黃高翔，韋燦燊，蘇曉雪，黎婧，郭蓁，黎靜

1廣西醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生理學教研室，南寧530021；2廣西醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院人體解剖學教研室；3廣西醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院轉化醫(yī)學研究中心長壽與老年相關疾病教育部重點實驗室

骨質(zhì)疏松癥是以骨量降低、骨組織微結構破壞為特征的全身性骨骼疾病[1]。骨吸收、骨形成在空間和時間上是偶聯(lián)的，如果骨吸收過度而骨形成不足，就會導致骨質(zhì)疏松。衰老性骨質(zhì)疏松癥是年齡增長引起的以骨吸收大于骨生成為特征的進行性代謝性疾病。miRNA參與調(diào)節(jié)骨骼的形成、重塑、代謝等各個過程，與骨質(zhì)丟失等骨骼相關疾病密切相關[2-3]。但是，以往研究主要集中在絕經(jīng)后骨質(zhì)丟失和骨質(zhì)疏松癥的miRNA表達譜[4-5]，針對衰老性骨質(zhì)疏松癥miRNA表達譜的研究較少，對于衰老性骨質(zhì)疏松癥的基因譜及生物信號通路網(wǎng)絡的相關機制尚不清楚，明確衰老性骨質(zhì)疏松癥的分子機制成為亟待解決的問題。2018年6月—2021年6月，本研究篩選了衰老性骨質(zhì)疏松癥小鼠脛骨組織中差異表達的miRNA，并進行生物信息學分析，進一步探討miRNA在衰老骨組織進展中的分子機制，為臨床治療骨質(zhì)疏松癥提供更多理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料 3月齡雄性BALB/c小鼠40只由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供，體質(zhì)量24～28 g。D-半乳糖、PBS購自北京索萊寶科技有限公司。RNasey mini試劑盒購自德國恰根公司。

1.2 小鼠模型制備 小鼠隨機分為對照組和衰老組，每組20只。衰老組小鼠每天皮下注射D-半乳糖(200 mg/kg)，對照組小鼠每天皮下注射等量PBS。3個月后戊巴比妥鈉深度麻醉小鼠，取兩側脛骨組織進行HE染色觀察和顯微CT分析。與對照組相比，衰老組脛骨骨小梁較細、較稀疏，連接較少；衰老脛骨的骨密度(BMD)、骨小梁相對容積(BV/TV)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)水平顯著降低，骨小梁分離度(Tb.Sp)顯著升高(P均<0.05)，說明衰老組衰老性骨質(zhì)疏松癥小鼠模型建立成功。見表1。

表1 兩組小鼠脛骨骨組織微結構參數(shù)比較

1.3 RNA提取 從兩組小鼠脛骨中提取出總RNA，采用RNasey mini試劑盒純化RNA，檢測RNA濃度后，采用凝膠電泳法檢測RNA的完整性。

1.4 脛骨組織差異表達miRNA分析 小鼠脛骨組織miRNA表達譜分析委托上?？党缮锕こ逃邢薰就瓿?，使用miRCURY LNA Array系統(tǒng)對骨樣本進行miRNA表達譜分析。RNA樣本標記和雜交后，用Axon Gene Pix4000B微陣列掃描儀獲得原始數(shù)據(jù)，差異表達miRNA的篩選條件為|logFC|>1.5、P<0.05。

1.5 脛骨組織差異表達miRNA的靶基因功能分析 采用TargetScan(http://targetscan.org/)和miRDB(http://mirdb.org/miRDB)預測脛骨組織差異表達miRNA的靶基因，利用VEEN圖把2個數(shù)據(jù)庫預測的靶基因取交集。將靶基因導入DAVID6.8(http://david.ncifcrf.gov)在線數(shù)據(jù)庫，物種限定為小鼠，進行GO富集分析，研究靶基因的生物功能；進行KEGG通路分析，研究靶基因相關信號通路。將靶基因導入STRING數(shù)據(jù)庫(https：//string-db.org/)，限定研究物種為小鼠，并設置medium confidence>0.4，其他默認設置，獲得靶基因編碼蛋白的相互作用關系。采用Cytoscape3.7.2軟件的Bisogenet和CytoN-CA插件，篩選富集程度高的相互作用關系，構建miRNA-靶基因—蛋白調(diào)控網(wǎng)絡。

2 結果

2.1 兩組脛骨組織差異表達miRNA 兩組有20個差異表達的miRNA。衰老組較對照組表達上調(diào)的miRNA有8個，分別為miR-5617-5p、miR-10a-3p、miR-3071-5p、miR-16-2-3p、miR-125b-1-3p、miR-344i、miR-181a-1-3p、miR-1934-3p；表達下調(diào)12個，分別為miR-211-3p、miR-31-3p、miR-5619-3p、miR-370-5p、miR-450b-3p、miR-96-5p、miR-5136、miR-344d-2-5p、miR-376b-3p、miR-411-5p、miR-15b-5p、miR-499-3p。

