李曼祎，張亞萌，劉春鳳，鄭飛云，鈕成拓，李 崎，王金晶

枸杞果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化及香氣成分分析

李曼祎，張亞萌，劉春鳳，鄭飛云，鈕成拓，李 崎，王金晶*

(江南大學工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，生物工程學院，無錫 214122)

以寧夏枸杞為原料，分析枸杞汁初始含糖量、發(fā)酵溫度、酵母接種量和SO2添加量對枸杞果酒發(fā)酵的影響。在單因素試驗基礎(chǔ)上，以枸杞多糖含量及感官品評得分為響應值，采用響應面分析法優(yōu)化枸杞果酒發(fā)酵工藝。結(jié)果表明，枸杞果酒最佳發(fā)酵條件為初始含糖量230 g·L-1，接種量0.8′107cfu·mL-1，溫度21.5 ℃靜置發(fā)酵6 d。在此最優(yōu)發(fā)酵工藝下，通過SPME-GC-MS定量及香氣活度值（odor activity value，OAV）相結(jié)合的方法對枸杞酒風味物質(zhì)進行分析，鑒定出正壬醇（283.51）、苯乙醇（2.19）、乙酸異戊酯（60.38）、異戊酸乙酯（2.67）等11種物質(zhì)為枸杞果酒的主要風味化合物。該研究首次定量分析確定了枸杞果酒中的特征香氣物質(zhì)，為枸杞果酒產(chǎn)品的開發(fā)及品質(zhì)調(diào)控提供了一定的科學依據(jù)。

枸杞果酒；工藝優(yōu)化；響應面分析；風味物質(zhì)

枸杞（L.）又稱枸杞紅實，甜菜子，屬茄科落葉灌木，在我國的寧夏、青海、新疆、甘肅等地均有分布，在《神農(nóng)本草經(jīng)》中引為上品，是我國傳統(tǒng)名貴中藥材。枸杞子中含有的甜菜堿、枸杞色素和枸杞多糖(polysaccharide, LBP)為其主要活性物質(zhì)[1-3]，具有消炎、抗疲勞、抗氧化、延緩衰老和預防腫瘤等重要的生物學功能，是食品和化妝品天然的著色物質(zhì)[4]。近年來，以葡萄、水蜜桃、桑葚等水果為原料發(fā)酵的果酒深受消費者認可[5]。因枸杞獨特的保健功能，枸杞相關(guān)產(chǎn)品的研制也日益受到研究者的關(guān)注，但其多集中于生物活性物質(zhì)的提取、測定方法[6-7]及香氣成分的檢測[8-10]。目前市售枸杞酒大多為配制酒，因而產(chǎn)品的典型性欠佳、香氣欠缺、口感不協(xié)調(diào)、生物活性物質(zhì)含量較低。

劇檸等[11]通過篩選添加非釀酒酵母提高枸杞果酒風味，董建方等[12]以枸杞果酒的感官評定分數(shù)為響應值得出最佳發(fā)酵工藝條件為：初始糖度220 g·L-1，發(fā)酵溫度18 ℃± 2 ℃，酵母接種量0.3 g·L-1，初始酸度4.3 g·L-1。目前果酒工藝優(yōu)化大多以感官評定為指標，但感官僅反映個人喜好程度及酒體風味，生物活性物質(zhì)含量同樣是重要的品質(zhì)指標。鑒于此，作者以寧夏枸杞為原料，通過響應面優(yōu)化對發(fā)酵工藝進行調(diào)整并進行果酒風味物質(zhì)分析，以期得到兼具保健價值與口感的枸杞果酒。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試劑

枸杞，寧夏中寧；果酒酵母EC1118，本實驗室保藏；葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、瓊脂粉、5%苯酚溶液、硫酸、無水乙醇、檸檬酸、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉等，國藥試劑；乙酸乙酯等（色譜純），美國Sigma公司；白砂糖，市售。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1CU 雙人單面凈化工作臺，蘇州凈化有限公司；電子天平、AL204分析天平和精密數(shù)顯pH計，梅特勒-托利多儀器有限公司；紫外-可見光分光光度計，上海天美公司；四型啤酒分析儀，安東帕公司；Trace1310ISQ LT 頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 枸杞果酒工藝流程

