徐 碩，金鵬飛，徐文峰，吳學(xué)軍，姜文清(北京醫(yī)院藥學(xué)部，國家老年醫(yī)學(xué)中心，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院老年醫(yī)學(xué)研究院，藥物臨床風(fēng)險與個體化應(yīng)用評價北京市重點實驗室，北京 100730)

大豆異黃酮是以3-苯并吡喃酮為母核的化合物群，其中主要成分有6種，分別是大豆苷(daidzin)、黃豆黃苷(glycitin)、染料木苷(genistin)、大豆苷元(daidzein)、黃豆黃素(glycitein)和染料木素(genistein)[1-2]。大豆制品因加工方法不同，其中異黃酮含量存在差異，發(fā)酵大豆食品以不含糖苷異黃酮為主，配糖體異黃酮含量較低，而非發(fā)酵食品和大豆粉的異黃酮含量高于一般傳統(tǒng)大豆食品的2～3倍，以大豆苷和染料木苷為主[3]。大豆異黃酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)與人體內(nèi)分泌的雌激素雌二醇(E2)很相似，能在一定條件下表現(xiàn)出類似雌激素的生物活性，對內(nèi)分泌與代謝系統(tǒng)疾病具有良好的調(diào)節(jié)改善作用[4]，可預(yù)防心血管疾病、延緩衰老、降低乳腺癌和前列腺癌等疾病的發(fā)病率、緩解更年期雌激素分泌減少而引起的停經(jīng)期綜合征和骨質(zhì)疏松癥、抗氧化和降低膽固醇等[3，5-8]。因大豆異黃酮具有重要的生物活性，有必要對其進(jìn)行深入研究。本文對近年來中藥和食品中大豆異黃酮的分析方法進(jìn)行綜述。

1 大豆異黃酮的分析方法

1.1薄層掃描法 徐艷春等[9]利用薄層掃描法，建立了紅曲及其制劑血脂康中大豆苷元的含量測定方法。樣品用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇提取后過氧化鋁柱，用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇洗脫，將洗脫液蒸干，用氯仿-甲醇(2∶1)定容。以環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲醇(5∶4∶0.7)為展開劑，硅膠GF254預(yù)制板，UV 254 nm處觀察熒光淬滅斑點，結(jié)果大豆苷元與其他成分分離良好，可以定量。掃描條件為：測定波長λS=295 nm，參比波長λR=350 nm，雙波長反射法鋸齒掃描，線性化系數(shù)SX=7。結(jié)果顯示，大豆苷元點樣量在0.1～0.5 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率為98.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為5.00%。

周曉霞[10]建立了測定中藥葛根、粉葛中大豆苷元含量的薄層掃描法。樣品用甲醇提取，以硅膠G板為薄層吸附劑，展開劑為三氯甲烷-無水乙醇(10∶1)，在激發(fā)波長λex=260 nm處掃描大豆苷元色譜峰的熒光強度。結(jié)果顯示，大豆苷元的點樣量在0.048 8～0.244 0 μg范圍內(nèi)與其薄層熒光掃描色譜峰面積呈良好的線性關(guān)系，測得葛根、粉葛樣品中大豆苷元的含量分別為0.323%，0.059 8%。

1.2紫外分光光度法 張玉梅等[11]通過紫外分光光度法，建立了一種檢測食物中大豆異黃酮含量的快速分析方法。以金雀異黃素(即染料木素)為對照品，在其紫外最大吸收峰259 nm波長處測定大孔吸附樹脂法配合溶劑法提取制得的大豆異黃酮試樣的含量，結(jié)果試樣中總異黃酮的含量以金雀異黃素計算為38.7%，平均回收率為99.86%，RSD值為2.6%，適用于保健食品中大豆異黃酮的含量測定。

付鈺潔等[12]利用紫外分光光度法，建立了檢測大豆提取物中大豆異黃酮含量的快速分析方法。以葛根素為對照品，在其紫外最大吸收峰250 nm波長處測定，脫脂大豆粉樣品采用超聲波循環(huán)回流提取25 min，提取液經(jīng)高速離心，取上清液用蒸餾水稀釋后進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，葛根素質(zhì)量濃度在2.0～60.0 mg·L-1范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，樣品的平均回收率為99.87%，RSD值為1.04%。