2.2 脛骨組織差異表達miRNAs的靶基因預測 TargetScan數(shù)據(jù)庫預測得到2 953個靶基因，miRDB數(shù)據(jù)庫預測得到4 158個靶基因。利用VEEN圖取交集，得到1 130個靶基因。

2.3 脛骨組織差異表達miRNAs的靶基因GO分析結果 GO分析結果顯示，分子功能方面，靶基因主要在酶結合、蛋白結合和DNA結合等方面發(fā)揮作用；細胞組分方面，多數(shù)靶基因涉及細胞連接、液泡和突觸等；生物過程方面，靶基因主要參與蛋白質(zhì)定位、蛋白質(zhì)轉運和信號調(diào)節(jié)等。見表2。

表2 衰老組脛骨組織中差異表達miRNA的靶基因GO分析結果

2.4 脛骨組織差異表達miRNAs的靶基因KEGG分析結果 衰老組脛骨組織差異表達miRNAs的靶基因主要調(diào)節(jié)MAPK信號通路、FoxO信號通路、Ras信號通路等。見表3。

表3 衰老組脛骨組織中差異表達miRNA的靶基因KEGG通路分析結果(前10位)

2.5 miRNA-靶基因—蛋白調(diào)控網(wǎng)絡分析結果 兩組差異表達的miR-96-5p、miR-5617、miR-15b、miR-3071與靶基因MAP2K1、UBE2G1、P4HB、VDAC1、CD164有緊密聯(lián)系。而且，這些靶基因編碼蛋白具有相互作用關系。

3 討論

miRNA是由DROSHA酶在細胞核中把初級miRNA加工成前體miRNA，再通過DICER酶在細胞質(zhì)中進一步加工，上述miRNA與Argonaute蛋白一起組成RNA誘導沉默復合體，其中一條鏈被選擇成為成熟的miRNA。成熟的miRNA通過與互補的靶基因mRNA結合，導致mRNA翻譯抑制或降解，最終降低靶蛋白表達。miRNA具有組織特異性、高度保守性和時序性，對細胞和組織的功能起著重要的調(diào)控作用。越來越多的證據(jù)表明，各種miRNA通過靶向參與成骨細胞和破骨細胞分化過程的主要轉錄因子和信號通路，最終影響骨的形成和重塑，從而對成骨細胞、破骨細胞分化起著至關重要的作用[6-8]。同時，許多miRNA是不同細胞和組織衰老過程中不可缺少的調(diào)節(jié)因子，并與心血管疾病、腫瘤和阿爾茨海默病等疾病有關。因此，miRNA在老年性疾病的診斷、治療和預后方面具有廣泛的應用前景。

骨質(zhì)疏松癥動物模型有老年性骨質(zhì)疏松癥模型和絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型，其中構建老年性骨質(zhì)疏松癥模型的方法包括自然衰老導致的骨質(zhì)疏松癥模型、D-半乳糖誘導的衰老性骨質(zhì)疏松癥模型等[9]。而D-半乳糖誘導衰老動物模型已被廣泛應用于許多研究[10]。據(jù)報道，對Wistar大鼠進行D-半乳糖處理12周后可出現(xiàn)骨質(zhì)流失表現(xiàn)[11]。骨質(zhì)疏松癥早期沒有明顯臨床特征，而BV/TV、Tb.N、Tb.Th等指標可以反映早期骨質(zhì)疏松癥的骨流失，因此骨小梁相關特征是評估骨質(zhì)疏松較好的指標。顯微CT提供的高分辨影像能分析出更全面的骨骼參數(shù)，因而被廣泛應用于觀察骨小梁結構。本研究采用顯微CT對D-半乳糖誘導的小鼠衰老性骨質(zhì)疏松癥模型進行分析，與對照組相比，衰老組小鼠出現(xiàn)了BMD、Tb.N、Tb.Th降低及Tb.Sp升高等骨質(zhì)疏松的相關表現(xiàn)。在對骨組織進行HE染色分析后發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，老年骨中脛骨骨小梁較細、較稀疏，結果與顯微CT圖像一致。

