賀德貴，邢利民，盛明健，黃炳文，朱軍莉，張林祥，蔣予箭*

（1.湖州老恒和釀造有限公司，浙江 湖州 313000；2.浙江工商大學 食品與生物工程學院，浙江 杭州 310018）

食醋是一種日常生活中不可或缺的酸性調味品，不僅能增進食欲、防腐殺菌，還具有防心血管疾病、抗癌抗衰老、緩解消除疲勞、防止感冒等功效。浙江玫瑰醋因色澤如玫瑰般艷麗而得名，酸中帶甜、口感柔和、香氣獨特，深受江浙一帶消費者的喜愛。玫瑰醋的發(fā)酵工藝獨特，為靜態(tài)表面自然發(fā)酵[1]。但浙江玫瑰醋的釀造受季節(jié)的限制，一年只能生產一次到兩次，在生產過程中經常由于氣候潮濕而導致異常發(fā)酵變質，即醋醪表面產生膜醭，處理不當會使醋醪渾濁褪色，影響產品品質[2]，這給產量不占優(yōu)勢的玫瑰醋行業(yè)帶來了較大的問題。

食醋依靠微生物發(fā)酵而成，自然也容易因為微生物污染而產生膜醭甚至異常發(fā)酵變質，而膜醭的形成是由于單一運動的細胞互相黏連而形成細胞長鏈，然后產生細胞外基質相互黏附[3]。隨著宏基因組等分子生物學技術的快速發(fā)展，許多傳統(tǒng)發(fā)酵食品的微生物菌群被鑒定分析。由于食醋的釀造工藝存在差異，食醋污染的來源和微生物種類也有所不同，翟磊等[4]研究發(fā)現，食醋中耐酸乳桿菌能消耗碳源并產生乳酸，從而導致食醋酸敗；李偉麗等[5]從異常發(fā)酵醋中分離出多株細菌，且絕大多數為革蘭氏陽性菌；孫文麗等[6]在脹袋食醋中不僅發(fā)現芽孢桿菌，還分離出了腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）和頭狀葡萄球菌（Staphylococcus capitis）。浙江玫瑰醋是個復雜的多菌種體系，釀造季節(jié)高溫且多雨水，草缸蓋若不定期晾曬，容易使異常發(fā)酵微生物肆意生長，致使釀造中的玫瑰醋微生物生態(tài)失衡[7]。

目前玫瑰醋研究仍未見有關異常發(fā)酵菌的相關報道，鑒于此，本研究采用傳統(tǒng)培養(yǎng)分離方法分離異常發(fā)酵玫瑰醋中的微生物，通過回接實驗分析菌株的異常發(fā)酵特征，并通過形態(tài)觀察及分子生物學技術鑒定微生物種屬，同時探究培養(yǎng)溫度、酸度、酒精度對主要異常發(fā)酵微生物生長特性的影響，為控制玫瑰醋異常發(fā)酵變質提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

正常玫瑰醋醋樣品、異常發(fā)酵玫瑰醋樣品：寧波佐餐王食品有限公司、湖州老恒和釀造有限公司、浙江五味和食品有限公司；營養(yǎng)瓊脂、虎紅瓊脂培養(yǎng)基：杭州微生物試劑有限公司；LB肉湯培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基：青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司；細菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒、真菌基因組DNA提取試劑盒：北京索萊寶科技有限公司。其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1FD潔凈工作臺、SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱：上海博迅實業(yè)有限公司；FE20實驗室pH計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DYY-6C電泳儀：北京六一生物科技有限公司；HBPX220聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：英國Hybaid Limited公司；DChemiDoc XRS+化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)：美國Bio Rad公司；NSKY-200B恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海蘇坤實業(yè)有限公司；SpectraMax i3x酶標儀：美谷分子儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 異常發(fā)酵玫瑰醋樣品微生物的分離

用無菌玻璃棒挑取異常發(fā)酵玫瑰醋表面的膜醭于10 mL無菌生理鹽水中，將其振蕩混勻，按等梯度稀釋至10-6，然后分別取100 μL不同梯度的稀釋液，均勻涂布在營養(yǎng)瓊脂和虎紅瓊脂培養(yǎng)基上，將接種后的培養(yǎng)基分別置于37 ℃和30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h。挑去形態(tài)各異的菌落進行劃線分離純化，記錄純化后的單菌落形態(tài)，將真菌和革蘭氏染色后的細菌，在光學顯微鏡下觀察其菌體形態(tài)，并斜面保藏，待用。

