齊義軍，朱亞飛，李恩民

食管癌(esophageal cancer,EC)是常見的消化道惡性腫瘤之一，在全球的發(fā)病率和死亡率分別位居第七位和第六位[1]。由于EC起病隱匿，大部分確診的EC患者已發(fā)展至中晚期，因而治療失敗，復發(fā)和轉移是EC患者死亡的主要原因之一[2-5]。組織學上，食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)和食管腺癌(esophageal adenocarcinoma,EAC)是EC的兩種主要組織學類型，其中ESCC是目前中國和全球主要的組織學類型[6-7]。ESCC和EAC在流行病學、組織起源、病因學、分子生物學、治療策略等方面均有不同變化，是兩種不同類型的腫瘤。EC的形成、演進、浸潤和轉移是多分子參與、相互調控的復雜生物學過程，其中表觀遺傳學變異在該過程中發(fā)揮著重要作用。表觀遺傳學是指調控基因表達的DNA序列以外的因素，不涉及DNA序列改變，主要包括：組蛋白修飾、基因啟動子區(qū)CpG島的甲基化、miRNA甲基化、各種非編碼RNA(miRNA、lncRNA和ceRNA)、調節(jié)DNA高級結構的蛋白質等。本文主要闡述EC轉移過程中涉及的表觀遺傳學變異，為EC的篩查、診斷、預后評估及治療策略提供參考。

1 DNA甲基化

DNA甲基化是指由DNA甲基轉移酶(DNA methyltransfereses,DNMTs)催化，把S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的甲基轉移到胞嘧啶5位碳原子上，生成5-甲基胞嘧啶(5-mC)的過程[8]。哺乳動物DNA甲基化主要發(fā)生在CpG二核苷酸位點，同時CpNpG、CpA和CpT位點也可發(fā)生較低頻率的甲基化[9]。腫瘤發(fā)生時全基因組呈低甲基化狀態(tài)，導致染色質特別是重復序列的染色質不穩(wěn)定性增加；癌基因多為不充分甲基化，導致重新開放或異常高表達。癌細胞在整體低甲基化水平下，一些管家基因和抑癌基因啟動子卻是過度甲基化，引起基因表達水平下降。

1.1 p16ink4A和p14ARF人類的p16ink4A和p14ARF是細胞周期調控蛋白編碼基因，位于核基因組9p21.3位點，是兩個在惡性腫瘤中常見的通過遺傳或表觀遺傳學改變被滅活的腫瘤抑制基因。EC中約40%～61%的原發(fā)性腫瘤發(fā)生了p16ink4A基因甲基化，導致該基因表達缺失，p16ink4A基因純合性缺失或突變而造成的p16ink4A基因表達缺失，較少發(fā)生于ESCC[10-12]。與此相反，p14ARF表達缺失主要是由于該基因的純合性缺失導致的，p14ARF基因甲基化發(fā)生率約有13%～15%[10]。上述表明，在EC發(fā)病過程中，p16ink4A啟動子甲基化是p16ink4A失活的主要機制。

1.2 鈣黏蛋白1鈣黏蛋白CDH1(Cadherin 1)屬跨膜糖蛋白，是一種典型的腫瘤轉移抑制蛋白，其編碼基因位于核基因組16q22.1，參與維持正常組織細胞構筑，抑制腫瘤發(fā)生。CDH1失活可發(fā)生于腫瘤的各個階段[13]。原發(fā)性ESCC中CDH1編碼基因啟動子區(qū)甲基化的發(fā)生率為41%～80%，與Ⅰ/Ⅱ期ESCC患者的預后不良相關[14-16]。同樣，在多種惡性腫瘤中，其他的細胞黏附相關蛋白，如CDH11、CDH13、claudin 3和claudin 4，其編碼基因也常常發(fā)生啟動子區(qū)甲基化。在ESCC中，低密度脂蛋白受體相關蛋白1B(LRP1B)、原鈣黏蛋白10(PCDH10)、原鈣黏蛋白17(PCDH17)、肺癌相關腫瘤抑制因子1(TSLC1/CADM1)等腫瘤轉移抑制蛋白，其編碼基因的啟動子區(qū)也常發(fā)生甲基化[17]。