在建模成功后，本研究對對照組和衰老組骨組織進行miRNA芯片檢測，與對照組相比，衰老組表達上調(diào)miRNA有8個(mmu-miR-5617-5p、mmu-miR-10a-3p、mmu-miR-3071-5p、mmu-miR-16-2-3p、mmu-miR-125b-1-3p、mmu-miR-344i、mmu-miR-181a-1-3p和mmu-miR-1934-3p)，表達下調(diào)的miRNA有12個(mmu-miR-211-3p、mmu-miR-31-3p、mmu-miR-5619-3p、mmu-miR-370-5p、mmu-miR-450b-3p、mmu-miR-96-5p、mmu-miR-5136、mmu-miR-344d-2-5p、mmu-miR-376b-3p、mmu-miR-411-5p、mmu-miR-15b-5p和mmu-miR-499-3p)。其中，mmu-miR-96-5p的相對表達量與對照組比較顯著降低。miR-96-5p被認為是年齡相關性骨丟失的潛在診斷標志物或治療靶點。miR-96-5p可以通過直接抑制靶向osterix來調(diào)節(jié)成骨[12]，并且還可以通過靶向FOXO1來調(diào)節(jié)成骨細胞衰老[13]。在表達上調(diào)的miRNA中，miR-16-2-3p被證實在骨質(zhì)疏松癥患者的骨組織中表達增加，并可以通過直接靶向Wnt5A來阻斷Wnt信號通路，抑制骨形成[14]。此外，miR-181a通過調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細胞中FasL蛋白表達，對骨髓間充質(zhì)干細胞誘導的CD4+T淋巴細胞凋亡產(chǎn)生負調(diào)控作用[15]。在表達下調(diào)的miRNA中，miR-370不僅可以調(diào)節(jié)MC3T3-E1細胞中BMP-2的表達、促進細胞分化，還可直接靶向FOXM1，抑制骨肉瘤細胞的增殖和轉移。此外，miR-15b不僅可以通過直接靶向Smurf1作為成骨細胞分化的正向調(diào)節(jié)因子，還可以調(diào)控成骨細胞的增殖和凋亡。然而，其他差異表達miRNA在相關過程中的作用仍需進一步研究。

GO分析結果表明，差異表達miRNA的靶基因主要參與酶結合、蛋白域特異性結合、序列特異性DNA結合、細胞連接、蛋白質(zhì)定位、大分子定位和蛋白質(zhì)轉運等過程，提示這些miRNA可能在骨老化過程中發(fā)揮重要作用。同時，KEGG通路分析結果表明，MAPK、FoxO、Ras等信號通路可受到這些靶基因的影響。例如，p38 MAPK通路對于體內(nèi)正常骨骼形成是必不可少的。缺失任何MAPK途徑成員編碼基因Mkk3、Mkk6、p38a或p38b的小鼠，均出現(xiàn)骨質(zhì)量和成骨細胞分化顯著降低。p38α MAPK以衰老依賴的方式調(diào)節(jié)破骨細胞祖細胞的增殖、分化及骨重塑。還有研究表明，6個月大的p38αf/f突變小鼠出現(xiàn)骨質(zhì)疏松癥，與破骨細胞生成和骨吸收增加有關[16]。此外，F(xiàn)oxO途徑在年齡相關骨骼退化中具有重要作用。隨著年齡的增長，F(xiàn)oxO表達減少可能是骨關節(jié)炎的關鍵致病因素[17]。更重要的是，骨組織中活性氧水平隨著年齡和性類固醇缺乏而增加，而FoxO蛋白通過增強抗氧化酶和減少H2O2積累來限制破骨細胞形成和骨吸收[17]。此外，Ras信號通路也可調(diào)節(jié)骨祖細胞增殖和骨形成。過度活躍的Ras/MAPK信號是神經(jīng)纖維蛋白缺乏小鼠脛骨骨不連骨折的關鍵因素。因此，Ras/MAPK通路失調(diào)很可能也是骨礦化減少的重要原因。

此外，本研究通過miRNA及其靶基因網(wǎng)絡調(diào)控關系找到了節(jié)點miRNA和靶基因，提示miRNA-96-5p、miRNA-5617、miRNA-15b和miRNA-3071可同時調(diào)控MAP2K1、UBE2G1、P4HB、VDAC1和CD164等多個靶基因，更重要的是這些靶基因的編碼蛋白存在相互作用。這提示差異表達miRNA可能在調(diào)控骨老化過程中起重要作用。其中，MAP2K1是調(diào)控細胞周期和衰老的重要基因之一。UBE2G1是一種針對異?；蚨虊勖鞍踪|(zhì)進行降解的重要物質(zhì)[18]。VDAC1是一種調(diào)節(jié)細胞存活和死亡的多功能線粒體蛋白[19]。P4HB可抑制錯誤折疊蛋白的聚集，其敲除可能誘導細胞凋亡[20]。CD164是一種潛在的細胞生長促進劑，參與細胞增殖和凋亡。

由此可見，miRNA在衰老性骨質(zhì)疏松癥發(fā)生發(fā)展過程中可能具有重要作用，相關關鍵基因有望作為預防和治療衰老性骨質(zhì)疏松癥的藥物靶點。