王超敏，李雅茹，魏莎莎，郎繁繁，周景麗，陳旭峰，許 女，*

（1.山西農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院，山西 晉中 030801；2.食醋發(fā)酵科學與工程山西省重點實驗室，山西 太原 030400；3.山西紫林醋業(yè)股份有限公司，山西 太原 030400）

傳統(tǒng)的山西老陳醋由獨特的混菌固態(tài)發(fā)酵工藝生產(chǎn)，獨特的釀造微環(huán)境形成獨特穩(wěn)定的微生物發(fā)酵菌群，并賦予山西老陳醋獨特的口感與風味。山西老陳醋主體酸（醋酸）是由醋酸菌（acetic acid bacteria）產(chǎn)生的[1]。其中，巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus）是醋酸發(fā)酵階段的主要優(yōu)勢產(chǎn)酸菌，還具有產(chǎn)乙偶姻、川芎嗪等風味物質(zhì)和功能活性物質(zhì)的能力[2-4]。具備高溫、酒精、酸等耐受特性及高產(chǎn)酸、產(chǎn)乙偶姻一直是食醋產(chǎn)業(yè)選育醋酸菌菌種的目標方向。查婧等[5]從福建傳統(tǒng)紅曲醋中分離出一株產(chǎn)酸能力強的醋酸菌株，并鑒定為斯氏葡糖酸醋桿菌（Gluconacetobacter swingsii）；梁叢穎等[6]采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)與16S rRNA基因序列分析相結(jié)合的方法從諾麗自然發(fā)酵汁中分離鑒定出24株醋酸菌，并篩選出一株發(fā)酵性能和耐受特性均良好的熱帶醋酸桿菌（Acetobacter tropicalis）；劉陽等[7]從保寧醋醋曲中篩選獲得醋酸桿菌（Acetobacter sicerae）A11，其產(chǎn)酸量為30.90 g/L；張燁等[8]從清徐醋廠的醋醅中分離得到5株產(chǎn)酸能力強的醋酸菌，其中醋酸菌F20可耐受體積分數(shù)13%的乙醇，醋酸菌F6可耐受高溫，在35 ℃高溫條件下產(chǎn)酸量達4.964 g/100 mL；吳越等[9]從杏皮渣醋中分離篩選出6株醋酸菌，醋化醋桿菌Ac02的醋酸產(chǎn)量最高（3.04 g/100 mL）。

目前，隨著現(xiàn)代菌株分子分型手段的發(fā)展，腸桿菌基因間保守重復序列（Enterobacterial repetitive intergenic consensus，ERIC）、隨機擴增多態(tài)性脫氧核糖核酸（random amplified polymorphic deoxyribonucleic acid，RAPD）、變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）、脈沖場凝膠電泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）等已被成功用于牛乳[10]、泡菜[11]、肉品[12]、黃酒[13]中大腸桿菌、芽孢菌、沙門氏菌、酵母菌菌株、醋酸菌菌株[14-15]的分型，使人們對于微生物種群結(jié)構(gòu)特征、微生物多樣性、發(fā)酵規(guī)律等有了更加深入的了解。ERIC-聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)為利用ERIC序列中高度保守區(qū)來設(shè)計一對反向引物，進行PCR擴增，可根據(jù)所得到的擴增產(chǎn)物電泳條帶來區(qū)分細菌的株（型），相比于其他分型手段，其具有成本較低、操作技術(shù)簡單等特點。金莉莉等[16]用ERIC-PCR技術(shù)鑒定李斯特氏菌，與國標生化方法檢測結(jié)果完全一致，該技術(shù)可用于李斯特氏菌種、菌株的鑒定以及進一步分型研究；蘇戰(zhàn)強等[17]對27株新疆牛源大腸桿菌O157：H7分離鑒定及ERIC-PCR基因分型，27株分離菌有8種類型：A型有2株，B型是優(yōu)勢菌、有10株，C型有3株，D型有8株，剩余菌株為分散型分布，有4種型；蘇俊霞[2]從鎮(zhèn)江香醋醋醅中分離出75株醋酸菌，分為三個型別：Ⅰ型有63個菌株，Ⅱ型有7個菌株，Ⅲ型有7個菌株。

