王 芳 李寶海 李 吉 葉 巍 馬濟(jì)遠(yuǎn) 蘇靜波 周 健

高血糖是導(dǎo)致糖尿病性白內(nèi)障(DC)的主要危險(xiǎn)因素[1-2]。長(zhǎng)期的高血糖通過(guò)引起晶狀體上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激、滲透壓應(yīng)激以及非酶糖基化等改變導(dǎo)致晶狀體混濁[1]。近年的研究表明，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)與DC發(fā)病密切相關(guān)[3]，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)的異常變化是觸發(fā)晶狀體上皮細(xì)胞發(fā)生EMT的重要因素，本課題組在糖尿病小鼠晶狀體中發(fā)現(xiàn)晶狀體上皮細(xì)胞發(fā)生EMT與ERS有關(guān)[4]?；钚匝?ROS)介導(dǎo)的氧化應(yīng)激參與包括EMT在內(nèi)的眾多病理生理學(xué)過(guò)程[5-6]，而ERS又可通過(guò)提高細(xì)胞內(nèi)ROS水平參與調(diào)節(jié)EMT[7]。4-苯基丁酸 (4-PBA) 是一種相對(duì)分子質(zhì)量較小的脂肪酸[8]，作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶，可減輕非折疊蛋白反應(yīng)(UPR)，進(jìn)而降低ERS水平[9-10]。本研究通過(guò)觀察4-PBA對(duì)高濃度葡萄糖(簡(jiǎn)稱(chēng)高糖)刺激人晶狀體上皮細(xì)胞系HLE-B3細(xì)胞發(fā)生EMT的影響，進(jìn)一步探討ERS誘導(dǎo)EMT的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料人晶狀體上皮細(xì)胞系HLE-B3細(xì)胞為北京眼科研究所張煒研究員惠贈(zèng)；DMEM低及高濃度葡萄糖(葡萄糖濃度為5.5 mmol·L-1、30.0 mmol·L-1)培養(yǎng)基、胎牛血清、2.5 g·L-1胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；ROS檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒、SDS-PAGE配膠、RIPA裂解液、β-actin抗體以及GAPDH抗體均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；GRP78、CHOP以及p-eIF2α均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；eIF2α、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體以及HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司； E-cadherin、α-SMA以及Snail均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；山羊抗兔熒光二抗購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 HLE-B3細(xì)胞的培養(yǎng)及處理HLE-B3細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM低濃度葡萄糖培養(yǎng)基中，置于含體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、融合度70%～80%的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。用含體積分?jǐn)?shù)0.5%胎牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)孵育24 h，使細(xì)胞周期同步化。

將培養(yǎng)的HLE-B3細(xì)胞分為正常對(duì)照組、高糖組、4-PBA預(yù)處理+高糖組。正常對(duì)照組：細(xì)胞用含5.5 mmol ·L-1葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h；高糖組：細(xì)胞用上述DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)后再用30.0 mmol·L-1葡萄糖處理6 h；4-PBA預(yù)處理+高糖組：正常培養(yǎng)的細(xì)胞用1 mmol·L-14-PBA先處理1 h，然后用添加含30.0 mmol ·L-1葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h。各組細(xì)胞處理6 h后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。

