尹祥佳

（蘭州職業(yè)技術學院，甘肅蘭州 730070）

馬鈴薯栽培始于1730年的歐洲和北美洲，由于馬鈴薯具有營養(yǎng)豐富，糧、菜、飼兼用，抗逆性強，生長周期短，單產高，深加工種類豐富，經濟效益好，農民增產增收潛力大等特點，種植馬鈴薯的國家和地區(qū)多達156個。我國是最大的馬鈴薯生產國，栽培面積和總產量均為世界前列，分別占30%和24%左右[1]。2020年我國馬鈴薯種植面積穩(wěn)定在533.33萬hm2以上，全國馬鈴薯鮮薯產量達到1億t，在決勝脫貧攻堅中發(fā)揮了重要的作用。馬鈴薯在甘肅省糧食生產和農村經濟發(fā)展中具有重要地位，甘肅省定西市已建成為全國最大的脫毒種薯繁育基地、全國重要的商品薯生產基地、全國重要的薯制品加工基地、全國馬鈴薯產業(yè)的重要科技研發(fā)推廣中心、全國馬鈴薯產業(yè)區(qū)域品牌重要命名地。

根據(jù)我國馬鈴薯生產的實際需求和不同種植區(qū)域面臨的主要問題，選育抗逆（旱、鹽、凍）、抗病、品質優(yōu)良、薯形好、商品率高、加工專用型、高產馬鈴薯品種為基本育種目標。2015年我國啟動了馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略，成為繼玉米、水稻、小麥的又一主糧作物。因此，通過分子育種技術與常規(guī)育種相結合，選育馬鈴薯優(yōu)良品種，大力發(fā)展馬鈴薯產業(yè)鏈，有利于糧食生產安全，有利于促進農民種植增產增收，對加快農業(yè)農村區(qū)域經濟發(fā)展和農業(yè)現(xiàn)代化，實現(xiàn)鞏固拓展脫貧攻堅成果同鄉(xiāng)村振興有效銜接，促進鄉(xiāng)村振興具有重要的戰(zhàn)略意義。

1 馬鈴薯種質資源與育種目標

作物種質資源是指攜帶遺傳信息的載體，具有實際或潛在育種價值，是支撐農業(yè)科技原始創(chuàng)新和作物育種的物質基礎[2]。我國馬鈴薯種質資源研究起步較晚，1934年從英國引入并篩選出卡它丁、七百萬、紅紋白和King Eward 4個品種，有計劃地開始了馬鈴薯引種和資源收集工作。20世紀50年代黑龍江省克山試驗站從東德、波蘭引入推廣了8個品種，其中Mira、Epoka、Aguila和Anemone等品種在生產上發(fā)揮了較大作用。20世紀70年代后期，我國開展了大規(guī)模的馬鈴薯品種征集、整理工作，使許多具有優(yōu)良基因型的地方品種得以保存。此外，還引入外國馬鈴薯種質資源，不斷拓寬國內馬鈴薯種質資源多樣性。1983年完成的《全國馬鈴薯品種資源編目》收錄了馬鈴薯種質資源832份，國外種質貢獻率為89.2%。1984年國際馬鈴薯中心（CIP）與中國農業(yè)科學院簽署了科技合作協(xié)議，1985年建立了CIP北京聯(lián)絡處，合作開展“馬鈴薯資源鑒定、篩選、評價和利用項目”，定期從CIP引入各種群體選擇材料，篩選具有特殊優(yōu)良性狀的基因型用于國內馬鈴薯育種。據(jù)統(tǒng)計，從1978-1991年，CIP向中國提供馬鈴薯資源2052份，其中試管苗398份、塊莖426份、實生種1228份。20世紀90年代以來，我國引進了一些專用型品種、育種材料和雜交組合，如中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所通過執(zhí)行國際合作項目，分別從歐美國家和CIP引進各類專用型品種70多個、雜交組合600多個、2n配子材料和野生種材料200多份。目前，我國馬鈴薯種質資源保存量為5000份[3]。利用近緣栽培種和野生種材料，擴大遺傳背景，促進了馬鈴薯新品種的選育，提高了育種效率，但我國馬鈴薯種質基因庫遺傳基礎仍很狹窄，尤其油炸型馬鈴薯品種較少，生產上種植品種主要是大西洋和夏菠蒂等品種。因此，系統(tǒng)開展馬鈴薯種質資源的收集、研究、評價工作就顯得非常重要。馬鈴薯種質資源的評價體系分為表型和基因型，表型鑒定主要包括農藝性狀、產量性狀、品質性狀、適應性、穩(wěn)定性、豐產性以及抗逆性等綜合評價[4]；基因型鑒定較多使用SSR和SNP標記，近年來，借助二代測序技術進行全基因組水平基因型鑒定，有效促進了馬鈴薯種質資源評價和基因挖掘工作。馬鈴薯育種工作的核心是創(chuàng)造、重組遺傳變異，選擇符合育種目標的個體并繁育成新品種，而育種方法的成效取決于其創(chuàng)造變異的水平。20世紀50年代到70年代末，馬鈴薯育種經歷了從國外引進雜交種鑒定篩選、自主雜交選育鑒定，陸續(xù)培育出了一些馬鈴薯品種，經過3～4次的品種更新?lián)Q代，逐步減輕了晚疫病、病毒病等的發(fā)生，單產也不斷提高，但存在育成品種親本單一、遺傳背景狹窄的問題。到了20世紀80年代，采用馬鈴薯新型栽培種的輪回選擇，篩選了一批綜合性狀良好的抗病、優(yōu)質種質材料，豐富了馬鈴薯育種的基因庫，促進了近緣栽培種間的雜交育種?；ǚ叟囵B(yǎng)或誘導技術使四倍體栽培種產生雙單倍體，為利用二倍體野生種和近緣栽培種遺傳資源提供了育種方法。后續(xù)主要開展了馬鈴薯引種馴化與系統(tǒng)育種、雜交育種、誘變育種。引進國外優(yōu)良野生和栽培品種、地方品種群體種進行系統(tǒng)育種，是最為簡便的選育方法。

