貼壁后，分別將終濃度為10、20、40 μmol/L 的Sch B 處理24 h。用不含EDTA胰酶消化細胞，PBS 洗滌2 次，結(jié)合緩沖液（100 μl）重懸細胞，轉(zhuǎn)入流式管，然后再分別加入Annexin V-FITC（5 μl）和PI 染液（5 μl），室溫孵育15 min（避光），最后加入結(jié)合緩沖液（400 μl）混勻，流式儀上機檢測，F(xiàn)low Jo 軟件處理數(shù)據(jù)。

1.5 DCFH-DA 探針檢測細胞內(nèi)活性氧

將生長良好的對數(shù)期MDA-MB-231 細胞，以1×105個/ml 細胞密度接種于12 孔板，置培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。待細胞貼壁后，分別將終濃度為10、20、40 μmol/L 的Sch B 處理24 h。DCFH-DA 染液用PBS 1∶1 000 稀釋成工作液，每孔加入200 μl 工作液，37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育30 min，PBS 洗滌2 次，倒置熒光顯微鏡拍照，Image J 軟件檢測熒光強度。

1.6 Wester blot 法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激及凋亡相關蛋白表達

將生長良好的對數(shù)期MDA-MB-231 細胞，以2.5×105個/ml 細胞密度接種于6 孔板，于培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。待細胞貼壁后，將細胞依次分為對照組和藥物組，對照組細胞加等體積培養(yǎng)基，藥物組分別加終濃度為10、20、40 μmol/L 的Sch B 及加或者不加活性氧(ROS)清除劑（NAC）5 mmol/L, 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激抑制劑4-PBA 2 mmol/L 處理24 h。用RIPA（含PMSF 蛋白酶抑制劑）裂解液提取蛋白，BCA 法測定蛋白濃度，加入5×上樣緩沖液金屬?。?00 ℃）使蛋白變性。20 μg 蛋白樣品經(jīng)PAGE 凝膠電泳后轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，孵育一抗（4 ℃冰箱過夜），1×TBST 洗滌3 次，二抗室溫孵育2 h，采用ECL 顯影液顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍照，Image J 軟件分析。

1.7 統(tǒng)計處理

2 結(jié)果

2.1 五味子乙素對MDA-MB-231 細胞存活率的影響

圖1 結(jié)果顯示，與對照組比較，隨著藥物濃度增大，細胞存活率下降，其IC50為19.16 μmol/L，故選擇1/2 倍IC50（10 μmol/L），1 倍IC50（20 μmol/L），2 倍IC50（40 μmol/L）3 個劑量進行后續(xù)實驗。細胞克隆實驗結(jié)果顯示，隨著藥物濃度增大，細胞克隆形成顯著被抑制，且呈現(xiàn)劑量依賴關系，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

圖1 五味子乙素對MDA-MB-231 細胞存活增殖的影響

2.2 五味子乙素對MDA-MB-231 細胞凋亡的影響

流式細胞術檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，Sch B（10、20、40 μmol/L）均可誘導細胞凋亡，且呈劑量依賴，具有統(tǒng)計意義（P＜0.05）。Western blot 法檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，Sch B（10、20、40 μmol/L）使抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達顯著降低，促凋亡蛋白Bax 的表達顯著升高(P＜0.05)，結(jié)果見圖2。

圖2 五味子乙素對MDA-MB-231 細胞凋亡的影響

2.3 五味子乙素對MDA-MB-231 細胞內(nèi)活性氧（ROS）水平的影響

DCF-DA 染色結(jié)果顯示，與對照組比較，Sch B（10、20、40 μmol/L）組綠色熒光逐漸增強，顯示細胞內(nèi)ROS 水平增高，且呈劑量依賴，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，活性氧清除劑NAC（5 mmol/L）預處理2 h 可顯著抑制由Sch B 導致的細胞內(nèi)ROS 增多(P＜0.05)，結(jié)果見圖3。