目前，鮮有關(guān)于山西老陳醋來源醋酸菌菌株分型及型別與發(fā)酵特性關(guān)系研究。因此，本研究采用傳統(tǒng)培養(yǎng)分離方法從山西老陳醋醋醅中分離篩選醋酸菌，通過形態(tài)學觀察，結(jié)合分子生物學鑒定其種屬，同時進行ERIC-PCR分型，并研究其生長耐受性和產(chǎn)酸、產(chǎn)乙偶姻特性，旨在揭示山西老陳醋醋發(fā)酵菌群的特征、分型與性狀關(guān)系，從中篩選出優(yōu)良菌株，以期將來開發(fā)成直投式發(fā)酵劑強化應用于山西老陳醋釀造中，達到提質(zhì)增效的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

醋醅：采集山西紫林醋業(yè)股份有限公司老陳醋醋酸發(fā)酵過程中的醋醅，發(fā)酵15 d，每隔1 d進行多點采樣，樣品裝入自封袋，取回后立即進行微生物分離。

1.1.2 試劑

細菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：北京博邁德基因科技有限公司；PCR引物：由深圳華大基因公司合成；DNA Maker、MIX：生物工程（上海）有限責任公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

醋酸菌液體培養(yǎng)基[18]：1%酵母浸膏，2%葡萄糖，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min后加入1%無菌碳酸鈣和4%無水乙醇。固體培養(yǎng)基中加入2%瓊脂。

1.2 儀器與設(shè)備

T100型PCR儀、Universial Hood Ⅱ型凝膠成像系統(tǒng)：美國Bio-Rad公司；DYY-6C型瓊脂糖凝膠電泳儀：北京六一儀器廠；PHS-3C型pH計：上海佑科儀器儀表有限公司；YXQ-LS-50S11型多功能搖床：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；722型可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司。

從泉州志愿服務(wù)開展的情況看，大部分志愿活動是由政府部分機構(gòu)組織的，志愿者也是由政府機關(guān)工作人員組成。政府主導和行政推動的方式雖然有利于啟動志愿服務(wù)活動，但過分依靠行政推動往往會出現(xiàn)“被志愿”或志愿服務(wù)形式化或運動化的問題。[7]由于長期的行政化主導，一方面讓民眾產(chǎn)生誤解，以為志愿服務(wù)是政府行為；一方面很容易形成運動式，出現(xiàn)形式化的問題；一方面“被志愿”者在心理上對志愿服務(wù)活動會產(chǎn)生抵觸情緒。

1.3 試驗方法

1.3.1 山西老陳醋醋醅中醋酸菌的分離純化

采用無菌生理鹽水稀釋醋醅樣品，選取合適稀釋度的稀釋菌液涂布于醋酸菌固體培養(yǎng)基平板上，30 ℃條件下培養(yǎng)48 h后，挑取單菌落再次劃線于醋酸菌固體培養(yǎng)基進行分離純化，30 ℃條件下培養(yǎng)48 h后，觀察菌落形態(tài)，挑取具有透明圈的單菌落進行革蘭氏染色，鏡檢，觀察細胞形態(tài)特征。

1.3.2 山西老陳醋醋醅中醋酸菌的分子生物學鑒定

采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株基因組DNA，以其為模板，利用引物27F（5'-AGAGTITGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-ACGGYTACCTI'GTI'ACGACTY-3'）[19]進行PCR擴增。PCR擴增體系：引物27F 2 μL，引物1492R 2 μL，模板2 μL，2×Mix 20 μL，雙蒸水（ddH2O）14 μL；PCR擴增程序：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 45 s，30個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。將測序結(jié)果提交至美國國家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫中采用基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）進行同源性搜索，選取同源性較高的模式菌株的16S rDNA基因序列，采用MEGA5.0生物學軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌株種屬關(guān)系。

