楊信強(qiáng)，陳鋒，閆乾，范曉茜，梁雄欽，高森

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，南寧 530001； 2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院脊柱外科，南寧 530001)

腰椎管狹窄癥是導(dǎo)致下腰痛的常見原因之一[1]。自1913年埃爾斯伯格首次描述黃韌帶肥厚導(dǎo)致腰椎管狹窄癥及其相關(guān)神經(jīng)癥狀以來，黃韌帶肥厚已被確定為引起腰椎管狹窄癥的主要原因之一[2]。相關(guān)研究表明，增生的黃韌帶表現(xiàn)為退化或彈性纖維的丟失以及膠原纖維的增加、鈣化、骨化和軟骨間變性[3]。黃韌帶肥厚是一種與年齡、活動(dòng)水平和機(jī)械應(yīng)力程度密切相關(guān)的多因素疾病[4]。轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)是黃韌帶肥厚變性過程中的主要因子[5]。有研究表明，TGF-β1是組織纖維化發(fā)病的關(guān)鍵因素，在腰椎管狹窄癥的增生性退行性黃韌帶組織中高表達(dá)[6]。然而，TGF-β1與黃韌帶肥厚之間的分子生物學(xué)機(jī)制，尤其是與黃韌帶細(xì)胞中膠原蛋白表達(dá)的關(guān)系尚不完全清楚[7]。

近年來有研究發(fā)現(xiàn)，肥厚的腰椎黃韌帶細(xì)胞中結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)表達(dá)水平高于正常黃韌帶細(xì)胞[6]。CTGF作為促纖維化因子參與黃韌帶組織纖維化過程，如細(xì)胞增生、轉(zhuǎn)移、黏附和細(xì)胞外基質(zhì)積累[8]。據(jù)報(bào)道，CTGF還參與TGF-β1的生物活性，如TGF-β1與CTGF結(jié)合已被證明可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)組分的合成[9]。TGF-β1還可誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞中CTGF信使RNA(messenger RNA,mRNA)的表達(dá)。因此，TGF-β1/CTGF信號(hào)通路在黃韌帶增生肥厚過程中發(fā)揮重要作用，但TGFβ1/CTGF信號(hào)通路調(diào)控分子的作用機(jī)制目前仍不清楚?，F(xiàn)就TGF-β1/CTGF信號(hào)通路在黃韌帶肥厚中的作用機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 TGF-β1/CTGF信號(hào)通路概述

TGF-β1/CTGF信號(hào)通路是人體細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要通路之一，在人體各組織器官的纖維化過程中均起重要作用。如在肝損傷過程中，肝細(xì)胞活化會(huì)導(dǎo)致TGF-β1合成增加，隨著纖維化程度加重，可在各種多形肝結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)CTGF過量產(chǎn)生[10]。在卵巢疾病，如卵巢囊腫周圍組織纖維化過程中，同樣發(fā)現(xiàn)TGF-β1、CTGF及細(xì)胞外基質(zhì)等因子表達(dá)升高[11]。在肺纖維化過程中，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)干擾素γ-1b可明顯降低TGF-β1和CTGF的mRNA表達(dá)，從而改善肺組織的纖維化程度[12]。在黃韌帶細(xì)胞中，TGF-β1可促進(jìn)CTGF表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維的表達(dá)升高[13]。

1.1TGF-β1/CTGF信號(hào)通路 黃韌帶纖維化是一個(gè)復(fù)雜的過程，機(jī)械損傷、缺氧和年齡增加等均可激活各種引起黃韌帶纖維化的信號(hào)通路，TGF-β1是一種廣泛存在于人體組織細(xì)胞的纖維化因子，參與黃韌帶組織損傷修復(fù)、纖維化增生肥厚的病理過程[14]。TGF-β1可促進(jìn)黃韌帶間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生膠原纖維，特別是對(duì)Ⅱ型膠原的生成發(fā)揮重要作用。而CTGF作為TGF-β1信號(hào)通路的重要下游效應(yīng)分子，對(duì)促進(jìn)黃韌帶細(xì)胞的增生和膠原纖維的合成發(fā)揮重要作用[6]。TGF-β1/CTGF信號(hào)通路間主要有兩條轉(zhuǎn)導(dǎo)通路：①TGF-β1/Smads/CTGF信號(hào)通路，該通路主要通過TGF-β1激活Smads依賴和非依賴途徑進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，繼而Smads蛋白將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核內(nèi)，激活CTGF的啟動(dòng)基因，在細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄成mRNA，并在胞質(zhì)中合成CTGF相關(guān)蛋白，進(jìn)一步對(duì)纖維化相關(guān)信號(hào)進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)；②TGF-β1/促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)/CTGF信號(hào)通路，其包含胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)1、ERK2、p38、c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)4條通路。目前研究認(rèn)為，黃韌帶纖維化與p38 MAPK通路關(guān)系密切，4條通路之間可相互抑制、相互協(xié)同，共同調(diào)節(jié)TGF-β1/MAPK/CTGF信號(hào)通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[15]。因此，在黃韌帶肥厚過程中TGF-β1/Smads/CTGF信號(hào)通路和TGF-β1/MAPK/CTGF信號(hào)通路共同參與TGF-β1/CTGF信號(hào)通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在黃韌帶肥厚增生和纖維化過程中發(fā)揮重要作用。