1.3.2 回接實驗

取同批次中酸度和酒精度與異常發(fā)酵醋樣品相近的正常玫瑰醋，用0.22 μm濾膜過濾除菌。挑取分離的細菌及真菌菌株，分別接種到LB肉湯和麥芽汁培養(yǎng)基，分別在37 ℃和30 ℃條件下?lián)u床擴培12～18 h。取5 mL擴培后的懸浮液分別接種于50 mL正常玫瑰醋中，以不接種組為空白對照（M-0），在32 ℃條件下靜置培養(yǎng)7 d，觀察玫瑰醋樣品的異常發(fā)酵和產膜醭現象。

1.3.3 異常發(fā)酵微生物的分子生物學鑒定

分別用真菌DNA提取試劑盒和細菌DNA提取試劑盒，提取純化后6株分離菌株的基因組DNA。以提取的基因組為模板，細菌以27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）為引物PCR擴增16S rDNA，PCR擴增體系（25 μL）：5×reaction buffer 5 μL，5×GCbuffer 5 μL，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）（2.5 mmol/L）2 μL，上游引物（10 μmol/L）1 μL，下游引物（10 μmol/L）1 μL，DNA模板2 μL，雙蒸水（ddH2O）8.75 μL，Q5 DNA聚合酶0.25 μL。PCR擴增條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性30 s，46.4 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。真菌以內轉錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）為引物PCR擴增18S rDNA，PCR擴增體系同上。PCR擴增條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，51.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30個循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測、純化后，委托生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。將測序結果提交至美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數據庫中采用基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）進行同源性搜索比對，選取同源性較高的模式菌株的16S rRNA、18S rDNA基因序列，利用Clustal X軟件進行多重序列比對，再使用MEGA 7.0軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 異常發(fā)酵微生物的生長特性分析

活化分離鑒定的異常發(fā)酵微生物，按5%（V/V）的接種量接種于50 mL正常玫瑰醋中，在不同溫度（27 ℃、32 ℃、37 ℃）、不同pH值（3、5、7）、酒精度（0、2.5% vol、5.0% vol）條件下培養(yǎng)48 h，每4 h取樣，在波長600 nm處測定吸光度值（OD600nm）。

1.3.5 統(tǒng)計分析

每組樣品設3個重復，采用Microsoft Excel 2007和Origin 8.5進行數據處理和作圖，并利用SPSS 22.0進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 異常發(fā)酵玫瑰醋中微生物的分離

經過營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和虎紅培養(yǎng)基培養(yǎng)分離，初步分離得到4株細菌（X-1～X-4）和2株真菌（Z-1、Z-2）。各菌株的菌落及細胞形態(tài)見圖1。由圖1可知，4株細菌經革蘭氏染色后都呈紫色，即均為革蘭氏陽性（G+）細菌，其中菌株X-1、X-4的菌落為白色不透明，邊緣不整齊，細胞呈球形；菌株X-2和X-3的菌落呈點狀、表面光滑、邊緣整齊，菌株X-1的細胞呈短桿狀，菌株X-3的細胞呈長桿狀。2株真菌Z-1、Z-2的菌落表面濕潤、呈粉紅色、邊緣光滑整齊，細胞呈橢圓形。

圖1 異常發(fā)酵玫瑰醋中分離微生物的菌落及細胞形態(tài)Fig.1 Colony and cell morphology of microorganisms isolated from abnormally fermented rosy vinegar

2.2 回接實驗

將6株菌回接到正常玫瑰醋中，以不接種組為空白對照（M-0），靜置培養(yǎng)7 d后，觀察接種后醋樣的異常發(fā)酵和產膜醭現象，結果見表1。

表1 各菌株回接實驗的異常發(fā)酵現象Table 1 Abnormal fermentation phenomenon of back-test experiment of each strain