圖3 五味子乙素對MDA-MB-231 細胞內(nèi)活性氧（ROS）水平的影響

2.4 五味子乙素對MDA-MB-231 細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的影響

異常內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激可引起細胞凋亡，Western blot法檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，Sch B（10、20、40 μmol/L）分別使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關蛋白CHOP，GPR78，p-eIF2α 表達增多且呈劑量依賴，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激抑制劑4-PBA（2 mmol/L）預處理2 h，可顯著抑制由Sch B 引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關蛋白CHOP、GPR78、p-eIF2α 表達降低(P＜0.05)，結(jié)果見圖4。

圖4 五味子乙素對MDA-MB-231 細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的影響

2.5 ROS 對MDA-MB-231 細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激及凋亡的影響

上述結(jié)果表明Sch B 可以使細胞內(nèi)ROS 升高，Sch B 也可以使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導細胞凋亡。為了驗證ROS 升高與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激之間的聯(lián)系，MDA-MB-231 用ROS 清除劑NAC（5 mmol/L）預處理2 h，結(jié)果顯示，NAC 可逆轉(zhuǎn)由Sch B 引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關蛋白CHOP，GPR78，p-eIF2α 顯著降低(P＜0.05)，進一步實驗證明， 5 mmol/L NAC可逆轉(zhuǎn)由Sch B 引起的細胞凋亡，使抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達顯著升高，促凋亡蛋白Bax 的表達顯著降低(P＜0.05)，結(jié)果見圖5。

圖5 ROS 對MDA-MB-231 細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激及凋亡的影響

3 討論

乳腺癌是臨床上特別常見的惡性腫瘤，每年的發(fā)病率和死亡率都在增加，其發(fā)生發(fā)展是一個復雜的病理過程，是不受控制的細胞增殖和抵抗凋亡的結(jié)果[9]。盡管癌癥研究領域取得了相當大的進展，但由于對化療耐藥和高復發(fā)率，乳腺癌的總體生存率仍然不令人滿意，因此，大量的研究都集中在發(fā)現(xiàn)新的有效的治療乳腺癌的候選藥物中[10]。從植物中提取的天然化合物具有更有效和更少的副作用被認為是抗癌藥物的重要來源。

ROS 在細胞存活和死亡中起著關鍵作用。在正常生理條件下，適當水平的ROS 有助于細胞存活。然而，過量的ROS 會導致細胞損傷和凋亡細胞死亡[11]。ROS 作為不良刺激之一，可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙，誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，稱為ROS 介導的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激[12]。在本研究中，MDA-MB-231 細胞在與Sch B 孵育前先經(jīng)ROS 清除劑NAC 預處理。凋亡減輕，ROS 生成減少，CHOP，GPR78 和p-eIF2a 表達下調(diào)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激減輕。這說明Sch B 誘導的MDA-MB-231 細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激依賴性凋亡中，ROS是不可或缺的。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細胞中傳導和提供蛋白質(zhì)折疊環(huán)境的細胞器，因為它對刺激的敏感性會導致某種情況發(fā)生成為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激被認為是應對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)失衡的各種細胞生物學生理和病理事件的一種高度保守的細胞防御機制，如抗癌藥物誘導的細胞凋亡通路[13]。GPR78 是調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的關鍵因子，GPR78 的激活增加了真核啟動子2 alpha (eIF2α) 51 位絲氨酸的磷酸化，從而抑制蛋白的合成，磷酸化的eIF2α 促進活化轉(zhuǎn)錄因子4(ATF4)和C/EBP 同源蛋白(CHOP) 的表達，CHOP是調(diào)節(jié)Bcl-2 家族蛋白表達的關鍵促凋亡轉(zhuǎn)錄因子[14]。我們發(fā)現(xiàn)，Sch B 可引起乳腺癌MDA-MB-231 細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，CHOP，GPR78 和 p-eIF2α 蛋白水平呈劑量依賴性增加，當使用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)抑制劑4-PBA 后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激減輕。

綜述所述，Sch B 可誘導乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡，其機制可能與增加細胞內(nèi)ROS 水平，使p-eIF2α 蛋白激活，GPR78 和CHOP 表達增多，引發(fā)細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激有關。本研究可為乳腺癌的輔助治療提供一定的實驗依據(jù)。