左 峰，霍 花，王治國，張國旭，石慶學，張宗鵬 （北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院：. 核醫(yī)學科, . 藥物臨床試驗機構(gòu)辦公室, 遼寧 沈陽 110840）

阿爾茨海默癥（Alzheimer's disease，AD）是常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病之一，是一種持續(xù)性神經(jīng)功能障礙，也是癡呆最常見的病因，其發(fā)生可導致進行性記憶減退、認知障礙、人格改變等癥狀。65 歲以上患病率約5%，85 歲以上患病率高于20%，是老年人死亡的主要原因之一[1-3]。AD 的病理特征主要是老年斑（senile plaques，SP）、神經(jīng)纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangles，NFTs）和廣泛神經(jīng)元缺失。tau 蛋白是一種微管相關(guān)蛋白，過度磷酸化tau 蛋白是造成神經(jīng)纖維纏結(jié)的主要原因，且AD 患者病情嚴重程度與tau 蛋白具有明顯相關(guān)性。因此，tau 蛋白顯像劑的研究逐漸受到關(guān)注[4-5]。

近年來，研究者們研發(fā)了多種tau 蛋白的PET 顯像劑，如“THK 系列”（包括18F-THK5105、18F-THK523、18F-THK5117、18F-THK5351）[6-8]，“RO 系列”（包括18FRO6958548、11C-RO6931643、11C-RO6924963）[9-11]，“T 系列”（包括18F-T807、18F-T808）[12]以及11CPBB3[13]等。其中“T 系列”18F-T807 和18F-T808 是由Simens 公司開發(fā)的tau 蛋白的分子探針。

課題組在參考相關(guān)文獻的基礎上[14-15]，使用GE 公司的TRACERlab FXFN氟多功能合成模塊（圖1），以18F-T807 前體（BOC 保護）NPPI-95（1）為原料，使用改進一鍋法自動合成了18F-T807（2），提高了產(chǎn)品產(chǎn)率，并開展初步的正常大鼠生物分布實驗，探索其分布特征。

圖1 18F-T807(2)的合成方程式

1 材料與合成過程

1.1 原料、試劑與設備

18F-T807 前體（BOC 保護）NPPI-95（江蘇華益公司）；強陰離子交換固相萃取柱（QMA 柱）、K222、碳酸鉀水溶液、乙腈、（德國ABX 公司）；乙醇（國藥化學試劑）；鹽酸（國藥分析質(zhì)檢中心）；DMSO（北京百靈威）；Ultimate C18柱（美國Waters:4.6 mm×250 mm，5 μm）；富18O 水（日本大陽日酸株式會社）；0.22 μm MILLEX-GS 液體濾膜、0.2 μm Millex-25 空氣濾膜（德國默克）；0.7 mm×40 mm 針頭（西班牙BD Microlance）；Wistar 大鼠（北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院實驗動物科）。溶劑乙醇為色譜純，其余均為分析純。

TRACERlab FXFN（美國GE）配備半制備VP 250×16 高效液相色譜（德國MN）和紫外檢測器及放射性檢測器；正電子示蹤劑質(zhì)量控制薄層掃描儀（美國Bioscan），配塑料閃爍體晶體探測器；分析用HPLC（北京優(yōu)聯(lián)）；GC-7900 氣相色譜(北京天美)；CRC 25R 活度計（美國Capintec），合成條件滿足藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GMP）的要求。

1.2 合成方法

合成開始前，合成器各溶劑瓶預裝溶劑如表1和圖2 所示。

圖2 TRACERLAB FXFN 合成器示意圖

表1 TRACERlab FXFN 合成器各溶劑瓶預裝溶劑

18F-T807 自動化合成主要有以下幾步：①18F-離子的柱分離純化及蒸餾干燥。②T807 前體的18F-離子親核取代反應。③18F-T807 的HPLC 分離純化。④18F-T807 C18柱溶劑轉(zhuǎn)換與再純化。