1.2TGF-β和CTGF信號(hào)分子 目前研究發(fā)現(xiàn)TGF相關(guān)的分子共有5種亞型：TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4和TGF-β5，但在哺乳動(dòng)物體內(nèi)僅發(fā)現(xiàn)3種確定的結(jié)構(gòu)亞型：TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3[15]。TGF-β1、TGF-β2在骨骼中占比較高，而TGF-β3在間充質(zhì)干細(xì)胞分化形成的細(xì)胞中比例較高[13]，從結(jié)構(gòu)上分析，這3種亞型的結(jié)構(gòu)存在一定同源性，而且在功能上存在一定的相關(guān)性。TGF-β1是損傷修復(fù)過程中作用最顯著的因子之一。TGF-β1是與人體免疫系統(tǒng)相關(guān)，由體內(nèi)的免疫和非免疫細(xì)胞通過分泌的方式產(chǎn)生的一種多肽，其分泌方式分為自分泌和旁分泌等，該物質(zhì)具有“激素樣活性”的特征和屬性[14]。TGF-β1的結(jié)構(gòu)是同質(zhì)二聚體的形式且無活性，同時(shí)，TGF-β1可與前體相關(guān)的蛋白結(jié)合，使其與細(xì)胞表面受體相結(jié)合從而介導(dǎo)生物學(xué)效應(yīng)[16]。

TGF-β1與CTGF之間可相互影響，CTGF是TGF-β1下游的效應(yīng)分子。盧昌懷等[6]研究首次發(fā)現(xiàn)在黃韌帶發(fā)生損傷早期，黃韌帶細(xì)胞釋放的TGF-β1可對(duì)CTGF發(fā)揮調(diào)控作用，TGF-β1通過影響CTGF的表達(dá)協(xié)同促進(jìn)黃韌帶增生和纖維化，外源性TGF-β1可促進(jìn)CTGF、膠原纖維的表達(dá)。而加入CTGF阻斷劑后，CTGF及膠原蛋白的表達(dá)水平均下降。因此認(rèn)為，在機(jī)械應(yīng)力導(dǎo)致的微損傷情況下，黃韌帶細(xì)胞通過釋放TGF-β1促進(jìn)CTGF蛋白表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)膠原蛋白的生成，導(dǎo)致黃韌帶組織纖維化。曹延林[13]研究發(fā)現(xiàn)，抑制CTGF蛋白表達(dá)可降低細(xì)胞外基質(zhì)中Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白和纖維連接蛋白水平，同時(shí)TGF-β1的表達(dá)也降低，因此認(rèn)為CTGF的表達(dá)水平影響TGF-β1在黃韌帶細(xì)胞中的功能，兩者相互影響。有研究認(rèn)為，大多數(shù)TGF-β1的表達(dá)涉及一定水平的CTGF參與，如細(xì)胞外基質(zhì)成分的刺激，成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖，以及傷口愈合和纖維化等[17-18]。CTGF被認(rèn)為是目前纖維化因子中成纖維活性最強(qiáng)的因子之一，TGF-β1對(duì)CTGF表達(dá)的調(diào)控是Smads蛋白家族和MAPK蛋白家族共同參與的結(jié)果[19]。

