張嘉偉 王健生 張廣健 付軍科 屈航英 張佳

食管癌是全世界最致命的惡性腫瘤之一[1]，自1970年以來，食管腺癌的發(fā)病率增加了350%，超過了其他所有實體惡性腫瘤[2-4]。食管癌因缺乏早期臨床癥狀，通常在晚期被診斷[1]。食管切除仍然是唯一根治性治療食管癌的方法[4]，術(shù)后吻合口瘺是食管癌患者手術(shù)后非常嚴重的并發(fā)癥。盡管當前外科從業(yè)者已經(jīng)開發(fā)了新的手術(shù)技術(shù)和新的生物材料以降低術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生及其引起的死亡，但是在食管癌患者進行根治性手術(shù)后，吻合口瘺仍然是常見的并發(fā)癥之一，術(shù)后吻合口瘺能夠引起嚴重的胸部或縱隔感染，這種并發(fā)癥仍然是與手術(shù)有關(guān)死亡的主要原因。吻合口瘺延長了住院時間，增加了費用，延長了后續(xù)治療的時間，且是術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)的獨立危險因素[5]。對于研究者來說，在選擇一種動物模型來重建和研究食管吻合口瘺時，必須進行與食管癌根治術(shù)后患者相似的重建。由于胃解剖學(xué)和血管與人類的類似性和可行性，目前使用的動物如大鼠[6]、兔[7-9]、犬[10]、 豬[11-13]作為建模動物是一種普遍現(xiàn)象。食管吻合口瘺動物模型的成功建立，模擬了食管癌根治性手術(shù)后發(fā)生食管吻合口瘺的病理生理過程，并為臨床醫(yī)生進行下一步的治療提供技術(shù)支持。

一、食管吻合口瘺的現(xiàn)狀

1. 術(shù)后食管吻合口瘺潛在危險因素

食管吻合口瘺的發(fā)生原因可以分為3大類：人體正常生理與解剖因素、圍手術(shù)期期間的環(huán)境以及外科操作相關(guān)因素。與食管吻合口痿發(fā)生有關(guān)的解剖學(xué)因素包括食管缺乏漿膜、食管肌層為內(nèi)環(huán)形外縱形，食管黏膜下層與外膜均為疏松結(jié)締組織形成，質(zhì)地脆弱。以上因素致使食管吻合時缺乏承受縫線的拉力，且食管外層肌纖維由于解剖原因恢復(fù)緩慢，客觀上加重了吻合口縫線的拉力。生理因素包括：由于胸腔縱隔內(nèi)壓力是負壓，這就容易促使消化道內(nèi)容物通過吻合口處進入縱隔內(nèi)形成吻合瘺口，在各種化學(xué)因子作用下，對瘺口周圍組織產(chǎn)生嚴重化學(xué)刺激，加上唾液中大量口腔厭氧菌協(xié)同作用，加速加重炎癥和繼發(fā)感染的進展，致使吻合口處吻合口瘺的發(fā)生并導(dǎo)致惡性循環(huán)。圍手術(shù)期因素表現(xiàn)在嚴重營養(yǎng)不良患者，術(shù)前血清白蛋白低容易發(fā)生吻合口瘺[14]。若患者伴有慢性疾病，例如肝硬化、肺部疾病等，使機體對于手術(shù)創(chuàng)傷的應(yīng)激反應(yīng)差，影響組織愈合。另外，術(shù)前新輔助化療是食管癌術(shù)后吻合口瘺的危險因素之一[15-17]。術(shù)后胃排空障礙也可能與發(fā)生吻合口瘺有關(guān)。決定吻合口瘺是否發(fā)生，外科操作技術(shù)因素更為重要[18]。食管癌根治術(shù)后患者并發(fā)癥的發(fā)生情況也與手術(shù)入路、術(shù)中吻合方式及位置有關(guān)，有研究報道經(jīng)右胸入路手術(shù)較左胸入路手術(shù)在降低吻合口瘺發(fā)生率方面更具優(yōu)勢，而且術(shù)后肺部炎癥發(fā)生率也相對較低[19]。此外，食管替代物的選擇、吻合口血供、張力等也是影響吻合口瘺的潛在危險因素[20]。

