汪富文,羅小雨,王朝飛,楊 鴿,雷初朝,黨瑞華

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物科技學(xué)院,陜西 楊凌 712100)

脾臟由結(jié)締組織和淋巴組織組成，是一個復(fù)雜外周淋巴器官，具有高度組織化的區(qū)域和復(fù)雜的微循環(huán)系統(tǒng)。脾臟在動物機(jī)體中承擔(dān)著存儲免疫細(xì)胞、濾血和儲血的重要作用，全面了解脾臟的解剖學(xué)、生理學(xué)和發(fā)育，對于確定支持脾臟疾病和先天性變異的病理生理機(jī)制至關(guān)重要。隨著現(xiàn)代生命科學(xué)的發(fā)展，對于脾臟的研究越來越深入，研究者發(fā)現(xiàn)不同物種脾臟的大小、形狀和組織結(jié)構(gòu)有著明顯的差異。當(dāng)前對脾臟的研究主要集中在人類和模式動物上，家畜和其他哺乳動物上尚沒有特別深入，物種間脾臟的差異程度和具體功能仍然存在爭議，深入探究家畜脾臟的功能和生長發(fā)育的具體機(jī)制能夠有力地推動家畜抗病性狀的遺傳選育。本文系統(tǒng)總結(jié)了目前關(guān)于脾臟發(fā)育的知識及當(dāng)前研究中和脾臟發(fā)育有著密切聯(lián)系的基因，以期對哺乳動物脾臟的研究及家畜抗病育種提供一些參考資料。

1 脾臟的組織學(xué)結(jié)構(gòu)

脾臟主要由白髓(white pulp, WP)、紅髓(red pulp, RP)和邊緣區(qū)(marginal zone，MZ)3個部分組成[1]。這3個部分的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞組成都有較大的差異，在動物免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮著不同的作用。白髓約占脾臟體積的25%，其中密集地分布著各類淋巴細(xì)胞，白髓小室由含有較多T細(xì)胞的淋巴鞘和富含B細(xì)胞的濾泡組成。淋巴鞘在中央小動脈周圍分布較多而B細(xì)胞濾泡主要分布在血管分支處[2]。脾臟的紅髓由靜脈竇、髓索和動脈系統(tǒng)的終末支組成。髓索是一個巨噬細(xì)胞網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有相互連接的細(xì)胞質(zhì)突起。髓索和靜脈竇緊密相連，靜脈竇的結(jié)構(gòu)很特殊，由內(nèi)皮細(xì)胞通過應(yīng)力纖維連接到細(xì)胞外基質(zhì)形成。這些應(yīng)力纖維之間會形成縫隙，紅細(xì)胞必須通過這些縫隙才能重新進(jìn)入循環(huán)，這一獨(dú)特的結(jié)構(gòu)能夠阻止老化或受損的紅細(xì)胞通過，以便進(jìn)一步處理這些衰老損傷的紅細(xì)胞[3]。此外，這一機(jī)制也能適當(dāng)控制血液的流速。脾臟的先天免疫反應(yīng)主要發(fā)生在邊緣區(qū)，包括兩組特殊的巨噬細(xì)胞：邊緣區(qū)巨噬細(xì)胞形成外環(huán)，金屬嗜酸性巨噬細(xì)胞形成靠近白髓的內(nèi)環(huán)。邊緣區(qū)的巨噬細(xì)胞表達(dá)C型凝集素(DC-SIGN/SIGNR1)和清道夫受體(scavenger receptor)MARCO，這些物質(zhì)能與某些病原體如結(jié)核分枝桿菌和肺炎鏈球菌的多糖抗原結(jié)合，并使其消化降解[4-6]。

2 脾臟的主要功能

2.1 免疫功能

依賴于豐富的免疫細(xì)胞類型，脾臟既能完成吞噬細(xì)胞為主的非特異性免疫功能，又可以通過T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫和B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫完成機(jī)體的特異性免疫功能。脾臟還能夠產(chǎn)生T細(xì)胞和B細(xì)胞，在二次免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用。紅髓具有多種先天免疫細(xì)胞，可以作為免疫效應(yīng)器進(jìn)行免疫識別和應(yīng)答，但紅髓最主要的功能還是對血液進(jìn)行過濾，將有害物質(zhì)和衰老、損傷的紅細(xì)胞清除[7]。白髓區(qū)域是脾臟免疫功能的主要承擔(dān)者，淋巴鞘和濾泡在免疫反應(yīng)中共同作為免疫應(yīng)答的生發(fā)中心[8]。淋巴鞘分布有大量的T細(xì)胞，可以形成淋巴細(xì)胞并且產(chǎn)生漿細(xì)胞。濾泡含有較多的B細(xì)胞和其他參與免疫過程的細(xì)胞，參與抗原的呈遞和免疫應(yīng)答的發(fā)生[9]。