2 馬鈴薯分子育種技術應用

2.1 馬鈴薯功能基因克隆隨著基因組測序技術的迅速發(fā)展，主要農作物的基因組測序取得了突破，建立起了基于連鎖分析、全基因組關聯(lián)分析、比較基因組學、基因表達等一系列的克隆基因的新方法，極大促進了控制作物重要農藝性狀新基因發(fā)掘與功能研究。2011年馬鈴薯基因組完成測序，推動了馬鈴薯育種研究進程。目前，已經克隆了一些功能基因，例如：馬鈴薯塊莖形成相關基因StSP6A、StCO、StCDF1[5]，抗旱耐鹽相關基因StNAC2[6]、StCPD[7]、SnRK2[8]，耐凍相關基因SAD、FAD2[9]、StvacINV1[10]，品質相關基因StNCED1[11]和信號傳導調控相關基因StTPS[12]、StDHN[13]，為開展馬鈴薯產量性狀、塊莖發(fā)育、抗逆、抗病和品質等相關基因研究，開發(fā)基因新標記提供了理論基礎。

2.2 基因工程基因工程育種在馬鈴薯遺傳研究、種質資源發(fā)掘與創(chuàng)新等領域廣泛應用，拓寬了馬鈴薯的遺傳基礎。20世紀80年代開始，我國有條件的育種單位先后開展了抗青枯病基因轉移、病毒外殼蛋白基因介導、蛋白質基因轉化以及某些病原基因文庫構建方面的研究。利用基因工程主要培育抗蟲、抗病、抗除草劑、品質改良、耐低溫糖化等馬鈴薯育種材料，此外，有研究報道了鹽生草耐旱基因的發(fā)掘[14]以及鹽生草HgNHX1基因啟動子的克隆及功能驗證[15]，這為利用外源抗逆基因培育馬鈴薯新材料提供了思路。因此，通過選擇特殊逆境脅迫生長的植物，發(fā)掘特殊逆境相關基因，轉化馬鈴薯栽培種，為常規(guī)育種提供相應的抗性轉基因育種材料提供了新途徑。

2.3 分子標記技術分子標記技術發(fā)展水平在很大程度上決定了生物遺傳與育種研究的廣度和深度。分子標記是DNA標記，與傳統(tǒng)的形態(tài)學標記、生化標記和細胞學標記相比，具有位點數(shù)量多、多態(tài)性高、遺傳穩(wěn)定和不受環(huán)境限制等特點[16]。DNA標記一般有3類：第1類是以Southern為核心，代表性技術為限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）；第2類是以PCR為核心，如隨機擴增多態(tài)性DNA（RAPD）、簡單重復序列（SSR）、擴增片段長度多態(tài)性（AFLP）；第3類是核苷酸多態(tài)性（SNP）。DNA標記在馬鈴薯種質資源遺傳多樣性分析、QTL定位及遺傳圖譜構建、親緣關系鑒定、分子標記輔助選擇等方面具有廣泛的應用。此外，許多目標性狀基因的功能標記與目標性狀基因緊密連鎖，應用SNP分子標記可以對目標性狀進行關聯(lián)分析。因此，通過測序開發(fā)高通量的SNP標記用于馬鈴薯基因組選擇育種以及預測候選基因和全基因組關聯(lián)分析將是重要研究方向。