由于枸杞鮮果不耐運輸，易磕碰導致霉變，且成熟時間受限，因此本試驗以枸杞干果為釀酒原料。熱水浸泡2 h促使枸杞干果吸水膨脹以便榨汁等后續(xù)處理且促進活性物質(zhì)溶出[13]；枸杞汁中添加白砂糖及檸檬酸調(diào)節(jié)糖度及pH。本研究中果酒發(fā)酵均為帶渣發(fā)酵，果汁pH為3.5；單因素及響應面試驗采用1 L三角瓶進行發(fā)酵，裝液量為60%，驗證實驗發(fā)酵體積為10 L。

1.3.2 枸杞果酒發(fā)酵條件單因素試驗設(shè)計 選取無霉變、蟲蛀且外形完好的枸杞干果，發(fā)酵工藝分別采用不同單一因素：初始含糖量（180、200、220、240和260 g·L-1）、發(fā)酵溫度(19、22、25、28和31 ℃) 、接種量(0.6×107、0.8×107、1.0×107、1.2×107和1.4×107cfu·mL-1) 和SO2添加量(0巴氏滅菌、20、40、60和80 mg·L-1) 。待主發(fā)酵結(jié)束后測定其酒精度及多糖含量并進行感官品評，分析不同單因素對枸杞果酒發(fā)酵的影響，確定最佳單因素條件。

1.3.3 響應面優(yōu)化發(fā)酵工藝 在單因素試驗基礎(chǔ)上，選擇初始含糖量、發(fā)酵溫度及接種量3個因素進行響應面優(yōu)化試驗，以果酒中枸杞多糖含量、感官品評得分為響應指標，確定枸杞果酒最佳工藝條件，因素及水平如表1所示。

表1 Box-Behnken實驗設(shè)計因素與水平

1.3.4 指標測定 (1) 酒精度采用安東帕公司啤酒分析儀進行測定；總糖、總酸測定均參照GB/T 15038—2006[14]。黃酮含量測定參考吳有鋒等[15]的NaNO2-AL(NO)3方法，以蘆丁為標準品，標準曲線回歸方程為：= 0.563 0+ 0.027 9，2=0.997 2；枸杞多糖含量測定采用苯酚硫酸法[16]，稍作修改，以葡萄糖為標準品，標準曲線回歸方程為：= 9.583 2+ 0.005 6，2= 0.999 1。

(2) 感官評價。由13名經(jīng)過訓練并具有品評經(jīng)驗的專業(yè)人員對本次研究中枸杞果酒成品進行感官評價[17]，從外觀、香氣、口感和典型性4個方面進行品評，評分標準及細則均以表2為標準。

1.3.5 揮發(fā)性香氣物質(zhì)分析 采用SPME -GC-MS對枸杞果酒進行風味物質(zhì)分析，樣品處理及分析條件參照李凱等[18]的方法，實驗均以2-辛醇作為內(nèi)標。未知化合物的定性：通過與 NIST 05 質(zhì)譜庫中標準譜圖及化合物保留指數(shù)（RI）比對來確定。定量分析：在與枸杞果酒酒精度及pH相似的緩沖液（10%乙醇，pH=3.5）中配制待測化合物標準混合液，根據(jù)化合物峰面積與內(nèi)標物峰面積比值及對應物質(zhì)濃度繪制校準曲線。待定量化合物濃度根據(jù)校準曲線及其峰面積相對于內(nèi)標峰面積的比值進行計算。

香氣活度值( odor active value, OAV)表示香氣化合物實際含量與閾值的比值，通過其比值大小可以判斷該種化合物對樣品主體香氣風格的貢獻程度。通常認為≥ 1 的化合物對樣品風味有貢獻[19]，計算公式如下：