據(jù)報道，切除多器官合并癥[21-22]、肺功能下降、大網(wǎng)膜切除術(shù)以及長期使用類固醇與吻合口瘺的發(fā)展有關(guān)[23]。女性患者、腹腔鏡手術(shù)、術(shù)后白蛋白水平明顯降低和腎功能障礙被確定為獨立的危險因素[5]。而腫瘤分期、淋巴結(jié)分期、鄰近器官切除、吻合強化、淋巴結(jié)清掃數(shù)量、腫瘤浸潤性和早期腸內(nèi)喂養(yǎng)與吻合口瘺的發(fā)生沒有顯著相關(guān)性[24]。一項關(guān)于食管胃切除術(shù)動物模型中缺血調(diào)節(jié)時間對吻合口愈合的影響的研究表明，食管切除和食管胃造口術(shù)前的胃缺血調(diào)理可以減少炎癥和膠原的沉積，同時增加吻合口處新生的血管數(shù)量。在大鼠模型中，血管內(nèi)皮生長因子的表達和血管生成的增加已被證明能夠改善肌皮瓣的血流量和缺血調(diào)理后移植物的存活，改善吻合口的生理狀態(tài)，降低吻合口瘺的發(fā)生[4]。

2. 治療現(xiàn)狀

2.1 保守治療

吻合口瘺的保守治療對無癥狀且較小的食管瘺有相關(guān)的專家共識[25]，即以“三管一禁”為基礎(chǔ)，在禁水的前提下保證營養(yǎng)管、胃腸減壓管和胸腔閉式引流管的通暢。根據(jù)瘺口位置、大小及滲液引流情況來綜合考慮、密切觀察、隨時調(diào)整治療方案。保守治療一般包括通暢引流、抗感染治療、營養(yǎng)支持3大方面。通暢引流是指吻合口瘺發(fā)生后，明確積存液體位置，行有效的胸腔引流，減少吻合口化學(xué)刺激，促進愈合?？垢腥局委熓侵附o予足時足量的抗感染治療，來達到預(yù)防或治療目的。營養(yǎng)支持治療是術(shù)后吻合口瘺愈合的基礎(chǔ)，給予腸內(nèi)營養(yǎng)能夠促進腸道功能恢復(fù)，加快吻合口瘺的恢復(fù)與愈合[15]。

2.2 手術(shù)治療

對于修復(fù)較大的且保守治療失敗，尤其已合并縱隔胸腔、膿毒癥的食管吻合口瘺，目前治療方案仍存在爭議[26-27]。臨床上治療食管吻合口瘺的方法主要為內(nèi)鏡下治療吻合口瘺。近年來內(nèi)鏡下吻合口瘺修補術(shù)作為一種更便捷的治療選擇，其具有創(chuàng)傷小、手術(shù)時間短、耐受程度高等優(yōu)點，被臨床醫(yī)生逐漸接受[28]。目前國內(nèi)內(nèi)鏡下治療吻合口瘺的常用技術(shù)包括覆膜支架置入術(shù)、尼龍繩縫合術(shù)和鈦夾夾閉術(shù)[29]。覆膜支架置入術(shù)的技術(shù)成功率可達93%～100%，該技術(shù)是一種成熟度很高的治療方法，缺點是患者可出現(xiàn)支架移位、脫落等風(fēng)險[30-31]。尼龍繩縫合術(shù)采用鈦夾將尼龍繩固定在瘺口周圍通過收緊尼龍繩達到外科荷包縫合的效果以封閉瘺口，缺點是技術(shù)要求較高。國內(nèi)外報道了一種采用新型材料OTSC的鈦夾夾閉術(shù)，是一種具有修補面廣、吻合力可閉合消化道全層、定位精確、操作簡便等優(yōu)點的內(nèi)鏡技 術(shù)[29,32-34]。隨著介入、內(nèi)鏡和生物材料技術(shù)的不斷發(fā)展，國內(nèi)外也開展了一項新的內(nèi)鏡微創(chuàng)技術(shù)治療吻合口瘺——內(nèi)鏡下真空輔助閉合治療內(nèi)鏡下真空輔助閉合治療（endoscopic vacuum-assisted closure therapy，EVAC），臨床研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)食管吻合口瘺特別是合并有縱隔胸腔感染的可以應(yīng)用EVAC來治療，效果尤其顯著[35-42]。目前內(nèi)鏡微創(chuàng)技術(shù)發(fā)展迅速，是臨床治療消化道疾病的主要研究方向，也是治療吻合口瘺的主要方法之一。進行二次吻合口瘺修補手術(shù)，主要有單純瘺口修補術(shù)、吻合口重建術(shù)及食管曠置3種。目前相關(guān)文獻報道手術(shù)治療吻合口瘺的效果差異較 大[43]。張志宇等[44]治療的患者術(shù)后均出現(xiàn)不同程度的消化液外滲。Crestanello等[45]治療的患者術(shù)后均沒有再次出現(xiàn)吻合口瘺。手術(shù)療效優(yōu)于保守治療，故對能夠耐受再次手術(shù)者應(yīng)積極進行手術(shù)治療。再次手術(shù)的主要目的在于修補瘺口，徹底清除胸腔內(nèi)瘺出物以及膿性分泌物，保證引流管的暢通，減少毒性物質(zhì)的吸收，從而減輕患者臨床癥狀[9]，有利于吻合口瘺的恢復(fù)與愈合。