1.3.3 醋酸菌菌株的基因分型

以分離的醋酸菌菌株基因組DNA為模板，采用隨機引物ERIC1（5'-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3'）和ERIC2（5'-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3'）進行PCR擴增。PCR擴增體系（30 μL）：引物3 μL，模板3.5 μL，2×Mix 15 μL，雙蒸水（ddH2O）8.5 μL；PCR擴增程序：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，48 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共30個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離后在凝膠成像系統(tǒng)上觀察分析，進行ERIC分型。

1.3.4 醋酸菌菌株的發(fā)酵特性研究

（1）耐受性能測定

（2）產(chǎn)酸、產(chǎn)乙偶姻性能測定

將分離純化的醋酸菌分別接種于醋酸菌液體培養(yǎng)基，30 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)24 h，以2%（V/V）接種量接入100 mL醋酸菌液體培養(yǎng)基，30 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)24 h，按照文獻[21-22]中的方法對菌株產(chǎn)酸和產(chǎn)乙偶姻的能力進行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 醋酸菌的分離及鑒定

從山西老陳醋醋醅中共分離純化得到20株醋酸菌，分別編號為菌株SAV-CP-6、SAV-CP-25、SAV-CP-28、SAV-CP-37、SAV-CP-38、SAV-CP-40、SAV-CP-41、SAV-CP-73、SAVCP-74、SAV-CP-77、SAV-CP-80、SAV-CP-156、SAV-CP-160、SAV-CP-170、SAV-CP175、SAV-CP-1839、SAV-CP-1842、SAVCP-1843、SAV-CP-1870、SAV-CP-1884。選取典型菌株SAVCP-77，觀察其形態(tài)，其菌落形態(tài)和細胞形態(tài)（1 000×）見圖1。由圖1可知，菌落直徑為2 mm，呈規(guī)則圓形，乳白色，半透明，光滑，有光澤，細胞形態(tài)為桿狀，革蘭氏染色呈陰性（G-）。

圖1 山西老陳醋醅中典型醋酸菌SAV-CP-77的菌落（A）和細胞（B）形態(tài)Fig.1 Colony (A) and cell (B) morphology of typical acetic acid bacterium SAV-CP-77 from Shanxi aged vinegar Cupei

2.2 醋酸菌的分子生物學鑒定

20株醋酸菌菌株系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。

圖2 基于16S rDNA基因序列20株醋酸菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of 20 strains of acetic acid bacteria based on 16S rDNA gene sequences

由圖2可知，菌株SAV-CP-175、SAV-CP-40、SAV-CP-41、SAV-CP-37、SAV-CP-1870、SAV-CP-170、SAV-CP-25、SAVCP-80、SAV-CP-160、SAV-CP-1839、SAV-CP-1884、SAV-CP-1842、SAV-CP-1843、SAV-CP-77、SAV-CP-6、SAV-CP-74、SAV-CP-73、SAV-CP-156與模式菌株巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus）（FJ227313.1）、（Acetobacter pasteurianus）（KT724709.1）、（Acetobacter pasteurianus）（KY287771.1）聚于一支，親緣關(guān)系最近，最高可達到96%，因此，將這些菌株鑒定為巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus），菌株SAVCP-28、SAV-CP-38與模式菌株醋化醋桿菌（Acetobacter pomorum）（KF030772.1）、（Acetobacter pomorum）（NR114684.1）聚于一支，親緣關(guān)系最近，最高可達到99%，因此，將這些菌株鑒定為醋化醋桿菌（Acetobacter pomorum）。

