盧光照，張 翮，樊 莉，孫治國，魯 瑩 （海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系藥劑學(xué)教研室, 上海 200433）

腫瘤RNA 是目前已知腫瘤疫苗的來源之一[1-2]。先前的研究表明，從CT26 結(jié)腸癌細(xì)胞提取的腫瘤RNA 可以通過增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫來抑制腫瘤生長[3]，但由于腫瘤RNA 易降解、不穩(wěn)定等特性，需要載體對其包裹后實(shí)施注射，從而發(fā)揮其抗腫瘤作用[4]。研究證實(shí)，納米脂質(zhì)體載體具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，可有效地包裹RNA，并在體內(nèi)和體外遞送核酸，發(fā)揮核酸誘導(dǎo)或抑制細(xì)胞表達(dá)的作用[5-7]。然而，機(jī)體不同部位對藥物的吸收情況不同，因此，導(dǎo)致藥物吸收轉(zhuǎn)化的效果產(chǎn)生差異。為了比較不同部位注射對藥物治療效果的影響，本研究從CT26結(jié)腸癌細(xì)胞中提取腫瘤RNA，并使用納米脂質(zhì)體對其進(jìn)行包裹制備成納米脂質(zhì)體疫苗，分析了不同部位注射腫瘤RNA 納米脂質(zhì)體疫苗所產(chǎn)生的增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤反應(yīng)的情況。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器

R205B 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海申科科技有限公司）；610000-1EA 型薄膜擠出器（美國Avanti 公司）；必能信Sonifier?450D 超聲波粉碎儀（美國必能信公司）；馬爾文粒徑儀（英國馬爾文儀器公司）；透射電子顯微鏡 JEM2100F（日本JEOL 公司）；染色封片工作一體機(jī)（膠帶）Prisma+ Film（日本櫻花公司）。

1.1.2 主要試劑

(2,3-二油?；?丙基)-三甲胺硫酸鹽((N-1-(2, 3-dioleoyloxy) propyl)-N,N,N-trimethylammoniumethyl sulfate, DOTAP)（美國Avanti Polar Lipids 公司）；二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇-羧基(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(carboxy(polyethylene glycol)-2000) (sodium salt),DSPE-PEG(2000) Carboxylic Acid)（美國Avanti 公司）；魚精蛋白、小牛胸腺DNA（美國Sigma 公司）；膽固醇（上海麥克林生化科技有限公司）；氯仿（中國醫(yī)藥集團(tuán)有限公司）；DEPC 水（碧云天生物技術(shù)有限公司）；TRIzol RNA 分離試劑（美國Thermo 公司）；CT26 小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞系（中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫），SPF 級(jí) BALB/c 雄性小鼠（上海吉輝實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)有限公司），飼養(yǎng)于屏障系統(tǒng)中。

1.2 方法

1.2.1 薄膜水化法(lipid-film method)制備DOTAP/Chol 納米脂質(zhì)體

首先取膽固醇、DOTAP 兩種材料的氯仿溶液，將二者以1∶1 (m∶m)的比例加入到250 ml 的茄型瓶中，隨后再加入4 ml 氯仿溶液。在真空、45 ℃及100 r/min 條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)45 min，再加入3 ml DEPC 水，在45 ℃及100 r/min 條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)45 min，獲得脂質(zhì)體混懸液。先進(jìn)行超聲20 min，再先后通過聚碳酸酯膜（100、50 nm），反復(fù)擠出各20 次，即得DOTAP/Chol 納米脂質(zhì)體。

1.2.2 CT26 腫瘤細(xì)胞RNA 提取

取長滿培養(yǎng)皿的CT26 細(xì)胞，倒去培養(yǎng)基，加入3 ml 無菌PBS 溶液，并輕晃幾下進(jìn)行清洗，然后按照TRIzol? Reagent 操作說明提取RNA。提取完成后，將核酸溶液用NanoDrop 2000 測A值、濃度和純度。將檢測完成后的核酸溶液分裝至1.5 ml EP 管中，隨后放入液氮中保存。