1.3高效液相色譜(HPLC)法 Mitani K等[13]采用管內(nèi)固相微萃取結(jié)合HPLC技術(shù)(in-tube SPME-HPLC)，建立了自動在線檢測大豆苷元、染料木素、大豆苷和染料木苷的方法。管內(nèi)固相微萃取(SPME)是一種從水溶性樣品中提取有機化合物的新技術(shù)，通過樣品溶液的重復(fù)抽吸或噴射循環(huán)，將待分析成分直接從樣品中置于開放的管狀毛細(xì)管中。采用Zorbax Eclipse XDB-C8柱，以甲醇-水為流動相，梯度洗脫，檢測波長為255 nm，4種待測成分可在8 min內(nèi)完全分離。為優(yōu)化待測成分的提取工藝，對SPME參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。待測成分質(zhì)量濃度在5～200 ng·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r)大于0.999 9，檢測限為0.4～0.5 ng·mL-1，平均回收率高于97%。該方法可成功應(yīng)用于大豆食品的分析。

王劍波等[14]建立了測定槐角提取物中染料木素含量的HPLC法。樣品采用甲醇超聲提取，采用Luna C18柱，流動相為甲醇-水(60∶40)，檢測波長為260 nm，結(jié)果顯示，染料木素質(zhì)量濃度在40.2～201.0 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，平均回收率為98.93%，RSD值為0.81%。

蘇菊等[15]應(yīng)用HPLC法建立了測定保健食品中大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素含量的方法。采用Waters Spherisorb ODS-2柱，以甲醇-冰醋酸水溶液(40∶60)為流動相，檢測波長為254 nm，結(jié)果顯示，4種成分均在1～50 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率為85%～110%。

鄭玲等[16]建立了測定峨嵋葛根中染料木素的HPLC法。采用Kromasil C18柱，流動相為甲醇-20 mL·L-1乙酸(47∶53)，檢測波長為254 nm，結(jié)果顯示，染料木素質(zhì)量濃度在4.07～40.72 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率為102.3%，RSD值為0.76%。

Wang L J等[17]采用HPLC法測定了豆豉中的大豆異黃酮的含量，比較了加工過程中不同氯化鈉用量對豆豉中大豆異黃酮含量和組成的影響。樣品中加入體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇，以索氏提取法提取，采用Dikma Diamonsil C18柱，流動相為1 mL·L-1乙酸-乙腈(含1 mL·L-1乙酸)，梯度洗脫，檢測波長為254 nm。結(jié)果表明，當(dāng)氯化鈉含量為100 g·L-1時，生大豆中有61%異黃酮損失，在發(fā)酵前和發(fā)酵后分別損失43%，18%。雖然在豆豉加工過程中預(yù)處理不會對總異黃酮含量產(chǎn)生影響，但異黃酮的組成會發(fā)生改變，苷元含量增加，而相應(yīng)的β-葡萄糖苷、丙二酰葡萄糖苷和乙酰葡萄糖苷含量降低，以苷元形式存在的異黃酮在發(fā)酵后超過總含量的90%。

吳向陽等[18]建立了能同時測定野葛的根、莖及葉中葛根素、大豆苷和大豆苷元的HPLC法。樣品用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇超聲提取，采用Hypersil ODS-2色譜柱，流動相為甲醇-水，梯度洗脫，檢測波長為250 nm。葛根素、大豆苷和大豆苷元質(zhì)量濃度分別在11.87～73.91，1.00～6.48，0.28～1.53 μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，最低檢出限分別為0.43，0.24，0.18 μg·mL-1，平均回收率分別為99.78%，102.61%，105.57%。該方法測得葛根中葛根素、大豆苷和大豆苷元含量分別為3.98%，0.36%，0.039%，高于藥典中提取方法的提取率。葛莖中葛根素、大豆苷和大豆苷元含量分別為0.004%，0.003 2%,0.000 7%，葛葉中葛根素、大豆苷和大豆苷元含量分別為0.001 6%，0.005%，0.001 2%。