二、食管吻合口瘺動物模型的選擇

管狀胃為食管置換行之有效的導(dǎo)管。它是由較大的胃曲度產(chǎn)生的，需要進行大量的胃血運重建。因此，食管胃吻合術(shù)的血液供應(yīng)取決于敏感的顯微血管網(wǎng)絡(luò)。然而，吻合口愈合是一個涉及各種機制，如炎癥、血管生成、基質(zhì)合成和沉積、收縮和重塑復(fù)雜的過程[46-47]。因此，吻合的機械強度在手術(shù)損傷部位依賴于裂解、合成和膠原蛋白的成熟之間的平衡。而吻合口的機械強度決定了吻合口瘺動物模型建立的成功與否。

在對動物模型進行廣泛的研究后，在嚙齒動物中，食管胃解剖和血管與人類有相似性和可行性，因此，一些人選擇了大鼠模型進行食管胃吻合口瘺的動物模型[6]。但是嚙齒動物食管胃吻合口愈合的一個主要問題是食管腔很小。術(shù)后吻合口狹窄導(dǎo)致吞咽困難和營養(yǎng)不良。大鼠食管胃吻合腔的構(gòu)建促進反流和吸入性肺炎。因此，一些研究人員處理了這一技術(shù)困難，研究食管或胃傷口愈合作為食管胃傷口吻合口瘺的替代物[48-49]。

大型動物如豬、犬等，食管腔相對較大，采用側(cè)對側(cè)技術(shù)進行食管胃吻合術(shù)，可獲得更大的吻合腔，并保留正常的食管胃路，但由于其食管的解剖和血管情況與我們不同，這種操作需要技術(shù)極高的外科醫(yī)生來進行實驗才能保證較高的成功率[50]，并且大型動物如豬、狗等價格比較昂貴，依從性差，且麻醉程度較難掌控，反而增加了動物實驗的難度。術(shù)后吻合口狹窄會導(dǎo)致吞咽困難和營養(yǎng)不良，因此很難成功建立胃食管吻合口瘺，這些動物模型具有明顯的局限性。

食管吻合口瘺中的動物模型研究更頻繁地使用兔和大鼠模型，因此在基礎(chǔ)實驗研究中得到了廣泛的應(yīng)用。相對而言，兔模型相較嚙齒類動物具有更簡便的操作性、易于觀察等特點，且小動物的生理和免疫學(xué)與人類的差異更大；關(guān)于食管吻合口瘺大動物模型的建立的報道較少，并且其依從性、不可控因素相較兔模型更多。但是，探索大型動物的建立是必要的。

三、構(gòu)建方法

自1900年代初以來，使用和依賴動物模型研究基本生物學(xué)過程和疾病原因的人數(shù)一直穩(wěn)步增長。在105項諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎中，其中89項是通過動物研究獲得的醫(yī)學(xué)突破。因此，已經(jīng)提出了令人信服的理由來使用動物模型來理解疾病的病理生理學(xué)以及設(shè)計新的藥物和療法。

1. 兔食管切開吻合置管法

實驗動物為20只為成年健康的新西蘭大白兔6～10個月齡，體重為（2.5±0.5）kg。主要儀器：食管支架，實驗組所用新型食管可降解支架。建立動物吻合口瘺模型采用食管切開吻合置管造瘺法建立頸部食管吻合口瘺的動物模型。采取兔以3%的戊巴比妥鈉按1 mL/kg的劑量經(jīng)耳緣靜脈麻醉，密切觀察兔的呼吸頻率和節(jié)律，以防麻醉過度。將麻醉成功的兔取仰臥位固定，頸部正中切口，切開皮膚，分離筋膜層及肌肉層，沿氣管左側(cè)游離出食管，切開全層，置入外徑為8F橡膠管以形成食管吻合口瘺，同時將橡膠管沿食管管腔留置于空腸上段充當腸內(nèi)營養(yǎng)管，后逐層閉合切口，充分固定橡膠管。術(shù)后靜脈注射廣譜抗生素，停止經(jīng)口進食，經(jīng)橡膠管給予腸內(nèi)營養(yǎng)。每隔2天測一次體重，對于體重下降明顯者，予5%葡萄糖氯化鈉注射液耳緣靜脈緩?fù)?。建模?周，將留置的橡膠管取出，該研究成功構(gòu)建了具有食管吻合口瘺的實驗兔動物模型[51]。