=ρ/OT

式中：ρ，香氣化合物質(zhì)量濃度，mg·L-1;OT，香氣化合物閾值，mg·L-1。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

糖作為酵母生長繁殖所需要的重要底物，也是果酒釀造中酒精的來源，決定了果汁發(fā)酵后的酒精濃度，因此糖含量對發(fā)酵后的果酒中多糖溶解性和含量有一定影響[16]。由圖1（a）可知，酒精度及枸杞多糖含量在一定范圍內(nèi)隨初始糖濃度增加呈上升趨勢。初始含糖量為220 g·L-1時，感官品評達到較高分數(shù)，果香較為和諧，口感協(xié)調(diào)，且此時枸杞多糖含量亦為最高。而后隨初始含糖量增加，酒精度變化無顯著差異(＜0.05)，可能是由于過高糖含量導致滲透壓增加，影響酵母活性。此時果酒中酒精味突出，破壞整體協(xié)調(diào)感，感官品評得分下降。因此確定果汁中初始含糖量為200～240 g·L-1。

圖中不同字母表示差異顯著（P < 0.005）。

Figure 1 Effects of different single factors on the fermentation of wolfberry wine

溫度是影響果酒發(fā)酵的重要因素，不同的發(fā)酵溫度會對酵母生長造成影響，同時影響原料活性物質(zhì)的溶出、營養(yǎng)成分及風味物質(zhì)的保留[20]。如圖1（b）所示，發(fā)酵溫度過低，酵母起酵速度減慢，發(fā)酵不徹底，周期延長，酒精度偏低，且酶活也會受到溫度影響，不利于酒精和其他香氣成分的積累；溫度過高，酵母迅速繁殖，發(fā)酵周期縮短，衰老速度加快，果香揮發(fā)過多，導致酒體單薄，口感偏酸，果香不突出[21]；發(fā)酵溫度在22 ℃時，發(fā)酵過程平穩(wěn)，發(fā)酵較徹底，酒精度可以達到預期，同時酒體圓潤，口感協(xié)調(diào)，感官評分最高，且稍低的溫度能更好地保留了枸杞原料的風味，感官品評中典型性分值也相應提高。由于不同溫度水平下枸杞多糖含量有所差異，因此確定發(fā)酵溫度為19～25 ℃。

表3 Box-Behnken實驗設(shè)計及結(jié)果

適宜的接種量可以較快地啟動酒精發(fā)酵，并且通過影響風味物質(zhì)的產(chǎn)生來影響酒體的最終風味。由圖1（c）可知，酵母接種量對于枸杞果酒感官品評影響較大。當酵母接種量過高時，發(fā)酵速度較快，但原料中營養(yǎng)物質(zhì)用于酵母生長繁殖部分增加，導致生成酒精底物減少，酒精度下降。接種量過低時也無法保證酒精積累且起酵速度慢，發(fā)酵周期延長，易增加雜菌污染幾率[22]。當酵母接種比例由0.6×107cfu·mL-1增加至0.8×107cfu·mL-1時，感官品評得分略有上升，然后達到最大值。而后，隨酵母接種量增加，過量酵母代謝產(chǎn)生的副產(chǎn)物影響了發(fā)酵過程，不利于風味物質(zhì)的形成[23]，感官品評中果酒鮮味也愈加明顯，得分降低。枸杞多糖的含量隨接種量增加呈下降的趨勢，這可能是發(fā)酵后期酵母及其他微生物消耗或吸附沉降所致[16]，同時過量的酵母生長消耗了酒體中的單糖及雙糖等寡糖, 使醇沉法提取的粗多糖含量下降[24]。因此確定接種量范圍為6×106～1×107cfu·mL-1。

SO2因其具有抑制細菌等微生物生長繁殖而對釀酒酵母影響較小的特點被加入到果汁原料中以達到對釀造環(huán)境殺菌的效果，但濃度過高會使酒體產(chǎn)生不愉悅的硫味，且會中和化合物中游離羰基導致發(fā)酵周期延長[25]。SO2添加量為20 mg·L-1時感官品評及多糖含量最高，隨SO2添加量增加，酒中硫臭味加重，感官品評得分隨之下降（圖1（d））。同時由于SO2添加量對枸杞多糖含量影響程度較低，因此響應面試驗中不作為考察因素。

