張 濤 張開(kāi)能 柯昌興

2020年全球膀胱癌新發(fā)人數(shù)超過(guò)57萬(wàn)，約占新發(fā)腫瘤人數(shù)的3.0%，死亡人數(shù)超過(guò)21萬(wàn)，占比為2.1%[1]。淋巴轉(zhuǎn)移是膀胱癌最常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移途徑，且最常轉(zhuǎn)移至盆腔淋巴結(jié)。合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時(shí)，患者5年生存率可明顯減低至25%～35%[2]?；颊呓邮苁中g(shù)治療可在一定程度改善預(yù)后，但患者術(shù)后5年生存率仍較低，細(xì)胞培養(yǎng)在了解膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用，其中三維細(xì)胞培養(yǎng)能較好地模擬腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的真實(shí)情況。

一、三維細(xì)胞培養(yǎng)與腫瘤

細(xì)胞培養(yǎng)是藥物發(fā)現(xiàn)、腫瘤研究及干細(xì)胞研究中重要且必要的過(guò)程，該技術(shù)在研究腫瘤生物學(xué)行為和分子調(diào)控行為中具有重要的作用[3]。既往研究表明，二維細(xì)胞培養(yǎng)模式是培養(yǎng)細(xì)胞的主要方法，在研究中起著至關(guān)重要的作用，但由于二維細(xì)胞培養(yǎng)模式在體外不能準(zhǔn)確地代表組織細(xì)胞及不能較好地模擬腫瘤微環(huán)境，存在較多的局限性[4]。三維細(xì)胞培養(yǎng)在更好地模擬并復(fù)制體內(nèi)細(xì)胞生物學(xué)中展示出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)(如增加腫瘤細(xì)胞和微環(huán)境之間的相互作用)。近年來(lái)，三維細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)展迅猛，其關(guān)鍵目標(biāo)之一是再現(xiàn)人體細(xì)胞的空間組織結(jié)構(gòu)和功能。在進(jìn)行三維細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，可以對(duì)細(xì)胞環(huán)境進(jìn)行調(diào)控，從而模擬體內(nèi)的細(xì)胞環(huán)境。與此同時(shí)，三維培養(yǎng)能很好地模擬腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的真實(shí)情況，對(duì)于研究腫瘤微環(huán)境、腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為及抗腫瘤藥物篩選等方面具有重要意義[5,6]。因此，三維細(xì)胞培養(yǎng)有望最終彌補(bǔ)二維細(xì)胞培養(yǎng)模型與動(dòng)物模型之間的差距。

二、三維細(xì)胞培養(yǎng)與膀胱癌腫瘤微環(huán)境

從膀胱癌發(fā)生到開(kāi)始轉(zhuǎn)移的過(guò)程中，腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment，TME)起著至關(guān)重要的作用，TME由腫瘤細(xì)胞與周圍環(huán)境基質(zhì)成分之間密切的相互作用形成，復(fù)雜多變，其復(fù)雜性在于腫瘤和基質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用，而兩者間的相互作用可通過(guò)各種機(jī)制參與膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展和免疫抑制等過(guò)程[7,8]。然而，在開(kāi)發(fā)體外模型時(shí)，典型腫瘤微環(huán)境的成分往往被忽視。腫瘤微環(huán)境的細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞或與癌癥相關(guān)的成纖維細(xì)胞等)參與腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移，其中炎性細(xì)胞通過(guò)多因素協(xié)同作用形成了TME中免疫調(diào)節(jié)的特有方式，使得腫瘤細(xì)胞能逃逸免疫監(jiān)視，進(jìn)而發(fā)生轉(zhuǎn)移。常規(guī)的二維細(xì)胞模型受限于單層形態(tài)，無(wú)法重現(xiàn)體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的特性及復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境，并且細(xì)胞與細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)之間的信號(hào)傳遞大大衰減，導(dǎo)致無(wú)法提供確切有效的信號(hào)信息[9,10]。