李艷艷等[19]建立了能同時測定豆類中大豆苷、大豆苷元、染料木苷和染料木素4種大豆異黃酮成分含量的HPLC法。樣品用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇超聲提取，采用Phenomenex C18柱，流動相為乙腈-2 mL·L-1甲酸，梯度洗脫，檢測波長為260 nm。結(jié)果4種成分的線性范圍為0.167～33.300 μg，平均回收率在98.95%～100.02%范圍內(nèi)，RSD值在0.89%～1.58%范圍內(nèi)。

蔣明哲等[20]利用HPLC法測定大豆制品類保健食品中染料木素和大豆苷元的含量。樣品用體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇提取，采用ODS-C18柱，流動相為甲醇-水(45∶55)，檢測波長為260 nm，染料木素和大豆苷元分別在8.0～100.0，1.0～80.0 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率分別為98.5%,98.1%。

王曉娟等[21]建立了能同時測定大豆提取物中6種大豆異黃酮即大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素含量HPLC法，采用Welchrom C18柱，以甲醇-水-乙腈(35∶65∶8)(磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.6～3.0)為流動相，檢測波長為254 nm。結(jié)果顯示，各成分的線性關(guān)系良好，平均回收率在100.45%～102.75%范圍內(nèi)，RSD值在1.10%～1.89%范圍內(nèi)。

李艷等[7]建立了能同時測定河北黃豆、豆腐、豆豉等7種豆類及豆制品中染料木苷、染料木素和大豆黃素含量的HPLC法。采用Platisil ODS柱，以甲醇-水(5.5∶4.5)為流動相，檢測波長為260 nm。結(jié)果顯示，染料木苷、大豆黃素和染料木素分別在11.47～172，5.33～80，8.26～124 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率分別為98.9%，98.7%，99.4%，RSD值分別為0.3%，1.8%，2.9%。

張嘯環(huán)等[22]考察了用不同輔料炮制淡豆豉對其大豆異黃酮含量的影響。淡豆豉樣品利用發(fā)酵法進(jìn)行制備，色譜柱為Hanbo C18柱，流動相為甲醇∶水∶冰醋酸(40∶60∶0.5)，檢測波長為260 nm。結(jié)果顯示，大豆苷與染料木苷分別在0.03～0.17，5.22～31.32 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均加樣回收率分別為99.4%，99.3%，RSD值分別為0.81%，0.96%。以大豆苷為考察指標(biāo)，輔料為青蒿、桑葉、人參和淫羊藿時，3種樣品含量差異較小，與青蒿、桑葉比較，淫羊藿和人參為輔料發(fā)酵的淡豆豉含量略低；以染料木苷為考察指標(biāo)，與青蒿、桑葉比較，淫羊藿為輔料發(fā)酵的淡豆豉含量略有升高，人參為輔料發(fā)酵的淡豆豉含量明顯升高。

楊艷等[23]建立了能同時測定納豆中大豆苷、大豆黃苷、染料木苷、大豆素、大豆黃素和染料木素6種大豆異黃酮含量的HPLC法。通過考察不同的樣品前處理方法，用正交實驗設(shè)計確定最佳提取條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，提取時間為60 min，提取溫度為60 ℃,料液比為1∶50 g·mL-1。采用Agilent Eclipse plus-C18柱，以甲醇-5 mL·L-1乙酸為流動相，梯度洗脫，檢測波長為254 nm。結(jié)果顯示，6種成分的線性關(guān)系良好，大豆苷、大豆黃苷、染料木苷、大豆素、大豆黃素和染料木素的檢出限分別為0.037，0.034，0.028，0.019，0.026，0.025 μg·mL-1，平均回收率在95.5%～102.8%范圍內(nèi)。