由表1可知，從玫瑰醋的顏色變化發(fā)現，接種4株細菌的醋樣都能保持與對照組類似的玫瑰色或淡玫瑰色，而接種真菌Z-1和Z-2的醋樣顏色呈較深的暗紅色和棕色。從玫瑰醋的酸度變化發(fā)現，對照組pH值為3.12，而除接種菌株X-2的醋樣外，其他醋樣的pH值升高，其中接種真菌Z-1、Z-2的醋樣pH較高，分別為4.78、5.12，顯然2株真菌生長過程中表現出氮代謝積累堿性物質的情形，pH升高會有利于其他細菌的繁殖生長。從玫瑰醋的氣味變化發(fā)現，接種菌株X-1、Z-1和Z-2的醋樣均有淡醋酸氣味，接種菌株X-3的醋樣有較淡醋酸味且略帶異味，接種菌株X-2的醋樣酸味較重且略帶異味，而接種菌株X-4的醋樣則有明顯的異常發(fā)酵臭味，說明菌株X-4是關聯(lián)玫瑰醋異常發(fā)酵的主要微生物之一。從產膜醭情況發(fā)現，4株細菌都不產生膜醭，僅接種菌株X-4的醋樣底部出現膜狀沉淀，而接種真菌Z-1和Z-2的醋樣在培養(yǎng)1～2 d后液體表面形成膜醭。正常的玫瑰醋發(fā)酵中期，醪液表面可見清晰的樹枝狀醋酸菌膜，“翻缸”操作時會將醋酸菌膜打碎，但第二天就會重新形成這種醋酸菌膜。異常發(fā)酵總是從液體表面形成粗糙而厚實的異樣膜璞開始，這種粗糙的膜璞會迅速阻礙醋酸菌膜的存在，醪液的酸度就不再增加，行業(yè)內將這種有異常膜璞的醋叫“桐油醋”，推測2株真菌是玫瑰醋產生膜醭的主要微生物。

2.3 異常發(fā)酵微生物的分子生物學鑒定結果

細菌X-1、X-2、X-3、X-4的16S rRNA及真菌Z-1和Z-2的18S rDNA的PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖2。由圖2可知，6株菌經PCR擴增后獲得預期大小的產物，電泳條帶清晰明亮。

圖2 6株菌株PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳結果Fig.2 Agarose gel electrophoresis results of PCR amplification products of 6 strains

分別基于16S rDNA、18S rDNA基因序列構建4株細菌及2株真菌的系統(tǒng)發(fā)育樹，結果見圖3。

由圖3A可知，菌株X-1與類芽孢桿菌（Paenibacillussp.）聚于一支，親緣關系最近，鑒定其為類芽孢桿菌（Paenibacillussp.），何銀等[8]對赤水曬醋的異常發(fā)酵微生物研究發(fā)現，類芽孢桿菌是引起醋異常發(fā)酵的菌株之一，其在15 ℃時生長很微弱，pH 3.0時幾乎不生長，能耐受5%以上的鹽分；王虎虎等[9]對真空包裝鹽水鵝貯藏期的優(yōu)勢菌群研究發(fā)現，類芽孢桿菌生存能力強，分解蛋白質能力較強，是產品貯藏后期的主要異常發(fā)酵菌。菌株X-2與金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）聚于一支，親緣關系最近，鑒定其為金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），其為革蘭氏陽性耐鹽的食源性致病菌，在食品加工過程中易污染食品。菌株X-3與表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）聚于一支，親緣關系最近，鑒定其為表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis），是人體皮膚黏膜常見的正常菌群，可能與醋發(fā)酵過程中人工操作污染有關。王向陽等[10]研究發(fā)現，脹袋的腌蘿卜干中存在表皮葡萄球菌，不過其產氣緩慢，產氣量較少。菌株X-4與蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）聚于一支，親緣關系最近，鑒定其為蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus），該革蘭氏陽性菌產孢子，常出現在蛋白質和碳水化合物含量高的食物，在腐質食物中含量也較高，產生的毒素會引起食物中毒[11]。研究顯示，蠟狀芽孢桿菌會引起榨菜異常發(fā)酵變質，引起榨菜“胖袋”現象[12]；在異常發(fā)酵后的韓國豆腐中分離到兩株異常發(fā)酵菌，鑒定均為蠟狀芽孢桿菌[13]。

由圖3B可知，真菌菌株Z-1與庫德里阿茲威畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）聚于一支，親緣關系最近，鑒定其為庫德里阿茲威畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）。菌株Z-2與盔形畢赤酵母（Pichia manshurica）聚于一支，親緣關系最近，鑒定其為盔形畢赤酵母（Pichia manshurica）。在發(fā)酵食品中真菌引起的污染較為常見，畢赤酵母屬在弱酸環(huán)境下生長，是導致泡菜生花的主要污染微生物之一[14]，在異常發(fā)酵后，泡菜中庫德里阿茲威畢赤酵母數量成倍增加[15]，在米酒釀造過程中也經常發(fā)生野生畢赤酵母、異常漢遜酵母的污染[16]。MOON S H等[17]研究報道，庫德里阿茲威畢赤酵母是泡菜中產膜醭的主要腐敗菌，導致泡菜的不良風味、質地軟化；SAEZ J S等[18]研究發(fā)現，畢赤酵母屬是導致葡萄酒異常發(fā)酵的原因之一。