非細(xì)胞成分包括細(xì)胞外基質(zhì)(如膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分，并以多種形式存在)和各種細(xì)胞因子(如生長(zhǎng)因子、干擾素、腫瘤壞死因子等)，在腫瘤血管的生成、細(xì)胞增殖、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等方面也起著重要的作用。通過(guò)建立體外膀胱癌研究模型，可用于觀察其發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及耐藥機(jī)制，為膀胱癌的治療找到新的治療方法及靶點(diǎn)。與此同時(shí)，三維培養(yǎng)系統(tǒng)還可與多種基質(zhì)和細(xì)胞成分結(jié)合，許多不同類型的細(xì)胞(如腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞等)可以整合在三維培養(yǎng)模型中，產(chǎn)生的共培養(yǎng)能夠進(jìn)一步闡明腫瘤細(xì)胞與其他類型細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)之間的信號(hào)傳遞。因此建立三維細(xì)胞共培養(yǎng)模型是研究TME的有效手段，其較好地模擬了體內(nèi)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境，能更好地模擬體內(nèi)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為。研究表明，三維細(xì)胞培養(yǎng)能夠更好地再現(xiàn)膀胱癌發(fā)生浸潤(rùn)的微環(huán)境，從非侵襲性腫瘤發(fā)展為侵襲性腫瘤的過(guò)程中，膀胱癌細(xì)胞必須穿透基膜并穿過(guò)Ⅰ型膠原蛋白。Ⅰ型膠原蛋白現(xiàn)已被用作構(gòu)建三維細(xì)胞模型的常用基質(zhì)，其模擬細(xì)胞外基質(zhì)的效果優(yōu)于二維培養(yǎng)，并且膀胱癌細(xì)胞在三維培養(yǎng)中細(xì)胞排列更加緊密和自然，因此三維細(xì)胞培養(yǎng)能更好地模擬膀胱癌細(xì)胞在體內(nèi)的腫瘤微環(huán)境，對(duì)于研究膀胱癌的發(fā)病機(jī)制具有重要作用[11]。

三、三維細(xì)胞培養(yǎng)與膀胱癌生物學(xué)行為

膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移受多因素影響，是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過(guò)程。相關(guān)研究進(jìn)一步揭示了在三維培養(yǎng)條件下，除了膀胱癌的血管生成能力增強(qiáng)外，其侵襲、遷徙和增殖能力均有增強(qiáng)[12]。三維培養(yǎng)條件下膀胱癌T24細(xì)胞的侵襲能力較二維細(xì)胞培養(yǎng)明顯增強(qiáng)，其主要原因可能是因?yàn)樵谌S培養(yǎng)條件中Eph A2、MMPs及E-cadherin的表達(dá)上調(diào)，提高了其黏附和侵襲的能力[13]。腫瘤的能量代謝與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密不可分，在膀胱腫瘤的三維培養(yǎng)技術(shù)中，其線粒體能量代謝增強(qiáng)[14]。膀胱腫瘤細(xì)胞的能量代謝并不完全符合“Warburg效應(yīng)”，即使在充足的氧氣條件下，仍會(huì)發(fā)生糖酵解(膀胱癌細(xì)胞具有有效的氧化磷酸化過(guò)程，可促進(jìn)相鄰間質(zhì)細(xì)胞中的糖酵解)，導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)前體增加，這些高能代謝產(chǎn)物沿指定方向轉(zhuǎn)移到相鄰的腫瘤細(xì)胞中，并進(jìn)入三羧酸循環(huán)，最終氧化磷酸化增加，產(chǎn)生足夠的ATP以滿足需要。Kim等[15]利用三維生物打印機(jī)制作了膀胱癌細(xì)胞的三維支架，比較膀胱癌細(xì)胞分別在三維和二維培養(yǎng)條件中的存活情況，結(jié)果顯示，三維培養(yǎng)能更為準(zhǔn)確地模擬癌細(xì)胞在體內(nèi)增殖的情況，且增殖程度高于二維。三維細(xì)胞培養(yǎng)模型還能顯示出與細(xì)胞間的相互作用，且與體內(nèi)環(huán)境中各細(xì)胞間相互作用相似。因此，三維細(xì)胞培養(yǎng)能更好地知曉膀胱癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。

四、三維細(xì)胞培養(yǎng)與抗膀胱癌藥物篩選

藥物是治療腫瘤的重要手段之一?？拱┧幬锖Y選始于二維細(xì)胞培養(yǎng)，二維細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)試成功后轉(zhuǎn)向動(dòng)物模型測(cè)試和臨床試驗(yàn)，約 90% 在二維細(xì)胞模型中被證明有效的藥物，在臨床試驗(yàn)中失敗，僅約10%通過(guò)二維細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)試的藥物可成功用于臨床研發(fā)和加工，所以二維細(xì)胞培養(yǎng)在篩選抗癌藥物中造成巨額研發(fā)資金的損失[7,16]。二維培養(yǎng)條件下組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞間的相互作用缺失，不能真實(shí)地反映體內(nèi)的情況，而三維細(xì)胞培養(yǎng)能模仿細(xì)胞的真實(shí)生長(zhǎng)狀態(tài)，基因表達(dá)更接近體內(nèi)，被認(rèn)為更適用于藥物篩選[17～20]。

