岳 琴， 毛文星， 張浩天， 胡昌華， 劉雪梅

西南大學(xué) 藥學(xué)院，重慶 400715

奧氮平(Olanzapine，Ola)是二代抗精神病藥物的典型代表，但長(zhǎng)期使用容易導(dǎo)致患者體質(zhì)量增加、肥胖及其他代謝性疾病，如高脂血癥、2型糖尿病等；Ola誘發(fā)的脂代謝紊亂因控制不理想、且缺乏相應(yīng)的預(yù)防措施致使心腦血管并發(fā)癥和早逝風(fēng)險(xiǎn)大為增加[1-4]．現(xiàn)階段，Ola介導(dǎo)代謝副反應(yīng)的具體機(jī)制尚未明確，各研究團(tuán)隊(duì)以嚙齒動(dòng)物為模型，選擇0.5～6 mg/kg等劑量，探究了這類(lèi)藥物介導(dǎo)代謝副反應(yīng)的相關(guān)機(jī)制[5-9]．但因?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)中，給藥方式、劑量、作用時(shí)間等差異大，研究結(jié)論仍存在諸多不一致．

本研究旨在模擬臨床口服給藥方式，探究臨床用藥劑量范圍內(nèi)，藥物劑量與代謝副反應(yīng)之間的關(guān)聯(lián)，并進(jìn)一步解析Ola介導(dǎo)脂代謝紊亂的可能機(jī)制，以期為合理建立動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ图敖鉀Q臨床問(wèn)題提供一定的指導(dǎo)．

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)健康雌性成年SD大鼠50只，8周齡，體質(zhì)量180～220 g，來(lái)自重慶市中藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK(渝)2007-0006．大鼠每籠2只，于室溫22 ℃，相對(duì)濕度(50±5)%且模擬晝夜規(guī)律(7：00～19：00 開(kāi)啟照明)的環(huán)境下飼養(yǎng)；適應(yīng)環(huán)境3 d后，訓(xùn)練主動(dòng)口服糖丸3 d(主動(dòng)口服給藥)．所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí)施．

1.2 藥 品

Ola，美國(guó)Lilly藥業(yè)公司，C17H20N4S，CAS號(hào)：132539-06-1．按比例將玉米淀粉(47.3%)、蔗糖(30.9%)、明膠(6.3%)和干酪素(15.5%)混合均勻后制成空白糖丸；將剝?nèi)グ碌腛la片劑用研缽磨成粉，按不同藥物濃度稱(chēng)取相應(yīng)質(zhì)量的粉末加入到空白糖丸干粉混合物中制成含藥糖丸，4 ℃避光儲(chǔ)存．以2.0 mg/kg劑量組(總質(zhì)量2.5 kg)每天給藥糖丸制作為例：取1片奧氮平片(有效量為5mg)去除包衣研磨成細(xì)粉后，加入按比例混合均勻的空白糖丸干粉15 g，再次充分混勻后加水制成軟糯的糖丸，并按照每只大鼠對(duì)應(yīng)體質(zhì)量占比稱(chēng)取相應(yīng)質(zhì)量的糖丸，將其均分為3份．

1.3 主要試劑

油紅O，北京鼎國(guó)昌盛生物公司(DH222-1)；總RNA快速提取試劑盒，北京百泰克生物技術(shù)有限公司(RP1202)；ChamQ SYBR qPCR Master Mix，南京諾唯贊(Q321-02)；HiScript III RT SuperMix for qPCR，南京諾唯贊(R323-01)；所有血清生化指標(biāo)檢測(cè)試劑均購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物公司；抗體SREBP1，Bioss bs-1402R；OCTN2，ABclonal (A1676)；CPT1A，ABclonal (A5307)；PPARα，Wanleibio (WL00978)；GAPDH(胞漿內(nèi)參蛋白)，Servicebio (GB11002)．

1.4 主要儀器

生化分析儀，Olympus AU400 chemistry analyser，Japan；冰凍切片機(jī)，德國(guó)萊卡公司(CM1900)；酶標(biāo)儀，Bio-Rad (Model 680)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，Bio-Rad；PCR儀，Bio-Rad；熒光及化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，上海勤翔(ChemiScope 6000 Pro)．

2 方 法

2.1 藥物處理

將大鼠隨機(jī)分為5組，適應(yīng)環(huán)境及口服糖丸訓(xùn)練結(jié)束后，分別給0，0.25，0.5，1.0，2.0 mg/kg的含藥糖丸，每天3次，每次間隔8 h，連續(xù)給藥14 d．飼養(yǎng)及給藥期間，每天記錄大鼠的體質(zhì)量、攝食和飲水情況．藥物處理第14 d，所有動(dòng)物禁食12 h后(過(guò)夜)，經(jīng)二氧化碳窒息處死，心臟采血，并分別測(cè)量大鼠的腎周脂肪、卵巢周?chē)?、腹股溝脂肪、總腹部脂肪和總白色脂肪的質(zhì)量[10]．

2.2 生化分析

心臟采血，將含有促凝劑的全血放入37 ℃水浴30 min，1 200 r/min離心10 min，留上清并保存至-20 ℃冰箱；檢測(cè)血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)等參數(shù)；檢測(cè)10%肝臟勻漿中游離脂肪酸(FFA)量．

