李東梅， 楊雅雯， 黨喜同， 左東川

（西南醫(yī)科大學心血管醫(yī)學研究所，醫(yī)學電生理學教育部重點實驗室，四川瀘州646000）

低鉀血癥（血清鉀濃度低于3.5 mmol/L）是常見的電解質紊亂之一，可導致心律失常，危及生命［1-3］。心肌細胞靜息狀態(tài)下的膜電位呈現(xiàn)超極化，是維持心肌細胞正常興奮性和傳導性的必要條件。心肌細胞在靜息狀態(tài)下主要開放背景鉀離子通道，因此心肌細胞的靜息膜電位接近鉀離子平衡電位（約-80 mV）。根據(jù)Nernst 方程，當細胞外鉀離子濃度（extracellular K+concentration，［K+］e）降低時，細胞內鉀離子外流增強，心肌細胞靜息膜電位應處于超極化狀態(tài)，例如小鼠和大鼠的心肌細胞［4-5］。但以往在成人心肌細胞及羊和狗浦肯野纖維的研究表明，當［K+］e降低時，心肌細胞靜息膜電位呈現(xiàn)異常去極化（約為-40 mV）［6-10］。盡管這一異常的電生理現(xiàn)象與低鉀血癥誘發(fā)的心律失常密切相關，但其具體分子機制仍不明確。

雙孔鉀通道是近年發(fā)現(xiàn)的一類新型鉀離子通道超家族，包含15 個亞型。雙孔鉀通道屬于背景鉀離子通道，參與細胞靜息膜電位的維持［11-14］。TWIK-1雙孔鉀通道屬于雙孔鉀通道家族，是從人類腎組織中克隆出的第一個雙孔鉀通道亞型［15］。盡管TWIK-1通道在心肌細胞高度表達，但其調控心肌細胞電生理特性的病理生理意義尚不明確。雙孔鉀通道在結構上與其它類型鉀通道不同，屬于二聚體而不是四聚體，其功能性亞基含有4個跨膜片段、2個孔區(qū)（P1和P2）及位于孔區(qū)的選擇性過濾器。TWIK-1通道的離子選擇過濾器是位于P1孔區(qū)的一段高度保守的非對稱性氨基酸序列（TxGYG）［16］。我們的前期研究表明，在低［K+］e條件下，TWIK-1通道的離子選擇性發(fā)生改變而介導內向鈉離子電流，而位于通道P1 孔區(qū)選擇性過濾器的第118 位蘇氨酸（T118）在這一過程中起到關鍵作用［17］。這說明，在低［K+］e條件下，TWIK-1通道的功能不再是維持細胞靜息膜電位超極化，而是使靜息膜電位去極化。我們推測，TWIK-1 通道功能的異?？赡茉诘外浾T發(fā)心肌細胞靜息膜電位異常去極化的過程中起到了重要作用。本實驗以小鼠HL-1細胞為心肌細胞模型，探討在低［K+］e條件下TWIK-1通道功能的改變對心肌細胞靜息膜電位的影響及其機制。

材料和方法

1 主要試劑

DMEM 培養(yǎng)液、青霉素-鏈霉素和胰酶細胞消化液（Gibco）；胎牛血清（HyClone）；河鲀毒素（tetrodotoxin，TTX）和CoCl2（Sigma）。

2 主要方法

2.1 細胞培養(yǎng)與轉染 攜帶人TWIK-1和TWIK-1-T118i突變體基因序列的慢病毒載體（滴度1×1011TU/L）由賽業(yè)生物科技包裝。載有各基因序列及綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的慢病毒預先用DMEM 培養(yǎng)液以1∶1 000的比例稀釋，分裝于EP管中，保存于-80 ℃冰箱中備用。

中國倉鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）細胞與HL-1 小鼠心肌細胞均來自西南醫(yī)科大學心血管醫(yī)學研究所（醫(yī)學電生理學教育部重點實驗室）。2 種細胞均培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液。細胞接種于含有玻片的培養(yǎng)皿中。待細胞生長至80%融合時，轉染組細胞加入預先稀釋好的病毒，放入孵育箱共同培養(yǎng)48 h 后，用于膜片鉗實驗。所轉染病毒均攜帶GFP，用于檢測細胞是否轉染成功。