2.4 轉錄組學轉錄組是轉錄后所有mRNA的總稱。轉錄組測序可以有效排除看家非編碼RNA干擾，通過一次測序獲得細胞內幾乎所有重要基因的表達參數(shù)。高通量轉錄組測序技術能夠在單核苷酸水平對任意物種的整體轉錄活動進行檢測，提供最全面的轉錄組信息，結合生物學信息分析，獲得更高效的有用信息。有報道以馬鈴薯抗旱材料隴薯3號為試驗材料，提取干旱處理不同時間和對照材料葉片的總RNA，進行Solexa高通量測序分析，獲得并驗證了2個與干旱逆境脅迫的響應候選基因ERF1和ATHB12[17]。因此，轉錄組學為揭示馬鈴薯抗逆境機理和發(fā)掘抗逆基因提供了新方法。

2.5 MicroRNAsMicroRNAs（miRNAs）是一類在生物體內普遍存在的非編碼、長度約16～29nt的小分子RNA。通過對植物miRNAs預測和驗證表明植物體在逆境脅迫下，上調或下調相關miRNAs表達，參與植物逆境生理調節(jié)。此外，植物miRNA還能夠調控植物生長發(fā)育及miRNAs和siRNAs的生物合成和功能，參與植物信號轉導、病害和環(huán)境脅迫響應。隨著植物miRNAs研究的不斷深入，開發(fā)出了許多植物miRNAs數(shù)據(jù)庫，包含大量已發(fā)表的植物miRNAs信息。用生物信息學方法在全基因組預測特定植物物種新miRNAs，構建小RNA cDNA庫進行高通量測序以及小分子RNA高通量測序來發(fā)現(xiàn)新的miRNAs，并通過Northern雜交、miRNA芯片、miRNAs Real-time RT-PCR等方法加以驗證。采用數(shù)據(jù)庫信息分析和降解組測序來預測miRNAs靶基因。目前，關于馬鈴薯microRNAs相關性研究報道有干旱[18]、塊莖低溫糖化[19]、次生代謝[20]、耐凍抗氧化[21]、微型薯[22]。因此，馬鈴薯逆境脅迫相關miRNAs的發(fā)現(xiàn)，驗證其在生長發(fā)育過程中的生物學功能、作用機制與調控途徑，并預測相關miRNAs的靶基因，構建過表達載體加以驗證將成為研究熱點領域。

2.6 基因編輯技術作物遺傳改良上應用的基因組編輯技術主要包括ZFNs、TALENs和CRISPRCas系統(tǒng)3種類型。其中CRISPR-Cas系統(tǒng)包括CRISPR-Cas9、CRISPR-Cpf1、CRISPR-C2c1和CRISPR-C2c2等亞類型，CRISPR-Cas9應用較多[23]。CRISPR-Cas9基因編輯技術是基于細菌或古細菌CRISPR介導的獲得性免疫系統(tǒng)衍生而來，由一段RNA通過堿基互補配對識別DNA，指導Cas9核酸酶切割識別的雙鏈DNA，誘發(fā)同源重組或非同源末端鏈接，進而實現(xiàn)在目的DNA上進行編輯，并于2013年和2015年兩次入選美國《科學》評選的十大科學突破。CRISPR-Cas9基因編輯技術已在人細胞系、酵母、果蠅、線蟲等有關基因完成編輯[24]，而在作物育種中的作用機制是抗性、基因敲除、激活或者抑制靶基因3種方式，在擬南芥、水稻、煙草、蘋果、玉米等植物中有效利用[25]。CRISPR-Cas9蛋白和gRNA組裝成的核糖核蛋白復合體（RNP）被應用于小麥、玉米的DNA-free基因編輯[26]。有研究報道利用RNP實現(xiàn)了馬鈴薯的DNA-free基因編輯，研究人員選取合成直鏈淀粉的關鍵酶，顆粒結合型淀粉合成酶（GBSS）作為靶標，通過原生質體分離、轉染和分化等步驟將RNP導入馬鈴薯，2%～3%株系的所有4個GBSS等位基因全部突變，完全消除了酶活性[27]。張筱[28]利用CRISPR-Cas9技術構建了編輯StCRK1基因的2個載體，StCRK2基因的1個載體，為研究馬鈴薯CRK基因功能奠定了基礎。因此，基因編輯技術為馬鈴薯中靶基因定向突變提供了新的途徑，將成為創(chuàng)新馬鈴薯育種材料新的研究領域，為馬鈴薯精準分子育種提供新思路。

3 馬鈴薯分子育種技術展望

馬鈴薯優(yōu)良品種培育一直是育種學家努力的方向。目前馬鈴薯分子育種技術為選育抗病、抗旱、耐低溫糖化、品質改良和專用型品種馬鈴薯提供了新的思路和方法。在充分挖掘馬鈴薯種質資源的基礎上開展分子育種研究，同時與常規(guī)育種相結合，加強科研院所和企業(yè)的科研攻關，為馬鈴薯育種提供理論依據(jù)和技術支持。不斷選育適合國內不同生態(tài)條件的專用型品種和符合市場需求的優(yōu)良品種，為培育馬鈴薯新品種提供有效路徑和支撐點，能夠有效保障馬鈴薯增產、穩(wěn)產、豐產，服務農業(yè)現(xiàn)代化和鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略。