自動合成的具體步驟如下：

(1)共2.5 ml 含18F-離子的18O 水由MINItrace加速器經(jīng)由18O（p, n）18F 反應制備，轟擊束流45μA，轟擊時間40 min，18F-離子混合液由氦氣作為載氣經(jīng)過TARGET 管線傳輸?shù)絋RACERlab FXFN合成模塊的錐形瓶內(nèi)。

(2)V10、V11 號閥門開啟，18F-離子及18O 水混合液中的18F-離子在真空泵抽取下被QMA 柱（由1 ml乙醇，2 ml 水活化）捕獲滯留，18O 水回收進入18O 水回收瓶。

(3)V1、V13、V24 號閥門開啟，V1 號瓶內(nèi)的K2CO3溶液流經(jīng)V1、V10、QMA 柱、V11、V13，將18F-離子交換抽入反應瓶。

(4)關(guān)V1、V13 號閥門，開啟V2 號閥門將V2 號瓶內(nèi)穴醚K222 乙腈溶劑抽入反應管，18F-離子進入穴醚形成復合物。

(5)關(guān)V2 號閥門，開啟V20 號閥門混合液在氦氣吹拂下于85 ℃共沸蒸餾8 min，然后加熱到110 ℃，在氦氣吹拂下共沸蒸餾4 min 除水。

(6)開啟V3、V19 號閥門，在氦氣推動下V3 號瓶內(nèi)的前體流入反應管，V3、V19、V24 號閥門關(guān)閉，反應管加熱到140 ℃，反應10 min。

(7)反應瓶降溫到50 ℃，開V24、V25 號閥門恢復大氣壓。

(8)反應后混合液經(jīng)由V5、V6 號瓶內(nèi)的共3 ml HPLC 流動相（25%乙醇水溶液，調(diào)整pH 至2.0）沖洗到V26 號閥門下的中轉(zhuǎn)瓶內(nèi)，然后打開V26、V12 號閥門，在氦氣壓力下經(jīng)由Fluid 進入HPLC進樣環(huán)，在Fluid 控制下進樣環(huán)旋轉(zhuǎn)，產(chǎn)物進入HPLC 半制備柱，Eluent1 號瓶內(nèi)流動相以5 ml/min的流速通過柱子分離。流動相以紫外（UV，λ=254 nm）和放射計數(shù)器監(jiān)測。圖3 是18F-T807 的HPLC 及UV 圖。

圖3 18F-T807 放射性HPLC(A)及UV(B)分離圖(峰2 為產(chǎn)物峰)

(9)18F-T807 溶液通過V18 號閥門進入圓底瓶，圓底瓶內(nèi)裝有2 ml 84% NaHCO3水溶液和30 ml無菌注射用水。然后經(jīng)V21、V15、V17 號閥門，產(chǎn)物溶液通過V15、V17 號閥門間的C18柱（以5 ml乙醇和10 ml 水活化），產(chǎn)物會被捕獲滯留在柱子上，然后打開V9 閥門，用V9 號瓶內(nèi)10 ml 水沖洗柱子到廢液瓶（WASTE）內(nèi)，然后C18柱經(jīng)由V8 號瓶內(nèi)的1 ml 乙醇沖洗進入V15 閥門下的產(chǎn)品瓶，再經(jīng)由V7 號瓶內(nèi)裝有9 ml 生理鹽水再次沖洗。

(10)手動打開V22 和V16 號閥門，18F-T807 在氦氣壓力下經(jīng)過0.22μm 液體濾膜過濾進入分裝熱室的收集瓶。

1.3 質(zhì)量控制

對3 批連續(xù)生產(chǎn)的產(chǎn)物進行了質(zhì)量控制。質(zhì)控項目包括澄明度、pH、核素半衰期、核素純度、放化純度、K222 和殘留溶劑、細菌內(nèi)毒素、無菌測試，測試結(jié)果均符合標準要求。

1.4 正常大鼠生物分布實驗

選擇健康雄性Wistar 大鼠30 只，分為6 組，每組5 只，實驗前6 h 禁食禁水，每只通過尾靜脈注入0.2 ml(約7.4 MBq)的18F-T807 后，分別在5、15、30、60、90、120 min 斷頭處死，取出腦、心、肝、肺、腎、肌肉、骨和血，去污、稱重、計數(shù)，數(shù)據(jù)經(jīng)衰減校正后計算放射性攝取率（每克組織的放射性攝取劑量占注射劑量的百分比）。