曹明艦等[24]建立了測定豆?jié){中的大豆苷、染料木苷和大豆苷元3種大豆異黃酮含量的HPLC法，對不同豆水比的豆?jié){前處理條件進(jìn)行優(yōu)化，將干豆?jié){粉用體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇在50 ℃條件下超聲提取30 min，采用C18柱，流動相為甲醇-2 mL·L-1醋酸(1∶1)，檢測波長為260 nm。結(jié)果顯示，3種成分線性關(guān)系良好，大豆苷、染料木苷和大豆苷元的平均回收率分別在98.98%～104.44%，99.16%～104.42%，102.01%～106.65%范圍內(nèi)。

張鵬等[25]建立了能測定千斤拔藥材中染料木苷和染料木素含量的HPLC法。樣品用體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇加熱回流提取，色譜柱為Kromasil 100-5 C18柱，以乙腈-1 mL·L-1磷酸為流動相，梯度洗脫，檢測波長為260 nm。結(jié)果顯示，染料木苷和染料木素質(zhì)量濃度分別在17.483～279.720,4.088～65.406 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，平均回收率分別為104.27%，97.16%，RSD值分別為2.61%,5.54%。不同產(chǎn)地千斤拔藥材中染料木苷和染料木素的含量有明顯差異，所建立的方法為千斤拔藥材的質(zhì)量評價與開發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。

鄧青等[26]利用HPLC法對黑豆汁制何首烏、生何首烏、清蒸制何首烏中的大豆苷元進(jìn)行定量分析。采用Diamonsil C18柱，流動相為甲醇-2 mL·L-1磷酸-乙腈(2∶6∶2)，測定波長為254 nm。結(jié)果顯示，大豆苷元在1.65～16.56 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，平均回收率為 98.72%，RSD值為1.54%。黑豆汁制何首烏大豆苷元含量為12.34±1.26 mg·g-1，在生何首烏、清蒸制何首烏中未檢測出大豆苷元。該方法可有效區(qū)分黑豆制何首烏與其他炮制品，從而對制何首烏進(jìn)行質(zhì)量評價與鑒別。

1.4超高效液相色譜(UPLC)法 王華林[27]建立了能快速測定大豆中染料木素、大豆苷元、大豆苷和染料木苷含量的UPLC法。樣品中加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇超聲提取，提取液經(jīng)濃縮后，用乙腈-2 mL·L-1乙酸溶解，用UPLC法分析。采用Acquity BEH C18色譜柱，流動相為乙腈-2 mL·L-1乙酸，梯度洗脫。結(jié)果顯示，4種大豆異黃酮的線性范圍均在1.0～9.0 μg·mL-1范圍內(nèi)，平均回收率在97.8%～98.7%范圍內(nèi)，RSD值在1.3%～2.1%范圍內(nèi)。

柴川等[28]建立了能同時測定淡豆豉中大豆苷元、黃豆黃素和染料木素3種異黃酮苷元的UPLC法。采用Acquity BEH C18色譜柱，流動相為乙腈-1 mL·L-1甲酸(24∶76)，樣品經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇提取后，用UPLC-UV分析，檢測波長為260 nm。結(jié)果顯示，3種成分均可在5 min內(nèi)完全分離并實現(xiàn)定量分析，大豆苷元、黃豆黃素和染料木素在相應(yīng)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率分別為 100.5%，99.06%,97.84%。

1.5液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)法 陳岑等[29]建立了以加速溶劑萃取-高效液相色譜-電噴霧-離子阱質(zhì)譜(ASE-HPLC-ESI-IT/MS)聯(lián)用技術(shù)分析淡豆豉中大豆異黃酮類化合物的方法。采用加速溶劑萃取儀，淡豆豉用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇提取，色譜柱為XAqua C18柱，以乙腈-1 mL·L-1甲酸為流動相，梯度洗脫。離子阱質(zhì)譜分別采用正、負(fù)離子模式下掃描，鑒定淡豆豉中的大豆異黃酮類成分，結(jié)果共鑒定出9種結(jié)合型糖苷類大豆異黃酮化合物。