蘇俊霞[2]采用16S rDNA測序從鎮(zhèn)江香醋醋醅中分離鑒定出22株巴氏醋桿菌、5株醋化醋桿菌、5株中間葡萄醋桿菌、3株木醋桿菌（Acetobacter xylinum）；胡會萍等[3]采用傳統(tǒng)菌種分離方法從山西老陳醋醋醅中分離出巴氏醋桿菌Ab7、醋化醋桿菌Af10、液化醋桿菌（Acetobacter liquefa-ciens）Af5、漢氏醋桿菌（Acetobacter hansenii）Au13和惡臭醋桿菌（Acetobacter rancens）Af20；郭旭凱等[4]也從山西老陳醋中分離出巴氏醋酸桿菌（Acetobacter pasteurianus）、醋化醋桿菌（Acetobacter aceti），液化醋桿菌（Acetobacter liquefaciens）和惡臭醋酸桿菌（Acetobacter rancens）。綜上所述，不同地域、不同類型的醋種由于原料、工藝不同，主要的優(yōu)勢醋酸菌菌屬也不同，而同一醋種類型，由于不同廠家釀醋工藝及地理環(huán)境的差異性，醋酸菌菌群結(jié)構(gòu)也體現(xiàn)出差異性。

2.3 山西老陳醋醋醅中醋酸菌菌株的基因分型

為了解山西老陳醋醋醅中醋酸菌種內(nèi)菌株的基因多樣性，采用ERIC技術(shù)對20株醋酸菌菌株進行基因分型，結(jié)果見圖3。由圖3A可知，18株巴氏醋桿菌主要呈現(xiàn)I、II、III、IV、Ⅴ共5個型別。其中菌株SAV-CP-25、SAV-CP-73、SAVCP-74、SAV-CP-1842、SAV-CP-77、SAV-CP-80、SAV-CP-156、SAV-CP-170、SAV-CP-1884歸為I型，菌株SAV-CP-37、SAVCP-40、SAV-CP-41、SAV-CP-6、SAV-CP-175歸為II型，菌株SAV-CP-1839、SAV-CP-160屬于III型，菌株SAV-CP-1870屬于IV型，菌株1843屬于Ⅴ型。由圖3B可知，2株醋化醋桿菌分為兩個不同的型別，其中菌株SAV-CP-28歸為I型，菌株SAV-CP-38歸為II型。HIDALGO C等[23]對傳統(tǒng)發(fā)酵柿子醋中分離出的糖化葡萄糖酸桿菌（Gluconacetobacter saccharivorans）、巴氏醋酸桿菌（Acetobacter pasteurianus）、醋酸合胞菌（Acetobacter syzygii）、中間葡萄醋桿菌（Gluconacetobacter intermedius）和歐洲葡萄酸桿菌（Gluconacetobacter europaeus）進行鑒定，并進一步進行ERIC-PCR分型，結(jié)果共檢測到28種不同的醋酸菌基因型；GONZáLEZ á 等[24]采用ERIC-PCR對紅酒發(fā)酵中醋酸菌進行分型，結(jié)果表明，20株醋酸菌具有33種不同的ERIC分型。綜上所述，來源于老陳醋醋酸發(fā)酵過程中的20株醋酸菌具有菌株基因多樣性，可為菌株特性分析提供遺傳學基礎(chǔ)。

圖3 山西老陳醋醋醅中醋酸菌的ERIC基因分型結(jié)果Fig.3 Results of ERIC genotyping of acetic acid bacteria from Shanxi aged vinegar Cupei

2.4 山西老陳醋醋醅中醋酸菌的耐受性研究

2.4.1 溫度耐受性

山西老陳醋獨特的低溫酒化和高溫醋化釀造工藝，賦予了老陳醋風味醇厚、純正的特點。其中高溫醋化則需要醋酸菌菌種具有優(yōu)良的高溫耐受性。20株醋酸菌的溫度耐受性見圖4。由圖4可知，隨著溫度的升高，各菌株的生物量基本呈下降趨勢。溫度為30～45 ℃時，各醋酸菌生長較好，溫度升至50 ℃時，各醋酸菌的生長受到一定抑制。