2.2 響應面試驗

2.2.1 響應面試驗結(jié)果與方差分析 枸杞多糖由半乳糖、甘露糖、葡萄糖、吡喃糖等單糖組成[26]，多糖的提取與溫度、浸提時間、pH、乙醇濃度密切相關(guān)[27]，果酒發(fā)酵過程中酒精濃度，發(fā)酵溫度及果汁pH的改變綜合影響枸杞多糖的浸出及保留。枸杞多糖含量是判斷枸杞及其加工產(chǎn)品品質(zhì)的重要指標，因此在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken組合設(shè)計，以多糖含量及感官品評得分為響應值，以初始含糖量、發(fā)酵溫度、接種量為自變量因素，進行響應面雙響應值聯(lián)合試驗，優(yōu)化枸杞果酒發(fā)酵工藝，應用Design-Expert 8.0.6數(shù)據(jù)分析軟件對影響因素進行分析，試驗結(jié)果見表3和表4。

由表4中的方差分析可知，兩個模型均極顯著（< 0.000 1），失擬項均不顯著，2Adj1= 0.978 1/2Adj2= 0.976 3，證明該模型擬合度較好，具有較高的參考價值。以枸杞多糖含量為響應值時，一次項、二次項和交互項AC、BC影響較為顯著，交互項AB對Y1沒有顯著性影響。由值可得各因子貢獻率為B > A > C，即接種量> 初始含糖量> 溫度。忽略影響不顯著因素，得到最終預測模型：1= 932.56+ 28.44+ 35.40–16.19+40.96+13.06– 72.362– 56.322– 48.982。以感官品評為響應值時一次項A、C，交互項AB，二次項B2影響極顯著，一次項B、交互項BC, 二次項A2及C2影響顯著，交互項AC對Y2沒有顯著性影響。由值可得各因子貢獻率為A > C >B，即初始含糖量>溫度>接種量。忽略影響不顯著因素，得到最終預測模型：

2= 86.62 + 2.95– 0.81– 1.81+ 1.65+ 1.52– 1.15 A2– 4.52 B2– 1.37C2

2.2.2 響應面分析 由各因素對指標影響的響應面及等高線結(jié)果（圖2）可知，Y1模型中AB交互作用不顯著，因此對AC、BC交互作用進行分析，當酵母接種量保持不變時，多糖含量隨溫度和初始含糖量的增加呈先上升后下降的趨勢，等高線呈橢圓形，曲面較為陡峭，交互作用顯著。Y2模型中交互項AB、AC的3D曲面圖的側(cè)面弧度顯示，酵母接種量與初始含糖量、溫度與接種量的弧度較大，且等高線均為橢圓形，說明交互作用顯著。

表4 回歸模型方差分析

圖2 各因素交互作用對多糖含量及感官品評的影響

Figure 2 Response surface and contour plots showing the interactive effects of polysaccharide content and sensory evaluation

保健價值與口感是影響消費者購買產(chǎn)品的兩個關(guān)鍵因素，應用響應面尋優(yōu)方法對回歸模型進行分析，選擇多糖及感官品評權(quán)重均為5，分別選擇兩響應值最大，最優(yōu)結(jié)果為初始含糖量227.85 g·L-1，接種量0.818×107cfu·mL-1，溫度21.49 ℃，枸杞多糖含量預測值為933.53 mg·L-1，感官品評得分為87.77分?？紤]實驗操作便捷性將發(fā)酵條件參數(shù)修改如下：初始含糖量230 g·L-1, 接種量0.8×107cfu·mL-1, 溫度21.5℃。在此條件下進行3次發(fā)酵體系為10 L的驗證實驗，枸杞多糖含量為（935.13 ± 7.95） mg·L-1，感官品評得分為（88.1 ± 0.4）分，實驗值與預測值接近，證明該模型較為可靠。