2.2 屏障功能

1986年，Weiss等[10]最先報道了與血-睪屏障類似的過濾機(jī)制，即血-脾屏障(blood-spleen barrier, BSB)，這一屏障對脾臟免疫功能的有序進(jìn)行起到了重要的支撐作用。血-脾屏障的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是脾臟紅髓特殊的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其主要的功能主要包括3部分：第一，阻止血液中病原體等有害物質(zhì)的進(jìn)入，同時攔截衰老損傷的紅細(xì)胞，適當(dāng)控制血液的流速；第二，向白髓區(qū)域呈遞抗原，促使免疫應(yīng)答的發(fā)生；第三，維持白髓內(nèi)部環(huán)境的相對穩(wěn)定，調(diào)節(jié)白髓的免疫功能[8]。

3 哺乳動物脾臟發(fā)育生理研究進(jìn)展

脾臟發(fā)生的標(biāo)志是背側(cè)中紋內(nèi)間充質(zhì)的凝結(jié)[11]，在小鼠中，脾臟大約在E10.5～11才能被檢測到，因?yàn)樵撾A段祖細(xì)胞開始在背側(cè)濃縮集聚，位置靠近胃和背側(cè)胰腺。鑒于在早期發(fā)育過程中脾臟和背側(cè)胰腺間充質(zhì)緊密相接，因此在E12.5～13之前很難從形態(tài)學(xué)上區(qū)分這兩種組織，往往只有使用脾臟和胰腺的標(biāo)記物才能準(zhǔn)確地去描述[12]。使用早期脾臟間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物對小鼠進(jìn)行原位雜交分析，發(fā)現(xiàn)了一些標(biāo)記基因，如Tlx1 (T-cell leukemia homeobox 1)、Nkx3-2 (NK3 homeobox 2)、Wt1 (WT1 transcription factor)、Tcf21 (transcription factor 21)、Nkx2-5 (NK2 homeobox 5)、Pbx1 (PBX homeobox 1)和Sox11 (SRY-box transcription factor 11)[13-18]，這些標(biāo)記基因能夠清楚地顯示脾臟早期發(fā)育的具體特征。脾臟起源于胚胎內(nèi)臟的中胚層，作為體內(nèi)最大的外周淋巴器官，當(dāng)脾臟組織發(fā)育完成時，其結(jié)構(gòu)和功能就會進(jìn)一步復(fù)雜化[19]。

脾臟作為重要的免疫器官，與家畜的抗病性狀有著密切的聯(lián)系，因此其發(fā)育生理及發(fā)育的具體機(jī)制也是動物育種的重要研究內(nèi)容。崇慶慶[20]將云南高峰牛和荷斯坦牛脾臟組織全基因組DNA甲基化作比較分析，篩選出9 474個差異甲基化區(qū)域，注釋到2 718個差異甲基化相關(guān)基因，為兩種牛的表型及抗病力差異研究奠定基礎(chǔ)。劉銀雪等[21]對非洲白犀牛的脾臟進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，確定了犀牛和其他動物之間的脾臟形態(tài)差異，并就其成因作了推測。譚雪芬等[22]在牦牛脾臟上也進(jìn)行了類似的形態(tài)學(xué)研究。關(guān)飛等[23]采集牦牛和普通黃牛的脾臟，從解剖學(xué)和組織學(xué)角度充分展示了牦牛和黃牛的脾臟生理學(xué)差異。在羊上，相關(guān)研究主要集中在羊脾臟基因和非編碼RNA的表達(dá)上，對于羊脾臟的發(fā)育及組織形態(tài)學(xué)研究還比較少。周熳琳等[24]探究了血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)在1歲藏羊脾臟的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)VEGF廣泛分布于藏羊脾臟組織中，可能對藏羊脾臟形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能的維持具有重要作用。兩例F17大腸桿菌感染的湖羊脾臟轉(zhuǎn)錄組研究充分展示了感染前后脾臟中l(wèi)ncRNA和circRNA的差異表達(dá)情況，對于家養(yǎng)動物的脾臟非編碼RNA研究具有重要的意義[25-26]。車天棟[27]以家豬5個不同生長發(fā)育時間點(diǎn)和3頭成年野豬及其他9種哺乳動物的脾臟組織為研究對象，利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)將39個樣本在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行研究，鑒定出大量差異表達(dá)的lncRNA，解釋了在不同生長發(fā)育階段豬脾臟的轉(zhuǎn)錄組水平差異。豬作為重要的模式動物之一，在轉(zhuǎn)錄組水平上研究其脾臟發(fā)育的過程也有助于我們更全面地了解哺乳動物脾臟發(fā)育的分子機(jī)制。不同物種或者同一物種不同品種脾臟轉(zhuǎn)錄水平研究主要反映其脾臟的功能差異[28]，能夠推動家畜抗病新品種選育及抗病性狀篩選的進(jìn)程。