1.2.2 各組HLE-B3細(xì)胞的形態(tài)觀察將HLE-B3細(xì)胞以每孔10×103個(gè)的密度接種于特定共聚焦皿中，待細(xì)胞融合度70%～80%時(shí)，更換為含體積分?jǐn)?shù)0.5%胎牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)孵育24 h，使細(xì)胞周期同步化，按上述分組分別處理細(xì)胞6 h，在倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)ROS含量采用DCFH-DA法檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)ROS的含量。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按上述分組進(jìn)行處理，培養(yǎng)6 h后換含10 μmol·L-1DCFH-DA的無(wú)血清培養(yǎng)基置于 37 ℃培養(yǎng)箱中孵育細(xì)胞20 min，用溫PBS清洗細(xì)胞1次，2.5 g·L-1胰蛋白酶消化細(xì)胞，終止消化后制成細(xì)胞懸液。分別收集于15 mL離心管中，經(jīng)1000 r·min-1離心5 min，棄上清液，再用1 mL溫PBS重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至EP管中，再次經(jīng)1000 r·min-1離心5 min，收集細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度(FITC-A)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞中不同因子的相對(duì)表達(dá)量取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HLE-B3細(xì)胞按上述分組進(jìn)行處理6 h，收集細(xì)胞，按照試劑盒說(shuō)明分別提取各組細(xì)胞總RNA。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)提取的mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。其中，E-cadherin上游引物：5’-CGAGAGCTACACGTTCACGG-3’，下游引物：5’-GGGTGTCGAGGGAAAAATAGG-3’；α-SMA上游引物：5’-GGGAATGGGACAAAAAGACA-3’，下游引物：5’-CTTCAGGGGCAACACGAA-3’；Snail上游引物：5’-CCCCAATCGGAAGCCTAACT-3’，下游引物：5’-GCTGGAAGGTAAACTCTGGATTAGA-3’。 PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共45個(gè)循環(huán)。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次，以GAPDH為內(nèi)參，采用 2-ΔΔCt計(jì)算各組細(xì)胞中不同目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 Western blot 檢測(cè)各組細(xì)胞中不同目標(biāo)蛋白的表達(dá)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HLE-B3細(xì)胞，按上述分組進(jìn)行處理6 h，收集細(xì)胞，用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，用BCA 法檢測(cè)蛋白濃度，-80 ℃保存?zhèn)溆?。?0 μg樣品，行SDS-PAGE電泳分離蛋白，采用50 g·L-1濃縮膠和100 g·L-1分離膠，電轉(zhuǎn)印法將電泳條帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜。將PVDF膜按照目標(biāo)蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)行裁剪，在室溫下用封閉液室溫封閉PVDF膜2 h，分別加入與目標(biāo)蛋白相應(yīng)的特異性一抗(稀釋度均為1500)，4 ℃過(guò)夜，用含Tween20的PBS漂洗PVDF膜3次，每次5 min。再使用相應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗(稀釋度均為13000)，37 ℃孵育1 h。用ECL化學(xué)發(fā)光法使蛋白條帶顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并測(cè)量蛋白條帶的灰度值，以β-actin或GAPDH蛋白條帶作為內(nèi)參。實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次，取平均值。目標(biāo)蛋白表達(dá)量的相對(duì)灰度值為目標(biāo)蛋白灰度值/β-actin(GAPDH)灰度值。

1.2.6 免疫熒光染色觀察各組細(xì)胞中E-cadherin和α-SMA的表達(dá)將細(xì)胞接種于特定共聚焦皿中，當(dāng)細(xì)胞融合度70%～80%時(shí)，按上述分組處理細(xì)胞6 h，用40 g·L-1多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，用PBS洗5 min×3次，用體積分?jǐn)?shù)1%BSA、1%TritonX-100室溫封閉30 min。分別用兔抗人E-cadherin(1100)和兔抗人α-SMA(1100)孵育細(xì)胞，在4 ℃濕盒中過(guò)夜；用PBS洗10 min×3次，在室溫下避光、用山羊抗兔(1200)二抗孵育2 h，經(jīng)PBS洗10 min×3次后，用DAPI染細(xì)胞核15 min，再用甘油封片。在激光共聚焦顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GraphPad Prism7.0數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，組間兩兩比較方差齊時(shí)用Tukey 法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化HLE-B3細(xì)胞分別經(jīng)過(guò)正常、高糖、4-PBA預(yù)處理后高糖再處理6 h后發(fā)現(xiàn)，正常對(duì)照組HLE-B3細(xì)胞呈多邊形貼壁生長(zhǎng)，邊界清晰；高糖組HLE-B3細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形改變，丟失上皮細(xì)胞特性，類(lèi)似纖維細(xì)胞的表型；4-PBA預(yù)處理+高糖組HLE-B3細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，與高糖組相比，長(zhǎng)梭形細(xì)胞數(shù)量較少(圖1)。

2.2 各組HLE-B3細(xì)胞中ROS含量的變化流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組HLE-B3細(xì)胞中ROS熒光強(qiáng)度發(fā)現(xiàn)，正常對(duì)照組93.2%的細(xì)胞、高糖組99.7%的細(xì)胞和4-PBA 預(yù)處理+高糖組99.8%的細(xì)胞的相對(duì)熒光強(qiáng)度分別為(9.30±1.07)%、(68.63±1.68)%和(22.13±0.82)%，組間比較總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=628.00，P<0.01)。與正常對(duì)照組和4-PBA預(yù)處理+高糖組相比，高糖組HLE-B3細(xì)胞相對(duì)熒光強(qiáng)度明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=29.76、24.81，均為P<0.01)；4-PBA預(yù)處理+高糖組HLE-B3細(xì)胞相對(duì)熒光強(qiáng)度稍高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t=9.501，P<0.01)。