2.3 枸杞果酒理化指標檢測

采用最優(yōu)工藝條件發(fā)酵得到枸杞果酒成品，測定指標如表5所示。結(jié)果表明枸杞果酒的理化指標及微生物指標均符合國家標準。以市售三款枸杞果酒作為比較，測定其活性物質(zhì)含量，其中自釀果酒枸杞多糖及黃酮含量均遠高于市售樣品，基本達到預期目標。

2.4 枸杞果酒風味物質(zhì)分析

采用 SPME-GC-MS 對枸杞果汁及枸杞果酒中的揮發(fā)性香氣物質(zhì)進行定性及定量分析，枸杞果汁及果酒的 SPME-GC-MS 總離子流色譜圖見圖3。通過與NIST質(zhì)譜庫檢索及標準譜圖對比分析，共鑒定出枸杞果汁及果酒中揮發(fā)性化合物70余種，主要包括了酯類、醇類、醛類、酸類和酚類，共計5類風味物質(zhì)。枸杞果汁及果酒中風味物質(zhì)種類有較大差別，果汁的揮發(fā)性香氣物質(zhì)中醛類及酮類占比較高，大多數(shù)醛酮類化合物香氣描述以水果及生青味為主；枸杞果酒中香氣物質(zhì)主要以酯類及醇類兩種芳香族化合物為主，包括酯類37種，醇類 13種，醛酮類 6種，酸類 5 種。由此可知，酵母作為影響果酒發(fā)酵的關(guān)鍵因素，在發(fā)酵過程中形成了大量的酯類、醇類及酸類化合物，對果酒的香氣成分產(chǎn)生了較大影響，使果汁及果酒主體風味產(chǎn)生了差異。

表5 不同酒中活性物質(zhì)及理化指標及活性物質(zhì)含量比較

注：同一行字母表示顯著性差異(< 0.05)。“—”表示沒有檢測到。

（a）枸杞果汁；（b）枸杞果酒。

Figure 3 GC-MS total ion-current chromatogram of aroma compounds in wolfberry juice and wine

揮發(fā)性化合物在酒中的閾值決定了其對果酒的香氣貢獻程度，香氣活性值（OAV）表示香味物質(zhì)實際含量與閾值的比值，采用香氣活性值（OAV）可對化合物貢獻程度進行判定。若>1則認為該化合物對果酒主體風味有貢獻作用，且OAV值與其貢獻作用程度成正比[23]。對GC-MS檢測出的風味化合物進行定量分析，查找化合物閾值并計算OAV，將>1的化合物列出，如表6所示。