1.3 O-6-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉移酶編碼基因人類的O-6-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉移酶(O-6-methylguanine DNA methyltransferase,MGMT)的編碼基因位于核基因組10q26.3。MGMT通過去除DNA分子中O-6-甲基/烷基鳥嘌呤的甲基/烷基，參與細胞DNA損傷修復，保護細胞免受烷基化劑的誘變[18]。約30%的人類癌癥中發(fā)生MGMT編碼基因啟動子甲基化，導致該基因失活[19]。在ESCC中，MGMT編碼基因啟動子區(qū)的甲基化程度與腫瘤進展呈正相關[20]。值得注意的是，ESCC中MGMT編碼基因啟動子區(qū)甲基化與TP53基因突變或5,10亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)的C677T多態(tài)性相關，TopoⅡα的表達和MGMT的表達呈負相關[21-22]。提示表觀遺傳學和遺傳學機制在ESCC中協(xié)同發(fā)揮作用。

1.4 DNA錯配修復蛋白MLH1編碼基因人類的DNA錯配修復蛋白MLH1編碼基因位于核基因組3p22.2。MLH1失活發(fā)生于多種人類癌癥，失活的機制涉及遺傳學和表觀遺傳學異常[23]。在ESCC中，MLH1編碼基因啟動子區(qū)甲基化的發(fā)生率約62%，最終導致MLH1蛋白表達水平降低[24]。在ESCC中，表觀遺傳學異常所導致的MLH1編碼基因表達沉默，常常與基因組相關區(qū)域的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性有關。此外，MLH2是人類另一個重要的DNA錯配修復蛋白。在ESCC中，MLH2編碼基因啟動子區(qū)甲基化發(fā)生率約32%。不僅如此，MLH1多態(tài)性和MLH2多態(tài)性存在相互作用，共同增加了食管癌的發(fā)生風險，作用強于MLH1或MLH2單一分子的作用[25]。

1.5 脆性組氨酸三聯(lián)體蛋白編碼基因脆性組氨酸三聯(lián)體蛋白FHIT(fragile histidine triad)編碼基因位于核基因組3p14.2，其失活易引發(fā)DNA損傷[26]。有研究報道，在ESCC中FHIT編碼基因啟動子區(qū)甲基化發(fā)生率約69%，導致ESCC組織FHIT蛋白表達水平降低，而匹配的癌旁組織，該基因啟動子區(qū)不發(fā)生甲基化[27]。由于FHIT表達水平降低發(fā)生于ESCC發(fā)生早期階段，因此，FHIT編碼基因啟動子區(qū)異常甲基化可能會成為ESCC早期診斷和預后的分子標志物[28]。此外，尼古丁能誘發(fā)FHIT編碼基因啟動子區(qū)異常甲基化，表明FHIT基因啟動子區(qū)異常甲基化可能是吸煙參與ESCC發(fā)生的機制之一[29]。

2 組蛋白修飾與染色質重塑

在外部環(huán)境諸因素的刺激之下，組蛋白會發(fā)生修飾改變，導致染色質結構變化，影響相關基因表達。發(fā)生修飾的組蛋白會提供一種分子識別標志，為其他相關功能蛋白的進一步結合導向。這些組蛋白修飾構成了組蛋白密碼，是重要的表觀遺傳學標志。常見的組蛋白修飾包括乙?；?、甲基化、磷酸化、泛素化、糖基化、ADP核糖基化和羧基化等，是構成組蛋白密碼的元素。同一組蛋白的不同修飾類型之間發(fā)生相互影響稱順式作用，不同組蛋白的修飾之間發(fā)生的相互影響稱反式作用。目前，乙?；图谆揎検墙M蛋白最常見的修飾形式。組蛋白的乙?；軌蜻x擇性地使染色質特定區(qū)域的結構變松散，利于基因轉錄、增強基因表達，而組蛋白的甲基化則可能增強或抑制基因表達。

在EC中，組蛋白修飾相關基因常發(fā)生序列突變的有KMT2C、KMT2D、KDM6A、CREBBP和EP300等。GASC1是組蛋白去甲基酶，GASC1相關基因，MDM2和NANOG高表達的ESCC患者預后不良[30]。WNT信號通路的分泌型配體WNT2編碼基因增強子區(qū)甲基化程度增高，抑制EZH2與該區(qū)域結合，使EZH2介導的H3K27me3的表達量降低，對WNT2抑制作用減弱，導致Wnt/β-catenin/MMP等細胞信號通路活性增強，ESCC的侵襲轉移能力增加[31]。