2.3 ERS信號(hào)通路相關(guān)分子的蛋白表達(dá)變化Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，高糖組HLE-B3細(xì)胞中ERS信號(hào)通路相關(guān)分子GRP78、CHOP以及p-eIF2α蛋白的相對(duì)表達(dá)量均比正常對(duì)照組增高(均為P<0.05)，提示高糖激活細(xì)胞的ERS通路；與高糖組相比，4-PBA預(yù)處理+高糖組細(xì)胞中GRP78、CHOP及p-eIF2α的蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著降低(均為P<0.05)，而與正常對(duì)照組相比，GRP78、CHOP及p-eIF2α的蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯增高(均為P<0.05)(圖2、表1)。

2.4 EMT標(biāo)志分子的表達(dá)變化

2.4.1 各組細(xì)胞中實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明，高糖組HLB-E3細(xì)胞中E-cadherin mRNA相對(duì)表達(dá)水平較正常對(duì)照組明顯降低(P<0.05)，4-PBA預(yù)處理+高糖組HLB-E3細(xì)胞中E-cadherin mRNA相對(duì)表達(dá)水平較高糖組明顯增高(P<0.05)，但仍比正常對(duì)照組低(P<0.05)。高糖組HLB-E3細(xì)胞中α-SMA mRNA相對(duì)表達(dá)水平較正常對(duì)照組明顯升高(P<0.05)；4-PBA 預(yù)處理+高糖組HLE-B3細(xì)胞中α-SMA mRNA相對(duì)表達(dá)水平較高糖組降低(P<0.05)，同時(shí)也低于正常對(duì)照組(P<0.05)。 高糖組HLE-B3細(xì)胞中Snail mRNA相對(duì)表達(dá)水平較正常對(duì)照組明顯升高(P<0.05)，4-PBA預(yù)處理+高糖組HLE-B3細(xì)胞中Snail mRNA相對(duì)表達(dá)水平較高糖組降低(P<0.05)，但仍高于正常對(duì)照組(P<0.05)(表2)。

2.4.2 各組細(xì)胞中E-cadherin、α-SMA和Snail的蛋白表達(dá)Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，各組HLE-B3細(xì)胞中E-cadherin、α-SMA和Snail的蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=21.93、121.20、50.96；均為P<0.05)(圖3)。高糖組細(xì)胞中E-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著低于正常對(duì)照組(P<0.05)；4-PBA預(yù)處理+高糖組細(xì)胞中E-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)量較高糖組增高(P<0.05)，但仍低于正常對(duì)照組(P<0.05)。高糖組細(xì)胞中α-SMA 蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05)，4-PBA預(yù)處理+高糖組細(xì)胞中α-SMA蛋白相對(duì)表達(dá)量較高糖組明顯降低(P<0.05)，也低于正常對(duì)照組(P<0.05)。高糖組細(xì)胞中Snail蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05)，4-PBA預(yù)處理+高糖組細(xì)胞中Snail蛋白相對(duì)表達(dá)量較高糖組明顯降低(P<0.05)，但高于正常對(duì)照組(P<0.05)(表3)。

2.4.3 各組細(xì)胞中E-cadherin、α-SMA蛋白免疫熒光染色結(jié)果免疫熒光染色結(jié)果顯示，E-cadherin蛋白在正常對(duì)照組HLE-B3細(xì)胞中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，為強(qiáng)綠色熒光；高糖組HLE-B3細(xì)胞中E-cadherin熒光弱于正常對(duì)照組，4-PBA 預(yù)處理+高糖組HLE-E3細(xì)胞中E-cadherin熒光增強(qiáng)。正常對(duì)照組細(xì)胞中α-SMA蛋白呈弱陽(yáng)性表達(dá)；高糖組細(xì)胞中α-SMA蛋白表達(dá)量明顯高于正常對(duì)照組，為強(qiáng)紅色熒光，4-PBA 預(yù)處理+高糖組細(xì)胞中α-SMA熒光減弱(圖4)。