圖4 山西老陳醋醋醅中20株醋酸菌菌株的溫度耐受性Fig.4 Temperature tolerance of 20 strains of acetic acid bacteria from Shanxi aged vinegar Cupei

整體來講，巴氏醋桿菌的Ⅱ型菌株的溫度耐受性優(yōu)于Ⅰ型，醋化醋桿菌的Ⅱ型菌株的溫度耐受性優(yōu)于Ⅰ型。其中耐受性能優(yōu)良的菌株依次為：Ⅲ型巴氏醋桿菌SAV-CP-1839，Ⅱ型巴氏醋桿菌SAV-CP-41、SAV-CP-170，Ⅰ型巴氏醋桿菌SAV-CP-74，當溫度達到50 ℃時，巴氏醋桿菌SAVCP-1839的OD600nm值為0.248。

2.4.2 酒精耐受性

在食醋釀造的酒精發(fā)酵末期，其酒精度可以達到9% vol左右，因此篩選高酒精耐受性醋酸菌菌株對于快速啟動醋酸發(fā)酵具有重要意義。20株醋酸菌的酒精耐受性見圖5。由圖5可知，隨著酒精度的升高，各菌株的生物量基本呈下降趨勢。酒精度為6% vol～8% vol的條件下，各菌株生長較好，酒精度升至10% vol時，各菌株的生長開始受到一定抑制，酒精度升至12% vol，各菌株的生長受到明顯抑制。Ⅰ型巴氏醋桿菌SAV-CP-1884，Ⅱ型巴氏醋桿菌SAV-CP-175、SAV-CP-41和Ⅰ型醋化醋桿菌SAV-CP-28在各酒精度條件下生長較好，表現(xiàn)出較好的耐受性；其中Ⅰ型巴氏醋桿菌SAV-CP-1884在酒精度為10% vol時生長最為旺盛，可耐受10% vol的酒精度。張志燕等[25]從鎮(zhèn)江香醋醋醅中得到醋酸菌D-3-4可耐受體積分數(shù)為9%的乙醇。

圖5 山西老陳醋醋醅中20株醋酸菌菌株的酒精耐受性Fig.5 Alcohol tolerance of 20 strains of acetic acid bacteria from Shanxi aged vinegar Cupei

2.4.3 酸度耐受性

20株醋酸菌菌株的酸耐受性見圖6。由圖6可知，整體來講，醋化醋桿菌的耐酸性低于巴氏醋桿菌。在pH為5的條件下，各菌株生長較好，當pH降至3時，各菌株的生長受到一定影響。Ⅰ型巴氏醋桿菌SAV-CP-77、SAV-CP-156、SAV-CP-74、SAV-CP-1884，Ⅱ型巴氏醋桿菌SAV-CP-37、SAV-CP-40、SAV-CP-175，Ⅲ型巴氏醋桿菌SAV-CP-160在各酸度條件下生長較好，表現(xiàn)出較好的耐受性。Ⅰ型巴氏醋桿菌SAV-CP-1884的酸耐受性最強，在pH為3時，OD600nm值為0.223。

圖6 山西老陳醋醋醅中20株醋酸菌菌株的酸度耐受性Fig.6 Acidity tolerance of 20 strains of acetic acid bacteria from Shanxi aged vinegar Cupei

2.5 不同分型醋酸菌產(chǎn)酸、產(chǎn)乙偶姻的特性研究

2.5.1 產(chǎn)乙酸能力

乙酸是山西老陳醋酸味的主要成分，其含量與產(chǎn)生速率對山西老陳醋的品質(zhì)及發(fā)酵工藝都有著深遠的影響[26]。因此，篩選高產(chǎn)酸的醋酸菌菌株對于山西老陳醋的提質(zhì)增效具有重要理論依據(jù)。20株醋酸菌菌株的乙酸產(chǎn)量見圖7。

圖7 山西老陳醋醋醅中20株醋酸菌菌株產(chǎn)乙酸能力的測定結(jié)果Fig.7 Determination results of acetic acid production ability of 20 strains of acetic acid bacteria from Shanxi aged vinegar Cupei