4 脾臟發(fā)育關(guān)鍵基因研究進(jìn)展

通過基因敲除小鼠模型已發(fā)現(xiàn)了一些重要的脾臟發(fā)育基因，這些基因主要是編碼轉(zhuǎn)錄因子，控制脾臟的功能、形態(tài)發(fā)生和發(fā)育擴(kuò)張。敲除Tlx1的小鼠為脾臟發(fā)育的遺傳控制提供首個重要的范例[29]。由于間充質(zhì)細(xì)胞增殖減少[30]，Tlx1突變體胚胎的脾臟原基正常發(fā)育到E13.5時期后就停止了繼續(xù)發(fā)育，而Wt1缺失的胚胎中脾臟間充質(zhì)細(xì)胞凋亡會導(dǎo)致脾臟幾乎完全缺失[31]。除此以外，NKX2-3、NKX3-2和Pbx1[30-33]的表達(dá)也是脾臟發(fā)育所必需的，在動物脾臟發(fā)育過程中不可或缺。

4.1 NKX2-3和NKX3-2基因

NKX2-3基因編碼含有同源域的轉(zhuǎn)錄因子，其編碼的蛋白質(zhì)是同源域轉(zhuǎn)錄因子 NKX家族的成員。在小鼠中靶向破壞轉(zhuǎn)錄因子NKX2-3基因會導(dǎo)致腸道和脾臟發(fā)育異常。NKX2-3基因缺失小鼠要么是無脾的，要么是脾臟明顯縮小[34]，純合NKX2-3突變體會缺乏粘膜定位素細(xì)胞粘附分子-1(MAdCAM-1)，該分子通常在黏膜相關(guān)淋巴組織和脾臟中表達(dá)。NKX2-3是脾臟和粘膜相關(guān)淋巴組織中MAdCAM-1表達(dá)和淋巴細(xì)胞遷移所必需的[35]，并干預(yù)B淋巴細(xì)胞發(fā)育和分化[36]，脾臟血管系統(tǒng)的器官特異性模式由NKX2-3調(diào)節(jié)，其掌控著淋巴細(xì)胞歸巢機(jī)制和脾臟組織特異性的血液過濾能力[37]。除了對細(xì)胞和相關(guān)分子表達(dá)的影響，NKX2-3還會調(diào)控白髓的成纖維細(xì)胞亞群形成，進(jìn)而影響脾臟結(jié)構(gòu)發(fā)育[38]。

NKX3-2和NKX2-3同屬同源域轉(zhuǎn)錄因子NKX家族的成員。脾臟和胰腺的側(cè)向性依賴于一個特化的柱狀中胚層細(xì)胞層——內(nèi)臟中胚層板，這層細(xì)胞能夠使得脾-胰腺區(qū)域向左生長，而NKX3-2能調(diào)節(jié)胰腺側(cè)移所需的內(nèi)臟中胚層的功能[18]。該基因除了調(diào)控脾臟的發(fā)育，還同時影響著骨骼的生長[39]。