3 討論

當(dāng)機(jī)體受到各種外源性或內(nèi)源性刺激，如氧化應(yīng)激、缺血缺氧、鈣平衡失調(diào)等因素的影響時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)環(huán)境被破壞，蛋白質(zhì)將無(wú)法進(jìn)行正確的修飾和折疊,造成未折疊和錯(cuò)誤折疊的蛋白分子大量堆積在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，當(dāng)這些錯(cuò)誤折疊的蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)大量聚集超出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處理的能力時(shí)就會(huì)啟動(dòng)ERS[11-12]。高血糖是引起各器官損害的重要因素。有研究發(fā)現(xiàn)，高糖引起體外培養(yǎng)的晶狀體上皮細(xì)胞、糖尿病小鼠晶狀體上皮細(xì)胞中ERS通路相關(guān)分子GRP78、CHOP表達(dá)均增高，表明高糖誘導(dǎo)了ERS的發(fā)生[4,13]。

上皮細(xì)胞發(fā)生EMT是組織器官發(fā)生纖維化的重要病理基礎(chǔ)。近年來(lái)研究表明，ERS和未折疊蛋白反應(yīng)與器官纖維化相關(guān)[14-15],提示ERS與EMT也可能有密切聯(lián)系。為驗(yàn)證ERS在高糖引起的晶狀體上皮細(xì)胞發(fā)生EMT中的重要作用，本研究使用化學(xué)分子伴侶4-PBA調(diào)節(jié)HLE-B3細(xì)胞ERS反應(yīng)強(qiáng)度，觀察高糖誘導(dǎo)的晶狀體上皮細(xì)胞發(fā)生EMT的變化。4-PBA是目前最常用的ERS抑制劑，其作用原理是通過(guò)增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊蛋白的能力和穩(wěn)定未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白的構(gòu)象以促進(jìn)其轉(zhuǎn)運(yùn)，從而達(dá)到減輕ERS反應(yīng)強(qiáng)度的目的[8，16-17]。 Baek等[18]用4-PBA預(yù)處理TGF-β1誘導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞，結(jié)果顯示細(xì)胞的ERS反應(yīng)強(qiáng)度降低，同時(shí)TGF-β1誘導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞中α-SMA、ColⅠ蛋白表達(dá)均下調(diào)，提示4-PBA通過(guò)抑制ERS反應(yīng)起到減輕細(xì)胞發(fā)生EMT的作用。

GRP78是ERS的一個(gè)經(jīng)典標(biāo)志物之一，作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的伴侶蛋白，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)。當(dāng)ERS顯著激活時(shí)，GRP78蛋白與PERK蛋白解離，PERK蛋白磷酸化活性增強(qiáng)，激活下游eIF2α的磷酸化，增加CHOP的表達(dá)，引起細(xì)胞損傷[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，4-PBA預(yù)處理+高糖組HLE-B3細(xì)胞中GRP78、CHOP以及p-eIF2α蛋白相對(duì)表達(dá)水平均較高糖組顯著降低，但仍顯著高于對(duì)照組，提示4-PBA可部分抑制高糖誘導(dǎo)的HLE-B3細(xì)胞ERS，這可能與4-PBA的刺激濃度較低或作用時(shí)間較短有關(guān)。值得注意的是，4-PBA抑制ERS時(shí)，高糖引起的細(xì)胞內(nèi)ROS含量明顯減輕?；诖?，我們認(rèn)為高糖激活細(xì)胞ERS使細(xì)胞內(nèi)ROS含量增高并參與調(diào)節(jié)晶狀體上皮細(xì)胞發(fā)生EMT。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)， 4-PBA預(yù)處理+高糖組HLE-B3細(xì)胞E-cadherin的表達(dá)上調(diào)，α-SMA和Snail的表達(dá)下調(diào)。誘導(dǎo)EMT發(fā)生的重要信號(hào)是核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子Snail并使其表達(dá)上調(diào)，而Snail又能抑制上皮表型并激活間質(zhì)表型表達(dá)所需要的轉(zhuǎn)錄基因[20-21]。因此，本研究結(jié)果提示，4-PBA通過(guò)下調(diào)ERS反應(yīng)強(qiáng)度可有效抑制高糖誘導(dǎo)的晶狀體上皮細(xì)胞發(fā)生EMT，反向證實(shí)了ERS參與高糖導(dǎo)致晶狀體上皮細(xì)胞發(fā)生EMT的過(guò)程。

綜上所述，本研究證實(shí)了ERS參與高糖誘導(dǎo)的晶狀體上皮細(xì)胞發(fā)生EMT的過(guò)程，4-PBA可通過(guò)抑制ERS、減少ROS含量、抑制高糖誘導(dǎo)的晶狀體上皮細(xì)胞發(fā)生EMT，從而對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞起到保護(hù)作用，這為尋求治療DC的有效藥物提供了一定的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。