2.2 電生理 采用HEKA膜片鉗系統(tǒng)（EPC10）在電流鉗模式下記錄細胞靜息膜電位；在電壓鉗模式下記錄全細胞電流，斜坡刺激方案為電壓從-140 mV去極化到100 mV，跨度為2 200 ms［17-18］。采用電阻為2～3 歐姆的玻璃電極，形成封接，破膜后進行記錄。記錄CHO 細胞的電極內液組成為（mmol/L）：140 KCl，1 MgCl2，10 EGTA，1 K2-ATP，5 HEPES（pH 7.4）。電極外液組成為（mmol/L）：135 NaCl，5 KCl，2 CaCl2，1 MgCl2，15 glucose，10 HEPES（pH 7.4）。記錄HL-1 心肌細胞的電極內液組成為（mmol/L）：20 KCl，120 potassium aspartate，1 MgCl2，5 Na2-ATP，0.5 Na2-GTP，10 EGTA，5 HEPES（pH 7.4）。電極外液組成為（mmol/L）：140 NaCl，5.4KCl，1.8 CaCl2，1 MgCl2，10 glucose，10 HEPES（pH 7.4）。

為了檢測低［K+］e對細胞膜電位及全細胞電流的影響，細胞外液中鉀離子濃度降低至2.7 mmol/L，同時，相應提高外液中NaCl 的濃度，以維持外液總滲透壓不變。為了記錄低［K+］e條件下TWIK-1 通道介導的內向鈉電流，低鉀外液中加入2 mmol/L CoCl2及500 μmol/L TTX 以阻斷心肌細胞電壓門控鈣通道及鈉通道電流［18］。

3 統(tǒng)計學處理

所記錄電生理數(shù)據(jù)采用IGOR Pro軟件進行制圖和統(tǒng)計分析，以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。

結 果

1 低［K+］e時，表達人 TWIK-1 通道的 CHO 細胞靜息膜電位發(fā)生去極化

CHO 細胞經載有TWIK-1基因序列的慢病毒轉染48 h后，膜片鉗可記錄到典型的TWIK-1通道全細胞電流（圖1A）。當［K+］e為5.4 mmol/L 時，CHO 細胞的靜息膜電位為（-77.0±0.9）mV，當［K+］e降為2.7 mmol/L 時，CHO 細胞的靜息膜電位首先呈現(xiàn)超極化，隨著細胞外低鉀溶液灌流時間的延長，靜息膜電位緩慢去極化到（-58.0±1.2）mV，當［K+］e恢復到5.4 mmol/L 時，靜息膜電位恢復到靜息水平（圖1B）。此外，當［K+］e從 5.4 mmol/L 降為 2.7 mmol/L 時，TWIK-1 通道全細胞電流的反轉電位由（-77.0±0.9）mV去極化到（-59.0±1.3）mV（圖1C）。

2 低［K+］e時，TWIK-1通道介導的內向鈉離子電流引起CHO細胞靜息膜電位去極化

為了進一步驗證TWIK-1通道介導的內向鈉離子電流是低［K+］e引起CHO細胞靜息膜電位去極化的關鍵，我們將細胞外低鉀溶液的鈉離子替換為N-甲基-D-葡萄糖胺（N-methyl-D-glucamine，NMDG）。膜片鉗結果顯示，當［K+］e從5.4 mmol/L 降為2.7 mmol/L 時，表達人TWIK-1 通道的CHO 細胞的靜息膜電位維持在（-93.0±2.5）mV，去極化現(xiàn)象消失（圖2A），且全細胞電流的反轉電位維持在（-90.0±3.5）mV（圖2B）。在表達人TWIK-1-T118i 突變體通道的CHO 細胞，當［K+］e從 5.4 mmol/L 降為 2.7 mmol/L 時，靜息膜電位維持在（-94.0±3.5）mV，去極化現(xiàn)象消失（圖2C）。