圖3 基于16S rDNA基因序列細菌（A）和基于18S rDNA基因序列真菌（B）的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of bacteria (A) based on 16S rDNA gene sequence and fungi (B) based on 18S rDNA gene sequence

2.4 異常發(fā)酵微生物在不同培養(yǎng)條件下的生長特性

培養(yǎng)溫度、pH和酒精度對異常發(fā)酵微生物生長特性的影響見圖4。由圖4a可知，產膜醭的真菌菌株Z-1、Z-2、金黃色葡萄球菌X-2、蠟狀芽孢桿菌X-4在26～40 ℃較廣的溫度區(qū)間都有較快的生長速度，而類芽孢桿菌X-1、表皮葡萄球菌X-3的生長速度要慢得多，僅在32 ℃生長較好。玫瑰醋釀造主要依靠夏季高溫，使醋酸菌處于較為適宜的條件下將酒精轉化為醋酸，當溫度低于28～30 ℃時，醋酸菌（醋酸桿菌屬（Acetobactersp.）A和葡糖桿菌屬（Gluconobactersp.）G）的生長速度顯著變慢[19-20]，而產膜醭的真菌和蠟狀芽孢桿菌X-4快速生長和繁殖，液體表面大量酵母膜醭的形成阻擋了液面上醋酸菌跟空氣的接觸，從而使膜醭上的酵母迅速成為優(yōu)勢菌，而醋酸菌逐漸停止生長[21]。由圖4b可知，酸度提高對真菌Z-1、Z-2的生長影響有限，而腐敗細菌均無法在pH低于2.8的酸性條件下正常生長。玫瑰醋異常發(fā)酵大多數發(fā)生在玫瑰醋發(fā)酵的中期，這時候醪液的pH值大約在pH3.5左右，金黃色葡萄球菌X-2和蠟狀芽孢桿菌X-4都能以一定的速度生長繁殖，并使醪液的pH值適當上升，給不耐酸的腐敗菌提供生存條件[22]。敖曉琳等[23]報道畢赤酵母屬在酸性食品表面形成膜狀結構，還能氧化有機酸，從而為不耐酸的腐敗菌提供生存條件。由圖4c可知，庫德里阿茲威畢赤酵母Z-1、盔形畢赤酵母Z-2和金黃色葡萄球菌X-2在酒精濃度低于5% vol的基質中生長良好，而類芽孢桿菌X-1、表皮葡萄球菌X-3和蠟狀芽孢桿菌X-4不易在高濃度酒精條件下生長。由于玫瑰醋發(fā)酵中期醪液內有一定濃度的酒精2.0% vol～5.0% vol（沖缸放水后20～40 d的發(fā)酵中期）[24]，這為酒精耐受的雜菌繁殖和生長創(chuàng)造了條件。

圖4 培養(yǎng)溫度（a）、pH值（b）和酒精度（c）對異常發(fā)酵微生物生長的影響Fig.4 Effect of culture temperature (a),pH (b) and alcohol content (c) on the growth of abnormal fermentation microorganisms

2.5 異常發(fā)酵微生物的作用途徑及控制方法探究

玫瑰醋發(fā)酵過程中大米的淀粉通過糖化、發(fā)酵最終轉變?yōu)榇姿?，這個過程完全依賴環(huán)境空氣中的微生物自然發(fā)酵完成。雖然空氣中各種有益菌、有害菌混雜，生產中大米原料卻能有序接受霉菌分泌的淀粉酶進行糖化，即生產上俗稱“發(fā)花”。“沖缸放水”后糖分選擇性地被釀酒酵母發(fā)酵轉化成酒精，隨后酒精被生長于液面上的醋酸菌氧化成乙酸。這些微生物的選擇與調控的成敗取決于生產中兩個重要環(huán)節(jié)的掌控：①大米的浸米時間長達7～10 d，使得飯坯pH約3.5左右，在這較低的pH下，霉菌可以生長，而其他雜菌很難在飯粒表面繁殖；②投料時間從立夏到芒種，“沖缸放水”前期（6月份）的氣溫保持在25～29 ℃，適宜于酵母菌的生長，后期（7月、8月）氣溫保持在28.5～32 ℃，適宜于醋酸菌的生長[25]。