3 非編碼DNA

人類基因組，約30億個堿基對，其中編碼蛋白質的序列僅占基因組的1.5%，非編碼DNA在人類的基因組中占絕大多數。在非編碼DNA中，部分序列轉錄rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA和miRNA等，與2萬余個編碼蛋白質的基因一起分散排列。目前，有觀點認為，占人類基因組98.5%的非編碼DNA決定了人類與其他物種的區(qū)別。人類基因組80%的DNA具有結合蛋白質的能力，且具有細胞特異性，提示這些非編碼區(qū)域具有功能活性，可能參與相關基因的表達調控。因此，可以認為蛋白質是人類組織細胞的重要物質基礎，但基因組的非編碼序列決定了組織細胞的表型及功能特異性。人類基因組中非編碼DNA序列可分為如下幾類：結合轉錄因子的基因啟動子區(qū)和增強子區(qū)、結合其他因子具有調控染色質結構的區(qū)域、非編碼RNA(如lncRNA、miRNA和ceRNA)、轉位子等可移動元件，以及端粒和中心粒等特殊區(qū)域。近年來研究表明，大多數人類疾病相關遺傳變異位于基因組的非蛋白編碼區(qū)域，提示在人類疾病的發(fā)生發(fā)展過程中，基因表達調控區(qū)的變異可能比蛋白編碼區(qū)的變異發(fā)揮更重要作用。

3.1 miRNA

miRNA是一類單鏈、進化保守的非編碼RNA，17～25個核苷酸，通過對基因表達的負性調控廣泛參與細胞的各種生物學事件[32]。miRNA與相應的mRNA結合，阻斷蛋白編碼基因的翻譯表達。目前已鑒定的miRNAs超過了9 500個，在細胞增殖分化和細胞周期的調控等方面發(fā)揮著重要作用。許多癌基因和抑癌基因的表達受miRNAs調控，miRNAs可能發(fā)揮腫瘤抑制基因或癌基因的功能，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[33]。

癌細胞的運動能力是癌細胞侵入血管和擴散到周圍組織器官的前提條件。在癌細胞的侵襲轉移過程中，EMT是其早期表型。在ESCC中，miR-9、miR-25和miR-92a表達增高，通過抑制CDH1表達，促進癌細胞侵襲轉移[34-36]。有研究表明miR-200a、miR-21促進ESCC細胞增殖、遷移和侵襲[37]。miRNA-10b促進細胞周期的進展，抑制細胞凋亡，促進EC細胞的遷移和侵襲，其機制可能與TGF-β的上調和PTEN的下調有關[38]。與此相反，miR-205和miR-200家族在ESCC中低表達，使對ZEB表達抑制能力降低，誘導EMT，促進ESCC侵襲轉移[39]。有研究報道，miR-21和miR-183通過靶向PDCD4促進ESCC細胞生長和侵襲[40]。Ohta等報道，在16個ESCC細胞系中，GNG7的mRNA和miR-328的表達呈顯著負相關關系，提示miR-328可能通過抑制GNG7，導致ESCC細胞的侵襲能力增強[41]。有研究表明，miR-21在ESCC組織和細胞系中表達增加，miR-21的敲除顯著增加PTEN蛋白的表達，降低ESCC細胞的增殖、侵襲和遷移能力[42]。Tian等發(fā)現ESCC細胞中miR-10b過表達顯著抑制內源性KLF4蛋白的功能，使ESCC細胞遷移侵襲能力增加[43]。Rong H等發(fā)現過表達LINC-PINT可以抑制人ESCC細胞中miRNA-21的表達，而過表達miR-21不會改變LINC-PINT的表達。因此，LINC-PINT的下調可能通過與miRNA-21相互作用參與了ESCC的復發(fā)[44]。另一項多因素分析顯示，miR-1304是影響EC患者預后的獨立因素，并且miR-1304可作為EC診斷、復發(fā)和生存的潛在分子標志物[45]。

一些miRNAs通過抑制靶基因/蛋白表達，抑制ESCC細胞侵襲。如在ESCC組織細胞中，miR-100對mTOR、miR-625對Sox2、miR-326對VEGF-C、miR-133a對Fascin和基質金屬蛋白酶14、miR-195對Cdc42等，前者miRNAs通過抑制后者靶基因/蛋白表達，最終抑制ESCC細胞侵襲[46]。

在ESCC組織中，miR-203表達下調，失去了對靶蛋白LASP1表達的抑制作用，進而促進ESCC細胞侵襲[47]。miR-203高表達通過靶向小G蛋白RAN，誘導ESCC細胞凋亡，抑制ESCC細胞生長、遷移和侵襲[48]。在ESCC中，檢測miR-21、miR-25、miR-27b、miR-100、miR-126、miR-143和miR-145表達具有預后預警意義。miR-550a-1、miR-7705、miR-935、miR-4326、miR-5010、miR-589和miR-3199-2可能與EC的腫瘤進展和復發(fā)相關[49]。