Lee M J等[30]建立了能快速分離、鑒定和定量分析大豆和大豆制品中12種異黃酮成分的高效液相色譜-電噴霧-飛行時間-質(zhì)譜(LC-ESI-TOF-MS)法。根據(jù)各化合物的準(zhǔn)分子離子、鈉或鉀加合物離子、碎片離子、同位素離子的準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)據(jù)，對大豆異黃酮進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。采用Symmetry C18柱，以甲醇-0.5 mL·L-1甲酸為流動相，梯度洗脫，正離子模式掃描，結(jié)果大豆制品中的12種不同異黃酮可在12 min內(nèi)實現(xiàn)完全分離、鑒定和定量分析。結(jié)果顯示,測定成分在0.01～20.00 mg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r2> 0.992)，檢測限為10～40 ng·mL-1，定量限為3～132 ng·mL-1。所建立的方法無明顯的基質(zhì)效應(yīng)，能夠作為同時測定大豆異黃酮的有效分析方法。

馮薇等[31]采用MTT比色(MTT)法對淡豆豉和黑豆乙醇提取物進(jìn)行促大鼠顱骨成骨細(xì)胞增殖活性研究，并通過高效液相色譜-二極管陣列檢測-電噴霧-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-DAD-ESI-MS/MS)技術(shù)分析兩者的化學(xué)成分。采用Agilent Eclipse Plus-C18柱，流動相為乙腈-5 mL·L-1甲酸，梯度洗脫，檢測波長為261 nm，電離源為電噴霧離子源(ESI)，正離子方式檢測。結(jié)果顯示，淡豆豉和黑豆乙醇提取物對大鼠成骨細(xì)胞的促增殖率分別為 36.5%，28.2%，主要有效成分為異黃酮類化合物，經(jīng)LC-MS分析，鑒定出15個黃酮類成分。黑豆發(fā)酵成淡豆豉后的成分變化主要體現(xiàn)在由苷類成分脫糖轉(zhuǎn)化為苷元，含量顯著增加的大豆苷元和染料木素2種苷元主要是由丙二酰大豆苷和丙二酰染料木苷脫丙二?；推咸烟寝D(zhuǎn)化而來。

2 結(jié)語

目前中藥和食品中大豆異黃酮的分析測定方法包括薄層掃描法、紫外分光光度法、HPLC法、UPLC法和LC-MS法，主要以定量分析為主，其中HPLC法是大豆異黃酮定量分析中使用最為廣泛的技術(shù)，具有分離性能高、分析長度快和定量準(zhǔn)確的優(yōu)勢。薄層掃描法具有分離效能高、快速、簡便等特點，但其精密度、準(zhǔn)確度和重復(fù)性不如HPLC法。紫外分光光度法的優(yōu)點是儀器設(shè)備簡單、操作簡便、靈敏度高，但其準(zhǔn)確度相對不高。

HPLC的常用檢測器為二極管陣列檢測器(DAD)，色譜柱采用C18柱，流動相多采用甲醇-水、甲醇或乙腈-乙酸溶液系統(tǒng)，也有少部分采用甲醇-水-乙腈、甲醇-磷酸溶液-乙腈三相系統(tǒng)，檢測波長通常選擇250～260 nm，樣品多采用體積分?jǐn)?shù)為70%或80%的甲醇或乙醇提取。與HPLC法相比，UPLC法具有分析時間短、實驗效率高等特點，但在大豆異黃酮的定量分析中應(yīng)用相對較少。LC-MS法將色譜對復(fù)雜樣品的高分離能力與質(zhì)譜具有高選擇性、高靈敏度及能提供相對分子質(zhì)量與結(jié)構(gòu)信息的優(yōu)點結(jié)合起來，可在短時間內(nèi)對樣品中的大豆異黃酮進(jìn)行定性和定量分析。雖然大豆異黃酮的分析方法取得了一定進(jìn)展，但也存在一些問題。現(xiàn)有研究大多數(shù)是對中藥和食品中的1～6種大豆異黃酮進(jìn)行定量，不能全面評價藥材質(zhì)量，需要加強同時對更多種指標(biāo)成分進(jìn)行定量分析的研究，實現(xiàn)對樣品中主要大豆異黃酮成分和微量成分的同時定量分析。對大豆異黃酮成分的分析方法進(jìn)一步深入研究，對中藥和食品的質(zhì)量控制具有重要意義。