3 低［K+］e時，表達人TWIK-1 通道的HL-1 小鼠心肌細胞靜息膜電位發(fā)生去極化

我們采用HL-1 小鼠心肌細胞系作為心肌細胞模型，觀察2.7 mmol/L［K+］e對其膜電位及全細胞電流的影響。我們的實驗結果顯示，在對照組HL-1 細胞，當［K+］e從5.4 mmol/L降為2.7 mmol/L時，靜息膜電位發(fā)生超極化，維持在（-88.0±2.0）mV（圖3A），并且全細胞電流的反轉電位維持在（-83.0±3.5）mV（圖3B）。而在表達TWIK-1 通道的HL-1 細胞，當［K+］e從 5.4 mmol/L 降為 2.7 mmol/L 時，靜息膜電位首先呈現(xiàn)超極化，隨著細胞外低鉀溶液灌流時間的延長，靜息膜電位發(fā)生緩慢去極化，維持在（-43.0±3.0）mV，且全細胞電流的反轉電位維持在（-41.0±2.5）mV（圖3C、D）。此外，用表達人TWIK-1-T118i突變體通道的HL-1 細胞作為陰性對照，當［K+］e從5.4 mmol/L 降為 2.7 mmol/L 時，HL-1 細胞靜息膜電位維持在（-88.0±3.0）mV，去極化現(xiàn)象消失，且全細胞電流的反轉電位維持在（-84.0±3.5）mV（圖4）。

Figure 2. The inward Na+currents conducted by TWIK1 channel contributed to membrane potential depolarization of the CHO cells at 2.7 mmol/L［K+］e（2.7K）. A：representative resting membrane potential of the CHO cells expressing human TWIK-1 channel was shown when N-methyl-D-glucamine（NMDG）-based bath solution was reversibly changed from 5.4 mmol/L［K+］e（5.4K）to 2.7K；B：representative whole-cell ramp currents in the CHO cells engineered to express human TWIK-1 channel before and after Na+-based bath solution was changed from 5.4K（black line）to 2.7K（red line）or changed to NMDG-based bath solution containing 2.7K（blue line）；C：representative resting membrane potential of the CHO cells expressing human TWIK-1-T118i channel was shown when NMDG-based bath solution was reversibly changed from 5.4K to 2.7K. Mean±SD. n=7.圖2 細胞外低鉀條件下，TWIK-1通道介導的內向鈉離子電流引起CHO細胞靜息膜電位去極化

討 論

TWIK-1 雙孔鉀通道在心肌細胞高度表達，但其調控心肌細胞電生理特性的病理生理意義尚不明確。Christensen 等［19］將斑馬魚心臟的TWIK-1基因敲除，發(fā)現(xiàn)心跳速率明顯變緩，說明TWIK-1 通道參與了心肌細胞自律性的調控。我們的前期研究結果表明，在細胞外低鉀條件下，TWIK-1 通道離子選擇性發(fā)生改變并介導內向鈉離子電流［17-18］。心肌細胞靜息膜電位的維持依靠背景鉀離子通道，TWIK-1 通道屬于背景鉀離子通道。我們推測，在低［K+］e條件下，TWIK-1 通道功能的改變可能會對心肌細胞靜息膜電位產生影響。因此，我們首先在異源表達系統(tǒng)CHO細胞，觀察了TWIK-1通道功能的改變對靜息膜電位的影響。本研究結果表明，在低［K+］e條件下，轉染TWIK-1 通道的CHO 細胞的靜息膜電位呈現(xiàn)去極化。這一結果說明，在低［K+］e條件下TWIK-1通道功能的改變能夠引起靜息膜電位去極化。以往研究表明，小鼠心肌細胞的靜息膜電位在低［K+］e條件下呈現(xiàn)超極化而不是去極化，并且小鼠心肌細胞不表達TWIK-1 通道［20-22］。因此，我們采用 HL-1 小鼠心肌細胞作為心肌細胞模型，觀察TWIK-1通道功能的改變對心肌細胞靜息膜電位的影響。本研究結果表明，在低［K+］e條件下，轉染 TWIK-1 通道的 HL-1 小鼠心肌細胞靜息膜電位發(fā)生去極化（約-40 mV）。這一結果與以往在成人心肌細胞觀察到實驗結果一致［4-6］。上述研究結果表明，在低［K+］e條件下，TWIK-1 通道功能的改變能夠引起心肌細胞靜息膜電位去極化。