玫瑰醋發(fā)酵過程中不人為添加菌種，發(fā)酵所需的菌種基本來自于草缸蓋和空氣。當南方梅雨季節(jié)時，草缸蓋無法得到定期晾曬，雜菌容易繁殖生長。夜間溫度降低同樣會造成玫瑰醋中的醋酸菌生長速度變慢。而畢赤酵母在空氣中大量存在，最佳生長溫度為25～30 ℃，生長速度快、耐酸、好氧、能在液面上快速形成膜。玫瑰醋發(fā)酵中表面如若被異常畢赤酵母形成的膜璞覆蓋，醋酸菌接觸不到氧氣，醋酸菌生長緩慢甚至停止。人工定期“翻缸”等操作過程中也會混入各種微生物，一旦醋醅酸度不再上升，一些耐低酸的細菌（如臘狀芽孢桿菌）就會慢慢地活躍起來。從回接實驗結果可知，類芽孢桿菌和蠟狀芽孢桿菌生長時分解蛋白質使醪液pH值上升，pH值向中性變化導致更多雜菌的繁殖。有些芽孢桿菌類雜菌分解糖類產二氧化碳使缸中醪液后期返渾，蠟狀芽孢桿菌類雜菌分解蛋白質會使缸內醪液產生臭味?？梢姡叧嘟湍甘菍е旅倒宕桩惓０l(fā)酵的首要腐敗菌，而具有一定耐酸能力的蠟狀芽孢桿菌類細菌是導致玫瑰醋進一步返渾、發(fā)臭的輔助腐敗菌[26]。

從多家玫瑰醋廠的生產實踐，結合對異常發(fā)酵玫瑰醋微生物的分離、鑒定與生理特性研究，可以推測異常醋發(fā)酵過程見圖5。由圖5可知，環(huán)境溫度降低、醋酸菌生長緩慢→污染的酵母和芽孢菌優(yōu)勢生長→表面膜璞形成、醋酸菌停止生長→其他細菌異常發(fā)酵?？梢?，溫度管理是控制玫瑰醋發(fā)酵中期產生異常發(fā)酵醋的關鍵因素，因為液面形成大量致密的膜璞，行業(yè)中稱這種異常醋為“桐油醋”，在較高的溫度下野生酵母等雜菌不可能獲得生長優(yōu)勢。根據異常發(fā)酵玫瑰醋的微生物鑒別和成因分析，一旦玫瑰醋發(fā)生異常，應該在污染的早期及時采取如下措施：及時翻缸，破壞表面由野生酵母產生的膜璞；及時升溫，使醋醅溫度恢復到醋酸菌適宜的溫度范圍；把正常醋缸中的一定量醪液（含有大量醋酸菌）并入表面開始形成膜璞的醋缸。

圖5 玫瑰醋異常發(fā)酵過程模式圖Fig.5 Diagram of abnormal fermentation process of rosy vinegar

3 結論

從異常發(fā)酵浙江玫瑰醋的表面膜醭分離獲得4株革蘭氏陽性細菌（X1～X4）和2株真菌（Z1～Z2）。回接實驗結果顯示，6株菌株均有異常發(fā)酵特征，其中接種菌株X-4的醋樣出現明顯的發(fā)酵臭味，而接種真菌Z-1和Z-2的醋樣表面形成膜醭。通過菌體形態(tài)觀察和分子生物學技術鑒定4株細菌分別為類芽孢桿菌（Paenibacillussp.）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）、蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus），2株真菌分別為庫德里阿茲威畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）和盔形畢赤酵母（Pichia manshurica）。低溫抑制醋酸菌的生長，而對異常發(fā)酵菌的生長影響較?。坏退岷偷途凭认?，異常發(fā)酵細菌無法正常繁殖，而不影響異常發(fā)酵真菌。低溫是異常發(fā)酵微生物成為優(yōu)勢菌的前提條件，畢赤酵母產生的膜醭阻斷了醋酸菌的氧氣供應是導致醋酸異常發(fā)酵的主要因素。根據異常發(fā)酵玫瑰醋的微生物鑒別和成因分析，一旦玫瑰醋發(fā)生異常，應該在污染的早期及時翻缸，破壞表面由野生酵母產生的膜璞；及時升溫，使醋醅溫度恢復到醋酸菌適宜的溫度范圍；把正常醋缸中的一定量醪液（含有大量醋酸菌）并入表面開始形成膜璞的醋缸。