1.3TGF-β1/Smads/CTGF信號(hào)通路 目前Smads蛋白家族被認(rèn)為至少包含9個(gè)成員，分別是Smad1～Smad8以及Smad10，根據(jù)功能不同可分為受體激活型(R-Smad)、受體通用型(Co-Smad)和受體抑制型(I-Smad)三種。R-Smad包含Smad1/2/3/5/8，Co-Smad包含Smad4/10，而I-Smad包含Smad6/7[20]。Smads家族蛋白對(duì)纖維增生的形成和細(xì)胞外基質(zhì)沉積有促進(jìn)作用，與纖維增生性瘢痕中的過度增殖、分化、遷移和凋亡等生理病理過程密切相關(guān)[21]。Smads家族蛋白是TGF-β1下游的一種重要信號(hào)分子，可在TGF-β1的作用下進(jìn)行激活，將TGF-β1分子信號(hào)通過細(xì)胞表面的受體傳遞至細(xì)胞核內(nèi)[22]。一般認(rèn)為TGF-β1/Smads是一種簡單、線性的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

TGF-β1/Smads/CTGF信號(hào)通路是TGF-β1發(fā)揮生物效應(yīng)的一條重要通路，TGF-β的作用是通過細(xì)胞質(zhì)Smads蛋白的磷酸化來介導(dǎo)[23]。TGF-β家族蛋白通過與兩對(duì)跨膜激酶、Ⅰ型和Ⅱ型受體的四聚體細(xì)胞表面復(fù)合物結(jié)合啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[24]。TGF-βⅡ型受體可識(shí)別并結(jié)合TGF-β，但無法激活Smad2/3，而Smad2和Smad3是參與TGF-β信號(hào)通路的主要分子，TGF-βⅠ型受體能激活Smad2/3，但不能結(jié)合TGF-β，因此，TGF-β先與TGF-βⅡ型受體結(jié)合，通過Ⅱ型受體激活Ⅰ型受體，進(jìn)而通過胞質(zhì)Smad2/3的磷酸化進(jìn)行介導(dǎo)，為TGF-β的蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)提供基礎(chǔ)[25]。有研究發(fā)現(xiàn)，在CTGF的啟動(dòng)子上存在Smads蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，提示Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能參與TGF對(duì)CTGF表達(dá)的調(diào)節(jié)[15]。

1.4TGF-β1/MAPK/CTGF信號(hào)通路 除激活Smads信號(hào)通路外，TGF-β1還能激活MAPK通路中的成員和其他相關(guān)酶[26]。MAPK通路參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及肥厚等病理生理過程，同時(shí)在創(chuàng)傷愈合過程中也發(fā)揮重要作用。MAPK通路激活機(jī)制的一個(gè)重要線索是可被蛋白酪氨酸磷酸酶CD45或蛋白絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶PP2A滅活[27]。MAPK可將細(xì)胞外膜刺激產(chǎn)生的信號(hào)通過跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)傳遞至細(xì)胞核內(nèi)，從而在細(xì)胞的基因表達(dá)、增殖、分化以及對(duì)外部環(huán)境的應(yīng)激中發(fā)揮重要作用[28]。機(jī)械創(chuàng)傷、活性氧類等均可促進(jìn)MAPK通路激活[29]。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，CTGF的表達(dá)受到MAPK通路的調(diào)控。MAPK信號(hào)通路是TGF-β1進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的另一條重要通路。目前在哺乳動(dòng)物的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)4條與MAPK相關(guān)的信號(hào)通路：ERK1、ERK2、p38、JNK通路；前3條通路是促纖維活性信號(hào)，而JNK通路則是抑制纖維活性功能的信號(hào)[30]。ERK1通路在MAPK通路研究中是最早被發(fā)現(xiàn)的信號(hào)通路，也是 MAPK已知通路中最主要的信號(hào)通路，ERK信號(hào)通路主要由5種蛋白激酶(ERK1～5)構(gòu)成，目前研究最廣泛的為ERK1/2。多種細(xì)胞外刺激可激活ERK信號(hào)通路，激活途徑主要是Ras、Raf、絲裂原活化ERK(mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase，MEK)、ERK。Ras是Raf的上游激活蛋白，當(dāng)多種細(xì)胞外刺激(如機(jī)械損傷、活性氧類及炎癥因子刺激)激活ERK通路后，Ras開始活化并與其受體結(jié)合，進(jìn)一步激活細(xì)胞膜上的Raf。激活后的Raf與信號(hào)通路中的“樞紐”MEK結(jié)合，磷酸化MEK后激活MEK。MEK活化后磷酸化TEY基，使ERK活化。而活化后的ERK轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，激活相關(guān)核酸和轉(zhuǎn)錄因子，通過影響細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)調(diào)節(jié)細(xì)胞功能[31]。ERK2信號(hào)通路是最新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)MAPK通路，Schwebs等[32]研究發(fā)現(xiàn)，ERK2缺乏會(huì)導(dǎo)致葉酸和cAMP趨化性的完全喪失，表明ERK2在MAPK信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中不可或缺，Ras/Raf可能參與ERK2通路的調(diào)節(jié)。JNK通路存在3種亞型：JNK1、JNK2及JNK3。JNK通路又被稱為應(yīng)激活化蛋白激酶信號(hào)通路，可以被多種應(yīng)激因子激活，如脂多糖、腫瘤壞死因子-α、氧化應(yīng)激?；罨蟮腏NK進(jìn)入細(xì)胞核與轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合，參與相應(yīng)基因的表達(dá)[33]。