1.2.3 腫瘤RNA 納米脂質(zhì)體疫苗的制備

準(zhǔn)備DOTAP/Chol 脂質(zhì)體疫苗63 μl，魚精蛋白12 μl（2 μg/μl）和DEPC 水10 μl，將上述材料混合，于室溫放置 10 min，得到DOTAP/Chol 脂質(zhì)體和魚精蛋白的混合物，在45～50 ℃的范圍內(nèi)水浴加熱1～2 min。準(zhǔn)備腫瘤RNA 45 μl(0.5 μg/μl)，小牛胸腺 DNA 1.2 μl(10 μg/μl)和DEPC 處理水30 μl，將以上材料混合，并室溫放置10 min，得到腫瘤RNA 與小牛胸腺DNA 的核酸聚合物，將DSPEPEG(2000) Carboxylic Acid 3.2 μl(10 μg/μl)加入到RNA/DNA 聚合物中，在45～50 ℃的范圍內(nèi)水浴加熱1～2 min，得到RNA/DNA/PEG 復(fù)合物。將納米脂質(zhì)體/魚精蛋白復(fù)合物加入到 RNA/DNA/PEG復(fù)合物中，常溫放置 10 min。最后將混合物放入55 ℃的環(huán)境中靜置10 min，然后在常溫環(huán)境中靜置 10 min，即可得腫瘤RNA 納米脂質(zhì)體疫苗。

1.2.4 馬爾文激光粒徑儀檢測

稀釋腫瘤RNA 納米脂質(zhì)體疫苗至適當(dāng)濃度，取1 ml 進(jìn)行粒徑檢測。選擇干凈的樣品池，取腫瘤RNA 納米脂質(zhì)體疫苗溶液小心加入，在加入的同時(shí)避免氣泡產(chǎn)生。把樣品池放入進(jìn)樣樣品槽中，然后進(jìn)行粒徑檢測。對于脂質(zhì)體放置穩(wěn)定性試驗(yàn)，將脂質(zhì)體放置于4 ℃，在第1、3、5、7 天取樣測量粒徑。

1.2.5 透射電鏡檢測

將10 μl 的脂質(zhì)體疫苗溶液緩慢滴加在銅網(wǎng)上，在室溫下徹底風(fēng)干。隨后滴加2%磷鎢酸溶液，并使用濾紙吸干多余液體，后在室溫下徹底干燥。之后將檢測銅網(wǎng)放置在透射電鏡下進(jìn)行觀察。

1.2.6 荷瘤小鼠模型的建立、給藥和分組

實(shí)驗(yàn)開始后，取對數(shù)生長期的CT26 細(xì)胞，計(jì)數(shù)為1×106/ml，在小鼠右側(cè)背部近腋窩處接種，每只小鼠皮下接種CT26 細(xì)胞100 μl（1×105個(gè)/只），構(gòu)建小鼠結(jié)腸癌移植瘤模型。接種1 周后按照實(shí)驗(yàn)方案接種相應(yīng)脂質(zhì)體疫苗溶液，頻率為每7 天一次，一共3 次。其中，PBS 組（n=5）的小鼠進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng)，每只小鼠腹腔注射200 μl 的 PBS 作為空白對照。腫瘤RNA 納米脂質(zhì)體疫苗腹腔注射組（n=5）的小鼠進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng)，每只小鼠腹腔注射200 μl 的腫瘤RNA 納米脂質(zhì)體疫苗，注射頻率為每7 天一次，共注射 3 次；腫瘤RNA 納米脂質(zhì)體疫苗皮下注射組（n=5）的小鼠進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng)，每只小鼠左側(cè)皮下注射200 μl 的腫瘤RNA 納米脂質(zhì)體疫苗，頻率為每7 天一次，共注射3 次；當(dāng)腫瘤體積達(dá)到2 000 mm3時(shí)處死小鼠，并提取實(shí)驗(yàn)小鼠各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行分析。