卡介苗是目前治療膀胱癌患者常用藥物之一，大約30%～50%接受卡介苗治療的患者在治療的前5年內(nèi)沒(méi)有反應(yīng)，且不良反應(yīng)明顯，使其在臨床中的應(yīng)用受到限制[21]。而卡介苗卻在二維細(xì)胞培養(yǎng)模型中顯示出很好的療效，與實(shí)際臨床結(jié)果并不相符。Kim等[15]研究認(rèn)為，在比較兩種細(xì)胞培養(yǎng)方式對(duì)于藥物的作用時(shí)，應(yīng)首先確認(rèn)分泌抗腫瘤細(xì)胞因子(IL-6、IL-12及IFN-γ等)的總量，因其能直接影響抗腫瘤作用；在使用卡介苗處理時(shí)，二維模型中分泌了更多的抗腫瘤細(xì)胞因子，從而增加了在治療膀胱腫瘤中的抗腫瘤作用，導(dǎo)致二維模型在抗腫瘤作用中的效果被夸大。相反，越來(lái)越多的研究表明，三維細(xì)胞模型相較于二維細(xì)胞模型顯示出更高的耐藥性，能更加真實(shí)地反映患者體內(nèi)對(duì)抗腫瘤藥物的特性，進(jìn)一步說(shuō)明三維細(xì)胞培養(yǎng)更適合于體內(nèi)模型[22]。

上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化是上皮細(xì)胞失去細(xì)胞間相互作用而變?yōu)榛顒?dòng)性和侵襲性的過(guò)程，細(xì)胞間相互作用可能導(dǎo)致細(xì)胞系生長(zhǎng)和藥物作用之間的差異，上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程中表達(dá)的鈣黏蛋白存在于細(xì)胞膜中，當(dāng)存在兩個(gè)不同細(xì)胞的細(xì)胞膜中的鈣黏蛋白結(jié)合時(shí)，就會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞間的相互作用。E-鈣黏蛋白和N-鈣黏蛋白是細(xì)胞間相互作用的關(guān)鍵標(biāo)志，E-鈣黏蛋白在細(xì)胞黏附中起著重要作用，并且在細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用中表達(dá)最多，N-鈣黏蛋白在細(xì)胞解離和轉(zhuǎn)移時(shí)表達(dá)，三維模型中兩種鈣黏蛋白明顯高于二維模型[23]。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1是誘導(dǎo)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化并促進(jìn)癌癥的重要因素，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1分別處理三維細(xì)胞培養(yǎng)和二維細(xì)胞培養(yǎng)模型，在二維細(xì)胞培養(yǎng)模型中，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1處理前后E-鈣黏蛋白和N-鈣黏蛋白之間的差異并不顯著。然而，由于強(qiáng)大的細(xì)胞間相互作用，在三維細(xì)胞培養(yǎng)模型中，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1處理后的每種鈣黏蛋白的含量均存在差異，所以藥物的敏感度可因細(xì)胞與細(xì)胞間的相互作用而發(fā)生改變，從而導(dǎo)致藥物的滲透性和有效性存在一定差異[15]。因此，構(gòu)成細(xì)胞間相互作用機(jī)制的三維細(xì)胞模型可能會(huì)提供更好的藥物測(cè)試平臺(tái)，而且，與二維細(xì)胞培養(yǎng)模型評(píng)估藥物反應(yīng)所獲得的結(jié)果相比，三維模型的使用可以獲得更準(zhǔn)確的結(jié)果[24]。此外，三維培養(yǎng)模型還可通過(guò)整合人體提供的組織，構(gòu)建整體器官系統(tǒng)進(jìn)一步研究，更加準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)個(gè)人對(duì)藥物的特殊反應(yīng)，從而開(kāi)發(fā)個(gè)性化藥物，改善癌癥和其他疾病的治療。

五、展 望

三維細(xì)胞培養(yǎng)方法正處于突破性發(fā)展的邊緣，與二維細(xì)胞培養(yǎng)比較有許多優(yōu)勢(shì)，能更好地模擬腫瘤微環(huán)境、腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為和藥物處理時(shí)的信號(hào)變化情況。但三維細(xì)胞培養(yǎng)所用成本較高，且并非所有情況下均能有效地復(fù)制細(xì)胞微環(huán)境，如多數(shù)三維細(xì)胞培養(yǎng)模型缺少基膜，而基膜是分隔上皮細(xì)胞和基質(zhì)的物理屏障，腫瘤侵襲時(shí)會(huì)影響腫瘤細(xì)胞與基膜之間的動(dòng)態(tài)相互作用，使基膜降解及腫瘤細(xì)胞從上皮層遷移，因此，當(dāng)需要以基膜研究原發(fā)性腫瘤的遷移情況時(shí)，運(yùn)用三維細(xì)胞培養(yǎng)復(fù)制微環(huán)境較困難。但隨著相關(guān)技術(shù)的迅猛發(fā)展，有望開(kāi)發(fā)出新的方法來(lái)克服三維細(xì)胞培養(yǎng)目前面臨的限制，同時(shí)降低其使用成本，從而得到更為廣泛的應(yīng)用，為廣大腫瘤患者帶來(lái)福音。