2 TGF-β1/CTGF信號(hào)通路在黃韌帶肥厚中的作用機(jī)制

在黃韌帶增生肥厚過程中各種因素均可導(dǎo)致TGF-β1和CTGF高表達(dá)，兩者又協(xié)同促進(jìn)黃韌帶細(xì)胞中膠原纖維的表達(dá)。其中TGF-β1/Smads/CTGF和TGF-β1/MAPK/CTGF信號(hào)通路在黃韌帶增生、肥厚過程中發(fā)揮重要作用，尤其是p38 MAPK通路目前被認(rèn)為是調(diào)控CTGF表達(dá)的關(guān)鍵通路，對(duì)選擇性阻斷TGF-β1/MAPK/CTGF信號(hào)通路、抑制黃韌帶肥厚增生發(fā)揮重要作用。

2.1TGF-β1和CTGF在黃韌帶肥厚中的作用機(jī)制

2.1.1TGF-β1與黃韌帶肥厚 在黃韌帶細(xì)胞中，由于脊柱的機(jī)械應(yīng)力刺激，TGF-β1被激活，活化的TGF-β1與其受體相結(jié)合，通過特定的異四聚體受體復(fù)合物發(fā)出信號(hào)，激活經(jīng)典的Smads信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路以及一些小的GTP酶活化，進(jìn)而激活纖維化基因表達(dá)，如編碼細(xì)胞外基質(zhì)和平滑肌肌動(dòng)蛋白相關(guān)基因[34]，這些基因的表達(dá)導(dǎo)致膠原蛋白表達(dá)增強(qiáng)，特別是Ⅱ型膠原纖維的蓄積增生，而Ⅱ型膠原纖維的顯著增生可能是導(dǎo)致黃韌帶增生、肥厚的重要原因之一[35]。目前TGF-β1在黃韌帶組織發(fā)生纖維化過程中的作用機(jī)制以及在損傷、炎癥以及纖維化過程中的分子機(jī)制尚不完全明確[7]。

2.1.2CTGF與黃韌帶肥厚 CTGF是富含半胱氨酸的基質(zhì)蛋白，參與生物細(xì)胞的調(diào)控過程。近來研究發(fā)現(xiàn)，在腰椎肥厚的黃韌帶中CTGF高表達(dá)，且在黃韌帶肥厚進(jìn)程中發(fā)揮重要作用，盧昌懷等[6]將正常黃韌帶組織和發(fā)生增生肥厚的黃韌帶組織細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞外基質(zhì)培養(yǎng)并進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，增生肥厚組中的CTGF水平高于正常組，且CTGF的表達(dá)水平與增生肥厚程度呈正相關(guān)。CTGF是一種促纖維化因子，參與人體多種組織器官的纖維化過程，同時(shí)也參與新生血管形成、組織創(chuàng)傷修復(fù)等[36]。

2.2TGF-β1/Smads/CTGF信號(hào)通路與黃韌帶肥厚 Smads通路在黃韌帶組織損傷的修復(fù)、愈合以及瘢痕形成中扮演重要角色，是細(xì)胞纖維化過程中TGF-β1進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要通路。當(dāng)黃韌帶細(xì)胞受到機(jī)械應(yīng)力等因素刺激時(shí)，可通過自分泌或旁分泌的形式釋放TGF-β1，活化的TGF-β1通過與特定的受體相結(jié)合激活Smads信號(hào)通路，Smad2/3被激活后，將信號(hào)由細(xì)胞膜外轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核內(nèi)，Smads蛋白通過結(jié)合CTGF的啟動(dòng)子激活CTGF蛋白表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)膠原蛋白生成，當(dāng)黃韌帶細(xì)胞受到過度刺激時(shí)，CTGF出現(xiàn)過表達(dá)，最終導(dǎo)致黃韌帶增生和纖維化[37]。但并非所有細(xì)胞CTGF的表達(dá)均通過Smads信號(hào)通路應(yīng)激上調(diào)。有研究發(fā)現(xiàn)，Smads通路作用廣泛，特異性不明顯[38]。