4.2 Pbx1基因

Pbx1基因編碼屬于轉(zhuǎn)錄因子PBX同源盒家族的核蛋白，已有研究證明Pbx1在多條途徑上都對脾臟發(fā)育進(jìn)行調(diào)控，在脾臟發(fā)生中起著核心的分級協(xié)同調(diào)節(jié)作用[30]。Pbx1敲除的小鼠表現(xiàn)為脾發(fā)育不全，大多數(shù)器官系統(tǒng)發(fā)育不正常，且在骨骼上也有缺陷，通常在E15.5/16.5就會死亡[40]。Pbx1的缺失導(dǎo)致脾間充質(zhì)祖細(xì)胞的NKX2-5表達(dá)下調(diào)，CDKN2B(cyclin dependent kinase inhibitor 2B)基因表達(dá)下調(diào)，從而擾亂細(xì)胞周期。去除Pbx1突變體中的CDKN2B基因可以在一定程度上挽救脾生長，因此，PBX/NKX2-5/p15調(diào)節(jié)模塊對脾臟發(fā)育至關(guān)重要，Pbx1作用的發(fā)揮必然是系統(tǒng)的，需要多個基因之間共同協(xié)作[41]。

4.3 Tlx1基因

該基因編碼一種核轉(zhuǎn)錄因子，屬于同源框基因的NKL亞家族。在胚胎發(fā)育過程中，編碼的蛋白質(zhì)是脾臟正常發(fā)育所必需的，缺失該基因的小鼠僅表現(xiàn)出脾臟發(fā)育不全的表型特征[15]。Tlx1依賴的維甲酸(retinoic acid, RA)代謝調(diào)節(jié)對脾臟器官發(fā)生至關(guān)重要。在小鼠模型中，在脾臟原基形成過程中Tlx1的缺失會調(diào)節(jié)幾個與RA代謝有關(guān)的基因從而增強(qiáng)RA信號，RA活性改變會導(dǎo)致間充質(zhì)細(xì)胞提前分化，脾原基血管生成減少，對Tlx1基因缺陷動物模型的RA信號的藥物抑制可一定程度上緩解脾發(fā)育缺陷的情況[42]。出生后骨髓外造血(extramedullary hematopoiesis, EMH)是造血干/祖細(xì)胞(hematopoietic stem/progenitor cells, HSPCs)在骨髓外發(fā)生分化，以應(yīng)對造血緊急情況的病理過程，Tlx1過表達(dá)可誘導(dǎo)EMH發(fā)生，并引起脾臟微環(huán)境的改變[43]。

4.4 Wt1基因

該基因編碼一個轉(zhuǎn)錄因子，在C端有4個鋅指基序，在N端有一個富含脯氨酸/谷氨酰胺的DNA結(jié)合域。Wt1的敲除小鼠表現(xiàn)為脾臟發(fā)育不全，且不能夠形成腎、心、膈肌和性腺等組織器官，一般在E15就會死亡[31]；幼年和成年小鼠敲除Wt1基因后短時間內(nèi)，小鼠就會出現(xiàn)腎小球硬化、胰腺和脾臟外分泌萎縮、骨骼和脂肪嚴(yán)重減少、紅細(xì)胞生成受阻等特征[44]。Wt1基因參與脾臟紅髓索內(nèi)的脾臟紅髓巨噬細(xì)胞暴露在血流中清除衰老的紅細(xì)胞的調(diào)節(jié)過程[45]。Wt1受到MIR-125a的調(diào)控，MIR-125a基因敲除小鼠會發(fā)展為骨髓、脾臟和外周血髓系細(xì)胞擴(kuò)張的骨髓增殖性疾病，并同時伴有泌尿生殖系統(tǒng)異常[46]。Wt1的表達(dá)還受到Barx1 (BARX homeobox 1)基因的調(diào)節(jié)，Barx1的缺失會導(dǎo)致胃和脾臟的發(fā)育缺陷，但是從機(jī)制上來說并沒有影響其他脾臟發(fā)育基因的表達(dá)，只特異性下調(diào)了Wt1表達(dá)量，進(jìn)而導(dǎo)致脾臟發(fā)育的異常[46]。

5 展 望

脾臟是一個極其重要的器官，其發(fā)揮的免疫功能是其他淋巴器官和造血器官所不能替代的。大量的研究已經(jīng)逐漸明晰人類和一些模式動物脾臟的結(jié)構(gòu)和功能，但是關(guān)于不同物種之間脾臟的結(jié)構(gòu)及具體功能的差異程度目前還沒有深入研究，許多脾臟發(fā)育的潛在機(jī)制仍然不明確。今后隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，利用先進(jìn)的測序技術(shù)來研究脾臟發(fā)育過程中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子并挖掘免疫關(guān)鍵基因，這或?qū)榧倚罂共∮N和人類脾臟疾病治療奠定基礎(chǔ)。