2 結(jié)果與討論

18F-T807 有多種合成方法，本文在參考相關(guān)文獻報道基礎上，優(yōu)化反應條件，改變前體用量為1 mg，同時使用HPLC 分離條件為25%乙醇水溶液， pH 調(diào)整至2.0，在線脫BOC 保護。C18柱溶劑轉(zhuǎn)換與再純化，應用經(jīng)改進的合成方法使合成產(chǎn)率由(20.5±6.1)%提高到(25.7±5.8)%，總反應時間為70 min。

連續(xù)3 批產(chǎn)品，其質(zhì)量控制結(jié)果如下：肉眼觀察溶液無色透明，6 h 后pH 值為7，半衰期滿足要求，不包含長半衰期核素（t1/2＞5 天），核素純度大于99.5%，HPLC 和TLC 分析結(jié)果，即化學純度和放化純度合格，流動相是50%甲醇/水（HCl 調(diào)節(jié)pH至2，），流速1.3 ml/min，紫外檢測波長為254 nm，TLC 條件為NH3H2O-甲醇-CH2Cl2(1∶5∶94），氣相色譜結(jié)果顯示殘留的丙酮、乙腈、DMSO 等溶劑均在檢測線下，細菌內(nèi)毒素實驗（鱟試劑法）合格，無菌檢查合格。各項結(jié)果表明產(chǎn)品符合人體使用標準。

正常大鼠18F-T807 在體內(nèi)的生物分布如表2所示，可見大部分器官在給藥5 min 后攝取率最高，其中腎、肝、血的攝取率較高，超過5.56%ID/g(%ID/g 為放射性攝取率，即各器官的每克放射性攝取值)，在肌肉、骨骼攝取率相對較低，因此推斷18F-T807 主要是經(jīng)過肝腎排出體外。18F-T807 的腦、心、肺攝取率最低，120 min 已降低至本底水平（1.08% ID/g），各器官的放射性攝取率隨時間的推移逐漸降低，但清除較慢，在120 min 時大部分器官仍有較高的攝取率。

表2 18F-T807 在正常大鼠體內(nèi)的分布（±s，n=5）

表2 18F-T807 在正常大鼠體內(nèi)的分布（±s，n=5）

放射性攝取率（% ID/g）5 min15 min30 min60 min90 min 120 min腦 2.25±0.18 2.03±0.86 1.81±0.54 1.59±0.62 1.20±0.57 1.11±0.38心 2.05±0.58 1.99±0.66 1.78±0.31 1.55±0.25 1.19±0.74 1.08±0.36肝 5.79±2.58 5.95±1.17 5.48±0.66 5.29±0.71 4.83±0.84 4.27±0.86肺 2.12±0.91 2.01±0.56 1.91±0.19 1.57±0.73 1.21±0.52 1.09±0.23腎 7.36±4.01 5.11±1.21 3.89±1.99 3.63±1.82 3.17±1.68 2.99±0.98肌肉2.34±0.86 2.57±1.18 2.44±0.95 2.19±1.36 2.04±1.03 1.51±0.89骨 2.58±0.91 2.67±0.75 2.02±0.68 1.99±0.82 1.52±0.46 1.27±0.55血 5.56±0.35 5.41±0.56 4.73±0.74 4.57±1.31 4.22±0.37 4.01±0.45器官

3 結(jié)論

在TRACERlab FXFN合成器上使用優(yōu)化條件的一鍋法自動合成了18F-T807，提高了產(chǎn)品產(chǎn)率。合成后進行的各種質(zhì)量控制檢測均顯示產(chǎn)品符合質(zhì)控標準。初步的正常大鼠生物分布實驗，顯示了其不同時間放射性攝取率的分布情況，為應用該產(chǎn)品開展人體顯像提供了重要基礎。