2. 大鼠食管胃吻合口瘺法

實驗動物：30只雄鼠布朗-挪威大鼠，平均體重320 g，每籠飼養(yǎng)1只，在12 h光照/12 h黑暗循環(huán)和特定的無病原體條件下保持在21 ℃。主要儀器：數(shù)字手術(shù)顯微鏡。建立動物吻合口瘺模型，采用遠端食管胃切除術(shù)和胃管形成后的端到端食管胃吻合口處置入硅膠導(dǎo)管然后進行食管胃吻合口瘺的構(gòu)建。動物采仰臥位，腹部被剃須并消毒。用異氟醚（3%在氧氣混合物中，3 L/min）在氣體箱中誘導(dǎo)麻醉后，動物被持續(xù)的異氟醚麻醉（1.5%在氧氣混合物中，3 L/min）。用加熱燈將體溫維持在37 ℃。另外，皮下注射0.9%NaCl 10 mL，以防止動物術(shù)后脫水。圍手術(shù)期采用安乃唑110 mg/kg鎮(zhèn)痛。行上中位剖腹手術(shù)，進入腹腔。胃大彎解剖行胃松解術(shù)。切取胃短血管和胃左動脈及靜脈。保留胃、胃網(wǎng)膜右動脈和靜脈。解剖繼續(xù)向食管裂孔方向推進，腹食管顯露。在切除近端小彎、前胃和食管胃交界處后，使用連續(xù)縫合形成胃管。在食管遠端插入直徑為4 mm的硅膠導(dǎo)管以校準吻合口的寬度，然后使用連續(xù)縫合線進行食管胃內(nèi)端端吻合。檢測吻合口密封性后，拔除導(dǎo)管，關(guān)閉胃管，用5 mL溫生理鹽水灌洗，閉合腹部，肌筋膜、皮膚用縫線連續(xù)縫合。術(shù)后，允許動物自由籠養(yǎng)活動，并隨意給予水和牛奶。術(shù)后鎮(zhèn)痛采用口服安乃近（100 mg/d）。動物每天都被稱重，并觀察是否有疾病跡象。所有的手術(shù)由同一位外科醫(yī)生進行。該研究成功構(gòu)建了具有胃食管吻合口瘺的實驗大鼠動物模型[6]。

3. 豬吻合燒灼法

實驗動物：10頭雌性約克郡豬。建立動物吻合口瘺模型采用腹部正中切口，行胃食管吻合，然后使用電刀燒灼創(chuàng)建一個約1 cm的圓形缺口以達到吻合口瘺的構(gòu)建。動物頸背、胸腹部被剃光，皮膚被以無菌的方式準備，采用肌肉注射（IM）xylazine（2 mg/kg）和telazol（6 mg/kg）麻醉，其次是IM glycopyrolate（0.01 mg/kg）、長效四環(huán)素（9 mg/kg）和恩氟沙星（7.5 mg/kg）。用2.5%異氟醚對豬進行插管和維持，持續(xù)進行心電監(jiān)護，并用溫水循環(huán)浴和溫暖的乳酸林格溶液加熱。留置硅肺導(dǎo)管置于頸內(nèi)靜脈。豬在仰臥位，做垂直中線切口進入腹腔。解剖并暴露胃和食管，分離血管。用線性吻合器將近端胃分割到胃食管交界處的遠端。主食線的遠端最終將成為胃管道。為確保正確的定位，遠端短線被輕輕地縫在胃食管交界處的切割邊緣，以幫助在手術(shù)后期將導(dǎo)管向上拉入胸腔和胃。然后收腹，將豬變成左側(cè)臥位。后開胸術(shù)切開，利用肋骨擴張器進入胸部右側(cè)，解剖暴露在后縱隔的食管。此時，近端胃從遠端食管釋放，并在管道中進行單獨的胃切除術(shù)，以引入圓形吻合器。然后切除遠端食管的一段，包括胃食管交界處。砧固定在食管末端，并在食管和胃導(dǎo)管之間完成端至端21 mm圓形吻合。一個故意的前1 cm的缺陷，然后創(chuàng)建跨越圓形釘線使用燒灼。放置右側(cè)胸管，關(guān)閉右側(cè)開胸術(shù)。該研究成功構(gòu)建了具有胃食管吻合口瘺的實驗豬動物模型[52]。