由圖7可知，20株醋酸菌的乙酸產(chǎn)量在0.30～9.87 g/L之間，整體來講，醋化醋桿菌產(chǎn)乙酸能力要低于巴氏醋桿菌。Ⅰ型巴氏醋桿菌SAV-CP-156、SAV-CP-1884、SAV-CP-73、SAV-CP-74、SAV-CP-80，Ⅱ型巴氏醋桿菌SAV-CP-41、SAVCP-6和Ⅴ型巴氏醋桿菌SAV-CP-1843的乙酸產(chǎn)量均在6.0 g/L以上，其中Ⅰ型巴氏醋桿菌SAV-CP-1884的乙酸產(chǎn)量最高，為9.87 g/L。

2.5.2 產(chǎn)乙偶姻能力

20株醋酸菌菌株的產(chǎn)乙偶姻能力見圖8。

圖8 山西老陳醋醋醅中20株醋酸菌菌株產(chǎn)乙偶姻能力測定結(jié)果Fig.8 Determination results of acetoin production ability of 20 strains of acetic acid bacteria from Shanxi aged vinegar Cupei

由圖8可知，20株醋酸菌產(chǎn)乙偶姻能力差異較大，醋化醋桿菌產(chǎn)乙偶姻性能弱于巴氏醋桿菌。Ⅰ型巴氏醋桿菌SAV-CP-73、SAV-CP-80、SAV-CP-156、SAV-CP-170、SAVCP-1884，Ⅱ型巴氏醋桿菌SAV-CP-175和Ⅲ型巴氏醋桿菌SAV-CP-1839菌株產(chǎn)乙偶姻性能較強，達到0.52 mg/mL以上。其中Ⅰ型巴氏醋桿菌SAV-CP-73的乙偶姻產(chǎn)量最多，為0.97 mg/mL，Ⅰ型巴氏醋桿菌SAV-CP-1884的乙偶姻產(chǎn)量次之，為0.86mg/mL。乙偶姻是山西老陳醋重要功能活性物質(zhì)—川芎嗪的重要前體[27]。劉娜[27]對鎮(zhèn)江香醋醋酸發(fā)酵過程川芎嗪前體的生物合成途徑進行研究，發(fā)現(xiàn)乙偶姻、雙乙酰及銨根離子是川芎嗪合成的重要前體物質(zhì)。陳繼承等[28]對食醋中乙偶姻和川芎嗪含量進行測定發(fā)現(xiàn)食醋中乙偶姻和川芎嗪含量具有顯著的相關(guān)性。

3 結(jié)論

通過傳統(tǒng)培養(yǎng)分離方法從山西老陳醋醋醅中共分離出20株醋酸菌，經(jīng)形態(tài)觀察及分子生物學鑒定，鑒定18株醋酸菌為巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus），2株醋酸菌菌為醋化醋桿菌（Acetobacter aceti）。采用ERIC技術(shù)對其基因進行分型，結(jié)果表明，醋酸菌種內(nèi)具有基因多樣性，18株巴氏醋桿菌共有5個分型（I～V型），2株醋化醋桿菌共有2個分型（Ⅰ和Ⅱ型）。通過發(fā)酵特性研究發(fā)現(xiàn)，巴氏醋桿菌及醋化醋桿菌的Ⅱ型菌株的溫度耐受性均優(yōu)于Ⅰ型；巴氏醋桿菌Ⅰ型菌株產(chǎn)酸、產(chǎn)乙偶姻能力優(yōu)于其他型的菌株。在此基礎(chǔ)上，篩選出1株性能良好的菌株為巴氏醋桿菌SAV-CP 1884，其可耐受高溫45 ℃、酒精度10% vol以及pH 3的酸性環(huán)境，乙酸產(chǎn)量高達9.87 g/L、乙偶姻產(chǎn)量為0.86 mg/mL。