外周血miRNA標志物的鑒定對于ESCC的早期檢測和預后預警具有重要的臨床意義。有研究表明，ESCC患者血漿miR-19b和miR-25的水平明顯高于健康對照組；術后ESCC患者血漿miR-25的水平，與術前相比，顯著降低；ESCC復發(fā)患者外周血miR-25的水平顯著增高[50]。另有研究表明：①ESCC患者血清miR-1246明顯增高，有可能成為ESCC早期診斷的分子標志物[51]；②與健康對照相比，ESCC患者血漿miR-18a、miR-21和miR-375的濃度明顯增高，而術后ESCC患者血漿中這些miRNAs的濃度顯著降低[52]；③ESCC患者血清中miR-200c的濃度明顯高于健康對照組，高表達miR-200c與ESCC化療抵抗顯著相關[53]；④外周血miR-331-3p高表達與EAC高復發(fā)風險相關[54]。然而，在外周血中尋找ESCC miRNA生物標志物尚處于初步階段，有待今后進一步研究探索。

除血漿miRNA，有關外泌體miRNA也成為近年來的研究熱點。有報道，ESCC患者外泌體miR-21水平高于對照組，外泌體中miR-21水平與ESCC的腫瘤分期、淋巴結轉移，以及遠處轉移呈正相關[55]。

3.2 長鏈非編碼RNA

在哺乳動物基因組序列中，大約4%～9%的序列產生的轉錄本是長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)。lncRNA為長度超過200個核苷酸的非編碼RNA轉錄本，廣泛參與了諸如X染色體沉默、基因組印記、染色質結構重塑、基因轉錄激活、基因轉錄干擾、靶蛋白核內運輸等重要生物學過程。lncRNA分子內部擁有特定而復雜的二級結構，能提供與相關蛋白質分子的結合位點，或通過與DNA或RNA堿基互補配對發(fā)生特異性相互作用，共同構成由lncRNA參與的復雜精妙的基因表達調控網絡。

目前已鑒定的與食管發(fā)生發(fā)展相關的lncRNA有HOTAIR、MALAT1、POU3F3、POU6F2-AS2、AFAP1-AS1、HNF1A-AS1、TP73-AS1、SPRY4-IT1和ESCCAL1等。HOTAIR高表達能夠影響染色質的結構，影響多個基因的表達，增強癌細胞的侵襲轉移和抗凋亡的能力，同時HOTAIR高表達提示ESCC患者預后不良，靶向沉默ESCC細胞中HOXA11-AS表達能夠抑制癌細胞的增殖和遷移能力[56]。在ESCC中，高表達的MALAT1能明顯增加癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力。擁有腫瘤抑制功能的miR-101和miR-217，通過轉錄后調控抑制MALAT的表達，高表達miR-101和miR-217能降低MALAT1誘導的ESCC細胞的增殖和遷移能力。與此同時，沉默MALAT1后，P21和P27表達上調、B-MYB表達下調，使細胞阻滯于G2/M期，抑制癌細胞的增殖[57]。lncRNA/POU6F2-AS2特異性表達于ESCC中，參與DNA損傷修復。長鏈非編碼RNA/POU3F3，在ESCC中表達顯著上調，增加癌細胞的增殖能力、集落形成能力和致瘤性。分子機制研究結果表明，POU3F3通過與EZH2編碼基因的增強子序列結合，促進癌細胞惡性進展[58]。另有研究表明，SPR64-IT1、CCAT2和PCAT-1亦高表達于ESCC，與ESCC的臨床病理分期正相關，與ESCC患者生存期負相關[59-61]。與此相反，LOC285194在ESCC中低表達，與ESCC的放化療抵抗和不良預后相關[62]。LINC00857和MIR22HG高表達于EAC，LINC00857沉默后能夠誘導腺癌細胞遷移和轉移能力降低，該過程涉及MET、STAT3、c-Myc、p-CREB等多個信號通路蛋白分子表達降低[63-64]。在血漿/血清中，可檢測lncRNA作為非侵入性生物標志物，用于癌癥的早期診斷和預后預警。在ESCC患者的血漿中，POU3F3、HNF1A-AS1和SPRY4-IT1的水平顯著上調。在此3種lncRNA分子中，相比較而言，檢測POU3F3血清水平診斷ESCC的準確性更高[65]。

EC的復發(fā)轉移是一個涉及多分子、多步驟的極其復雜的生物學過程，表觀遺傳變異是該過程的關鍵驅動因素之一。相對于穩(wěn)定的基因組和基因變異而言，表觀遺傳學變化在一定條件下可以逆轉，鑒定和開發(fā)逆轉腫瘤相關表觀遺傳學變異分子及通路，可為EC治療提供新的思路和策略。