四、模型評價方法

1. 臨床與影像學(xué)診斷

實驗兔食管切開吻合置管造瘺法建立食管吻合口瘺動物模型術(shù)后1周，經(jīng)耳緣靜脈將實驗兔麻醉，四肢及頭部固定，將留置的橡膠管取出，經(jīng)口插入導(dǎo)管，行X線下食管造影。經(jīng)導(dǎo)管注入泛影葡胺造影劑，緩慢推注，同時觀察攝影并攝片，進行保存，并對瘺口進行測量，造影顯示存在造影劑外溢，食管周圍見造影劑；自口腔注入亞加藍，從胸腔或縱隔引流管內(nèi)引流出染液為造模成功。胸部X線檢查提示液氣胸，特別是吻合口周圍存有液氣平面者。另外，反復(fù)X線檢查胸液量明顯增加，或本來無液氣平面而突然出現(xiàn)者，無論其多少都具有診斷價值。胸腔或縱隔引流管引出胸水呈灰褐色，有腥臭味者也可提示造模成功。X線造影作為食管癌術(shù)后吻合口瘺的常用檢查手段，具有簡便易操作、高敏感性的優(yōu)點，其診斷準確率可達93%[53-54]。

2. 宏觀診斷

實驗豬在術(shù)后5 d進行安樂死，在尸檢時，打開先前的開胸切口，檢查胸腔是否有唾液含量、胃內(nèi)容物、膿腫或蜂窩織炎形成的證據(jù)，確定食管胃吻合口瘺的形成。在術(shù)后第5天，所有存活的實驗大鼠都被過量麻醉劑安樂死，吻合段十二指腸管腔被直徑為5 mm的硅膠導(dǎo)管連接到輸液泵上，注入生理鹽水（0.9%NaCl），食管腔連接到數(shù)字測壓儀，吻合段被注入生理鹽水（2 mL/min）進行數(shù)字監(jiān)測，壓力增加的失效被確定為吻合口瘺的成功 構(gòu)建。

3. 病理生理診斷

切除包括吻合口在內(nèi)的1 cm食管段，立即放置在中性緩沖甲醛溶液中，標本固定后，石蠟切片用Masson三色染色進行顯微評價。組織病理學(xué)顯示黏膜下膠原沉積、肌層膠原沉積。食管壁組織HE染色示鱗狀上皮部分缺失、壞死，且可見一處增生并突起，內(nèi)主要為結(jié)締組織和少量肌纖維，病理示食管外縱肌肌纖維局部壞死溶解或肌纖維疏松，瘺口處可見老化的結(jié)締組織形成的瘢痕組織，瘺口處周圍炎癥反應(yīng)不明顯[9]。

解剖分離食管，觀察食管外膜可見到瘺口，周圍有充血區(qū)，瘺口周圍管壁增厚?？v行剖開食管，將食管鋪平可見食管內(nèi)膜瘺口存在，周圍稍隆起并有充血，未見明顯化膿壞死[9]。

五、小結(jié)

食管吻合口瘺是食管癌手術(shù)后最嚴重的并發(fā)癥之一，其治療仍是臨床難題。當下關(guān)于食管吻合口瘺的研究較多關(guān)注于臨床研究，重點側(cè)重于食管吻合口瘺的診斷與治療方法的選擇，對于吻合口瘺動物模型的建立及治療相關(guān)文獻報道較少。目前臨床研究者采用動物建立食管吻合口瘺模型，存在操作過程復(fù)雜、術(shù)后護理條件苛刻、動物依從性差、存活率低等問題，需要花費很多的精力及團隊人員去維護動物模型的建立與存活。但不能因此忽略動物模型在臨床研究中的重要性，動物模型仍然是生物醫(yī)學(xué)研究必不可少的工具。誠然，使用動物模型研究食管吻合口瘺存在局限性，但是這些研究可以促進食管癌術(shù)后病理學(xué)的研究，臨床吻合口瘺的診斷與治療藥物的動物實驗，并且為吻合口材料測試和可能的生物醫(yī)學(xué)成像提供研究資料。期待日后創(chuàng)建更具有綜合診斷意義的動物模型，為臨床工作提供快速有效的指導(dǎo)，提高臨床診斷準確率及敏感性的同時減少患者生活負擔(dān)，挽救更多患者生命，讓患者充分受益，這也是醫(yī)學(xué)工作者今后應(yīng)該研究探討的重點方向。