1.2.7 組織冰凍切片的制備

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將小鼠處死，之后將移植瘤腫瘤團(tuán)塊完全剝離，小心去除腫瘤周圍的結(jié)締組織和血管，使用PBS 浸泡清洗干凈后，使用干凈濾紙將水吸干，浸沒置于4%多聚甲醛中以4 ℃保持。同時(shí)，將各組實(shí)驗(yàn)小鼠處死后，將心、肝、脾、肺、腎完整剝離，去除結(jié)締組織和血管，使用PBS 浸泡清洗干凈后，使用干凈濾紙將水吸干，浸沒置于4%多聚甲醛中以4 ℃保持。將需要處理的組織塊放入合適的耐液氮的冰凍小盒中，將冰凍小盒緩緩放入液氮中，使其徹底浸沒在液氮中，浸沒約20 s左右，使組織塊能夠徹底冰凍成塊。組織塊冰凍成塊后，取出冰凍塊，快速使用已涂抹有冰凍包埋劑的塑料薄膜進(jìn)行包封，然后將已經(jīng)包封好的組織塊和切片凍頭放入冰箱進(jìn)行保存?zhèn)溆?，冰箱溫度設(shè)置為-80 ℃。按照冰凍切片機(jī)器操縱要求進(jìn)行冰凍切片，切片厚度控制在20～30 μm 左右，然后，將切片樣品放入-20 ℃的冰箱進(jìn)行保存。使用染色封片工作一體機(jī)（膠帶）Prisma+ Film，按照操作說明進(jìn)行染色及封片操作。使用數(shù)字切片掃描系統(tǒng)PRECICE 500 進(jìn)行圖像采集分析。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

2 結(jié)果

2.1 腫瘤RNA 納米脂質(zhì)體疫苗的表征

將從CT26 細(xì)胞中提取的RNA 使用NanoDrop 2000 進(jìn)行檢測，OD260/OD280 為2.04（圖1A），OD260/OD230 為1.96，符合RNA 需達(dá)到OD260/OD280＞2.0，1.8＜OD260/OD230＜2.2 的要求，且濃度達(dá)到1 762.1 ng/ml，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要。制備腫瘤RNA 納米脂質(zhì)體疫苗，通過馬爾文激光粒度測定儀對腫瘤RNA 納米脂質(zhì)體疫苗進(jìn)行了電位檢測，結(jié)果顯示其Zeta 電位為（3.39±0.56）mV（圖1B），可以降低脂質(zhì)體疫苗的聚合從而增加其穩(wěn)定性。通過透射電子顯微鏡檢測發(fā)現(xiàn)，我們制備的腫瘤RNA 納米脂質(zhì)體疫苗形態(tài)規(guī)則、呈球形、分布均勻，且粒徑大小為（120.0±12.1）nm (圖1C)。通過測量不同時(shí)間的脂質(zhì)體疫苗的粒徑大小，結(jié)果發(fā)現(xiàn)放置在4 ℃冰箱的脂質(zhì)體在7 d 內(nèi)粒徑基本維持在120 nm，脂質(zhì)體放置穩(wěn)定性良好（圖1D）。

圖1 腫瘤RNA 納米脂質(zhì)體疫苗的表征

2.2 腫瘤RNA 納米脂質(zhì)體疫苗不同途徑注射對小鼠結(jié)腸癌生長的影響

通過完整剝離各組織移植瘤，我們可以直觀看到，腹腔注射組比PBS 空白對照組、皮下注射組其腫瘤體積更小（圖2A）。同時(shí)，對各組移植瘤進(jìn)行稱重測量比較（P＜0.01，圖2B），腹腔注射組比PBS 組及皮下注射組平均移植瘤重量更小，腫瘤生長抑制更加明顯。由于結(jié)腸癌的大小與腫瘤微血管密度呈正相關(guān)性，通過對各組移植瘤H&E 染色（圖2C），發(fā)現(xiàn)與PBS 組相比，腹腔注射組和皮下注射組在同一視野下腫瘤微血管密度更小，其中，腹腔注射組微血管密度最小。

圖2 腫瘤RNA 納米脂質(zhì)體疫苗不同途徑注射對小鼠結(jié)腸癌生長的影響

2.3 腫瘤RNA 納米脂質(zhì)體疫苗不同部位注射對小鼠免疫情況影響

通過完整剝離各組脾臟，我們發(fā)現(xiàn)腹腔注射組小鼠的脾臟大于PBS 組和皮下注射組（圖3）。脾臟是機(jī)體重要的免疫器官，在機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)中，其大小在一定程度上反應(yīng)了機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)應(yīng)答強(qiáng)度和免疫水平。因此腹腔注射增強(qiáng)腫瘤RNA 的機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)的效果更加明顯。