表6 枸杞果汁及枸杞果酒中香氣化合物含量及其OAV值

注: 閾值參考《化合物香味閾值匯編（第二版）》及文獻中報道的化合物香氣閾值；“NA”表示未檢測到。

由表6可知，枸杞果汁中＞ 1 的揮發(fā)性物質(zhì)共有 10種，包括3種酯類、2種醇類、3種醛類及2種酸類。其中正壬醇，苯乙醇及正辛醛對枸杞果汁香氣貢獻程度最大；3種醛類物質(zhì)雖然在果汁中含量較少但其閾值較低，對果汁主體香氣風格也有較大影響，賦予枸杞果實水果香及木質(zhì)香。枸杞果酒中＞ 1 的揮發(fā)性物質(zhì)包括5種酯類、4種醇類及2種酸類。在枸杞果酒中含量較高的酯類為乙酯類，有乙酸乙酯、己酸乙酯、異戊酸乙酯，賦予枸杞果酒清新的花草及果香味。醇類化合物是果酒中重要的助香化合物，也是酯類合成的前體物質(zhì)，由原料中蛋白質(zhì)、氨基酸和糖類在發(fā)酵過程中生成[28]。枸杞果酒中對香氣具有正面貢獻作用的醇類有正壬醇、苯乙醇、正丙醇、異戊醇，均為一些具有花果香的化合物。酸類化合物在果酒中可起到協(xié)調(diào)香氣、減少刺激感等輔助作用[29-30]，枸杞果酒中己酸及辛酸對酒體香氣風格具有一定的貢獻。雖然枸杞果酒中醛酮類物質(zhì)含量較少，但其在維持酒體風味平衡及協(xié)調(diào)香氣中起著不可或缺的作用。目前研究關(guān)于枸杞果酒香氣分析多為定性分析，王琦等[9]采用HS-GC-MS法對枸杞汁發(fā)酵前后香氣成分及其相對含量進行分析，在果汁及果酒種分別鑒定出13及32種化合物，這表明枸杞果汁經(jīng)過發(fā)酵作用風味物質(zhì)種類顯著增加，與此次研究結(jié)果相符。Ouyang等[31]研究表明，枸杞酒中酯類化合物含量較高，有異戊酸乙酯、己酸乙酯、乙酸乙酯、癸酸乙酯等，與本研究通過香氣活度值分析確定的酯類化合物相似，與果汁相比其含量的顯著增加賦予了枸杞果酒宜人的甜香及水果香。

3 結(jié)論

果酒生產(chǎn)流程中工藝條件對成品質(zhì)量有著至關(guān)重要的影響。本研究以寧夏枸杞為原料，通過單因素和響應面試驗確定枸杞果酒最佳發(fā)酵條件為SO2添加量20 mg·L-1，初始含糖量230 g·L-1，接種量0.8×107cfu·mL-1，溫度21.5 ℃靜置發(fā)酵6 d。在此最優(yōu)發(fā)酵工藝下，枸杞果酒的酒精度為（10.86 ± 0.14）%（vol），總糖為（5.84 ± 0.10）g·L-1，總酸為（6.12 ± 0.13）g·L-1。酒體呈金棕色略帶橘調(diào)，有明顯的枸杞果香，酸甜適中，風味較好，且枸杞多糖含量較高，具有一定的保健價值。通過SPME-GC-MS及香氣活度值（OAV）首次定量分析確定了枸杞果酒的特征性風味化合物，為枸杞果酒產(chǎn)品的研發(fā)及品質(zhì)把控建立了基礎(chǔ)。

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Optimization of fermentation process and analysis of aroma components in wolfberry wine

LI Manyi, ZHANG Yameng, LIU Chunfeng, ZHENG Feiyun, NIU Chengtuo, LI Qi, WANG Jinjing

(The Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122)

Using Ningxia wolfberry as the raw material, the effects of the initial sugar content, fermentation temperature, yeast inoculation amount and the content of SO2on the fermentation of wolfberry fruit wine were analyzed. On the basis of single factor test, the response surface methodology was used to optimize the fermentation process of wolfberry wine. The response value was determined by the content of wolfberry polysaccharide and sensory evaluation scores. The results showed that optimal fermentation process was as follows: initial sugar content of 230 g·L-1, inoculation volume of 0.8′107cfu·mL-1, and fermentation at 21.5 ℃ for 6 days. According to the result of SPME-GC-MS quantitative and odor activity value (OAV) under the optimal conditions, 11 kinds of substances including nonyl alcohol（283.51）, phenethyl alcohol（2.19）, isoamyl acetate（60.38）and ethyl isovalerate（2.67）are the main flavor compounds of wolfberry fruit wine. This study analyzed the characteristic aroma compounds in wolfberry wine for the first time, which will provide a scientific basis for the development and quality control of wolfberry wine products.

wolfberry wine; process optimization; response surface analysis; flavor substances

TS262.7

A

1672-352X (2021)05-0865-08

10.13610/j.cnki.1672-352x.20211022.003

2021-10-25 9:29:12

[URL] https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.S.20211022.1529.006.html

2020-12-31

國家自然科學基金項目（31771963）資助。

李曼祎，碩士研究生。E-mail：3314668547@qq.com

王金晶，副教授。E-mail：jjwang@jiangnan.edu.cn