心肌細胞靜息膜電位異常去極化是低鉀血癥誘發(fā)心律失常的主要病理基礎之一，但其發(fā)生機制尚未完全闡明。靜息膜電位是由細胞膜離子通道介導的內向電流和外向電流的動態(tài)平衡決定的。細胞膜離子通道介導的外向電流減弱或內向電流增強均會引起靜息膜電位發(fā)生去極化［23］。Sheu等［24］和Gadsby等［25］在羊和成人心肌細胞的研究表明，去除細胞外液的鈉離子后，低鉀誘發(fā)的心肌細胞靜息膜電位去極化現(xiàn)象消失。上述研究說明鈉離子內流是低鉀導致心肌細胞靜息膜電位異常去極化的關鍵因素。為了證明TWIK-1 通道介導的鈉離子內流能夠引起心肌細胞靜息膜電位去極化，我們首先在轉染TWIK-1通道的CHO 細胞證明了TWIK-1 通道介導的鈉離子內流引起CHO 細胞靜息膜電位去極化，因為當細胞外液的鈉離子替換為NMDG 時，低鉀誘發(fā)的靜息膜電位去極化現(xiàn)象消失。其次，我們在HL-1 小鼠心肌細胞證明了TWIK-1 通道介導的鈉離子內流能夠引起心肌細胞靜息膜電位去極化，因為轉染TWIK-1-T118i 突變體通道的HL-1 小鼠心肌細胞的靜息膜電位呈現(xiàn)超級化，而TWIK-1-T118i 突變體通道在低［K+］e條件下不介導內向鈉離子電流［19-20］。

Figure 3. Membrane potential depolarization occurred in mouse HL-1 cardiomyocytes with ectopic expression of TWIK1 channel at 2.7 mmol/L［K+］e（2.7K）. A：representative resting membrane potential of HL-1 cardiomyocytes was shown when Na+-based bath solution was reversibly changed from 5.4 mmol/L［K+］e（5.4K）to 2.7K；B：representative whole-cell ramp currents in HL-1 cardiomyocytes before and after Na+-based bath solution was changed from 5.4K（black line）to 2.7K（red line）；C：representative resting membrane potential of HL-1 cardiomyocytes with ectopic expression of human TWIK-1 channel was shown when Na+-based bath solution was reversibly changed from 5.4K to 2.7K；D：representative wholecell ramp currents in HL-1 cardiomyocytes with ectopic expression of human TWIK-1 channel before and after Na+-based bath solution was changed from 5.4K（black line）to 2.7K（red line）. Mean±SD. n=5.圖3 表達人TWIK1通道的HL1小鼠心肌細胞在細胞外低鉀條件下膜電位發(fā)生去極化

Figure 4. Mouse HL-1 cardiomyocytes with ectopic expression of TWIK1-T118i channel showed hyperpolarized membrane potential at 2.7 mmol/L［K+］e（2.7K）. A：representative resting membrane potential of HL-1 cardiomyocytes with ectopic expression of human TWIK-1-T118i channel was shown when Na+-based bath solution was reversibly changed from 5.4 mmol/L［K+］e（5.4K）to 2.7K；B：representative whole-cell ramp currents in HL-1 cardiomyocytes with ectopic expression of human TWIK-1-T118i channel before and after Na+-based bath solution was changed from 5.4K（black line）to 2.7K（red line）. Reversal potential of TWIK-1 channel currents at 2.7K was（-84.0±1.5）mV. Mean±SD. n=5.圖4 表達人TWIK1-T118i通道的HL1小鼠心肌細胞在細胞外低鉀條件下膜電位發(fā)生超極化

綜上所述，本研究證明了在低［K+］e條件下TWIK-1 通道介導的內向鈉離子電流能夠引起小鼠心肌細胞靜息膜電位去極化。鑒于TWIK-1 通道在人心肌細胞高度表達而在小鼠心肌細胞不表達，因此，在低［K+］e條件下，TWIK-1 通道功能的改變是否能夠引起人心肌細胞靜息膜電位異常去極化仍需通過基因敲除等方法在人心肌細胞進一步驗證。