2.3TGF-β1/MAPK/CTGF信號(hào)通路與黃韌帶肥厚

p38 MAPK通路被認(rèn)為是MAPK的經(jīng)典通路，在TGF-β1調(diào)控CTGF的過程中特異性最顯著[39]。p38 MAPK一般位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，p38 MAPK通路主要參與細(xì)胞核的作用，主要體現(xiàn)在細(xì)胞生長、凋亡過程中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。同時(shí)在細(xì)胞的炎癥調(diào)控和應(yīng)激反應(yīng)也發(fā)揮重要作用[40]。

當(dāng)各種因素(如機(jī)械應(yīng)力、年齡增長、微損傷)刺激使黃韌帶發(fā)生退變時(shí)，黃韌帶細(xì)胞中的TGF-β1增加，導(dǎo)致TGF-β1激活Smads信號(hào)通路，進(jìn)一步促使Smad2/3活化?；罨蟮腟mad2/3是TGF-β激活激酶1的上游激酶，TGF-β激活激酶1被激活后進(jìn)一步激活MAPK激酶6/MAPK激酶3，從而激活p38 MAPK信號(hào)通路。p38 MAPK被激活后形成磷酸化p38 MAPK，其具有多種細(xì)胞功能，如參與多種轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化、細(xì)胞表面受體的表達(dá)、多種蛋白的合成和細(xì)胞骨架重構(gòu)等。磷酸化p38 MAPK進(jìn)一步活化，形成p38 MAPK，最終使細(xì)胞信號(hào)通過p38 MAPK通路傳遞至細(xì)胞核內(nèi)[41]。由于MAPK信號(hào)通路的激活和Smads蛋白的磷酸化可相互獨(dú)立發(fā)生，TGF-β1調(diào)節(jié)CTGF表達(dá)的過程可能是Smads通路和MAPK通路共同作用的結(jié)果。

在黃韌帶肥厚的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中，p38 MAPK通路一旦被抑制可直接影響TGF-β1/MAPK/CTGF信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。曹延林[13]在研究p38 MAPK通路介導(dǎo)的腰椎黃韌帶肥厚增生實(shí)驗(yàn)中，通過對(duì)不同MAPK信號(hào)通路進(jìn)行阻斷，發(fā)現(xiàn)ERK和JNK通路阻斷后，CTGF mRNA、Ⅰ型膠原mRNA和Ⅲ型膠原 mRNA表達(dá)不受影響，而加入p38阻斷劑后，上述3種mRNA的表達(dá)水平受到明顯抑制，說明p38 MAPK通路是影響TGF-β1調(diào)控CTGF表達(dá)的關(guān)鍵通路。而加入TGF-β1后受到抑制的CTGF表達(dá)再次上調(diào)，說明在黃韌帶細(xì)胞中TGF-β1通過p38信號(hào)通路調(diào)節(jié)CTGF的表達(dá)。但需要注意的是，該實(shí)驗(yàn)中可能有其他信號(hào)通路參與TGF-β1對(duì)CTGF的上調(diào)，如Smads信號(hào)通路。

3 小 結(jié)

在人腰椎黃韌帶細(xì)胞損傷修復(fù)、增生肥厚以及瘢痕形成過程中，TGF-β1/Smads/CTGF和TGF-β1/MAPK/CTGF信號(hào)通路均參與黃韌帶細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，促使CTGF表達(dá)增加，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)(如膠原蛋白、纖維連接蛋白和糖蛋白)的產(chǎn)生，引起黃韌帶細(xì)胞纖維化，從而導(dǎo)致黃韌帶細(xì)胞肥厚退變。由于Smads通路作用廣泛，特異性較差，目前研究普遍傾向于通過阻斷p38 MAPK通路選擇性地抑制CTGF蛋白表達(dá)，推測敲除p38 MAPK基因或使用p38 MAPK特異性阻斷劑阻斷p38 MAPK信號(hào)通路可減少CTGF蛋白以及相關(guān)膠原纖維等的產(chǎn)生，從而減少黃韌帶細(xì)胞肥厚的發(fā)生。