圖3 腫瘤RNA 納米脂質(zhì)體疫苗不同部位注射對小鼠脾臟大小的影響（n=5）

2.4 腫瘤RNA 納米脂質(zhì)體疫苗對各臟器毒性影響的變化情況

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，完整剝離小鼠的心、肝、脾、肺、腎等主要臟器并進(jìn)行H&E 染色（圖4），結(jié)果顯示，各組的主要臟器中沒有出現(xiàn)異常的組織學(xué)改變，腫瘤RNA 對機(jī)體毒性影響很小，安全性較高。

圖4 腫瘤RNA 納米脂質(zhì)體疫苗注射后小鼠各臟器的H&E 染色（10×）

3 討論

根據(jù)2020 年全球統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)，1930 萬新增癌癥病例中，結(jié)腸直腸癌占10.0%，位居第三。在近1 000萬癌癥死亡相關(guān)病例中，結(jié)腸直腸癌占了9.4%，排在第二位[8]。同時(shí)，近10 年間，結(jié)直腸癌的發(fā)病率在我國呈直線上升趨勢。因此，我們迫切需要制訂新的策略以治療結(jié)直腸癌[9]。研究表明，腫瘤RNA攜帶有特異性腫瘤抗原，其腫瘤抗原無需檢查，并且RNA 序列進(jìn)入宿主基因組內(nèi)的危險(xiǎn)性很小，是優(yōu)質(zhì)的腫瘤疫苗來源。此外，有進(jìn)一步的研究證明，從CT26 結(jié)腸癌細(xì)胞提取的腫瘤RNA 可通過增強(qiáng)生物體抗腫瘤免疫來抑制結(jié)腸癌生長[1-3]。因此，不同部位注射負(fù)載腫瘤RNA 的納米脂質(zhì)體疫苗的抗腫瘤效果值得進(jìn)一步探討，為其后續(xù)的進(jìn)一步應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

納米脂質(zhì)體疫苗注射途徑種類較多，如靜脈注射、動(dòng)脈注射、肌內(nèi)注射、皮下注射、腹腔注射等方式[10-13]，研究證明，通過不同部位注射藥物，其生物利用度也不同。本研究對移植瘤小鼠進(jìn)行了不同部位腫瘤RNA 納米脂質(zhì)體疫苗注射，并分析比較不同部位注射所產(chǎn)生的影響，結(jié)果顯示，腹腔注射可以抑制腫瘤生長，值得注意的是，腹腔注射后的腫瘤更小、腫瘤微血管密度最低[14-15]，因此，腹腔注射抑制腫瘤生長的效果更加顯著。根據(jù)相關(guān)研究，如果藥物注射部位周圍血液循環(huán)及淋巴液循環(huán)豐富，那么藥物吸收路徑較短，較少受到各種影響因素的干擾，會(huì)表現(xiàn)出更好的治療效果，而腹腔中血液循環(huán)和淋巴循環(huán)分布較皮下更為豐富，因此腹腔注射表現(xiàn)出更好的治療效果[16-18]。

此外，在本研究中，負(fù)載腫瘤RNA 的納米脂質(zhì)體疫苗的形狀為球型體，粒徑大小為（120.0±12.1）nm，Zeta 電位為（3.39±0.36）mV。實(shí)驗(yàn)提示，腫瘤RNA納米脂質(zhì)體疫苗組能夠引起機(jī)體免疫器官脾臟增大[19]，并和治療效果呈正相關(guān)。同時(shí)在各治療組及對照組的實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，小鼠各個(gè)重要臟器未發(fā)生病理改變。所以腹腔注射是更適合腫瘤RNA 納米脂質(zhì)體疫苗藥物注射的途徑，這與腹腔血液循環(huán)和淋巴循環(huán)更加豐富有關(guān)，使納米級(jí)的腫瘤RNA 納米脂質(zhì)體疫苗能夠更好更高效地被機(jī)體自身吸收利用，進(jìn)而能夠更有效地增強(qiáng)機(jī)體自身抗腫瘤免疫反應(yīng)，并更有力地抑制腫瘤生長及發(fā)展。

綜上，本研究對同等大小移植瘤小鼠進(jìn)行了不同部位負(fù)載腫瘤RNA 的納米脂質(zhì)體疫苗注射的動(dòng)物治療實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相較于皮下注射，腹腔注射能夠更加有效地提高機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)并抑制腫瘤生長。