2.3 組織油紅O(ORO)染色及蘇木精伊紅(HE)染色

利用冰凍切片機(jī)獲取12 μm厚度的肝臟組織切片，復(fù)溫15 min，用油紅O染色10 min，流水沖洗去除多余的油紅O染液，最后用蘇木素染核10 s；腹部白色脂肪經(jīng)石蠟包埋切片后獲得4 μm的組織切片，采用常規(guī)HE染色方法進(jìn)行染色；染色結(jié)果于顯微鏡下觀(guān)察并拍照，相應(yīng)指標(biāo)用Image Pro Plus(IPP)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)．

2.4 細(xì)胞免疫熒光

采用H-DMEM(含10%胎牛血清)培養(yǎng)HepG2細(xì)胞至密度為80%～90%，鋪板過(guò)夜后由Ola(0，2.5，5，10 μmol/L)處理24 h．磷酸緩沖液(PBS)清洗，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min；用含0.5%Triton X-100的PBS室溫通透細(xì)胞20 min，再用1% BSA封閉1 h；經(jīng)4 ℃一抗(1∶50)孵育過(guò)夜，37 ℃避光孵育二抗(CY3)1 h；DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚) 孵育5 min，熒光顯微鏡下觀(guān)察拍照，合并后得到MERGE圖像．

2.5 總RNA提取及RT-PCR檢測(cè)

按試劑盒方法提取肝臟總RNA，取1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，用SYBR進(jìn)行熒光定量．每個(gè)樣本做3個(gè)平行，以Gapdh和Rpl13a為內(nèi)參基因，以 2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量．

2.6 蛋白提取及Western blot檢測(cè)

肝臟組織加入蛋白裂解液后(含PMSF)在均質(zhì)破碎儀上勻漿，冰上裂解30 min，離心取上清，用BCA法測(cè)蛋白濃度．蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉，4 ℃孵育一抗過(guò)夜，室溫孵育二抗1 h，ECL化學(xué)發(fā)光顯影，Quantity One統(tǒng)計(jì)灰度值[11]，每個(gè)樣本重復(fù)2次實(shí)驗(yàn)，GAPDH為胞漿內(nèi)參蛋白，H3為核內(nèi)參蛋白．

2.7 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，Kolmogorov-Smirnov test檢測(cè)所有數(shù)據(jù)分布；組間比較采用單因素方差分析，所有數(shù)據(jù)用x±s表示，p<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 奧氮平給藥影響大鼠體質(zhì)量及脂肪生成

Ola處理2周后，給藥組體質(zhì)量累積增量均高于對(duì)照組，其中1.0和2.0 mg/kg劑量組體質(zhì)量增加明顯(p<0.01和p<0.05)；攝食、飲水未見(jiàn)明顯改變．此外，對(duì)各劑量組的脂肪組織質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估發(fā)現(xiàn)：1.0 mg/kg劑量組大鼠總腹部脂肪、卵巢周?chē)疽约翱偘咨撅@著增加(p<0.05)；2.0 mg/kg劑量組大鼠總白色脂肪顯著增加(p<0.05)(圖1)．

*表示p<0.05，**表示p<0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．

3.2 奧氮平給藥影響大鼠脂質(zhì)代謝

藥物處理2周后，大鼠肝臟游離脂肪酸(FFA)量隨給藥劑量遞增呈上升趨勢(shì)，其中1.0和2.0 mg/kg劑量組FFA增加與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；1.0和2.0 mg/kg劑量組大鼠血清TG水平增加與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)；各劑量組TC水平與對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．對(duì)肝臟進(jìn)行切片油紅O染色，給藥2周后，1.0和2.0 mg/kg劑量組脂滴面積顯著高于對(duì)照組．腹部白色脂肪切片HE染色結(jié)果顯示，1.0和2.0 mg/kg劑量組脂肪細(xì)胞直徑顯著高于對(duì)照組(圖2)．

*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．

3.3 奧氮平上調(diào)大鼠脂肪酸合成相關(guān)因子

脂質(zhì)的堆積可能是由于脂肪合成增多，肝臟是脂代謝的重要場(chǎng)所，因此需要對(duì)肝臟中脂肪合成相關(guān)因子進(jìn)行探究(圖3)．實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在給藥2周后，與對(duì)照組相比，脂肪合成相關(guān)因子Srebp1，Scd1，F(xiàn)asn和Acc1 mRNA水平顯著上調(diào)，不同給藥劑量上調(diào)程度有所不同；總蛋白中SREBP1蛋白表達(dá)水平與對(duì)照相比變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，藥物干預(yù)后胞質(zhì)蛋白中SREBP1蛋白表達(dá)水平下降，核蛋白中的SREBP1顯著增加(p<0.001)，肝細(xì)胞免疫熒光結(jié)果也顯示細(xì)胞核中的SREBP1表達(dá)水平隨Ola劑量增加而增加．

3.4 奧氮平下調(diào)大鼠脂肪酸氧化相關(guān)因子

檢測(cè)Ola對(duì)肝臟中脂肪酸氧化相關(guān)因子的影響(圖4)，結(jié)果顯示：Ola給藥2周后，0.5，1.0和2.0 mg/kg劑量組肝臟中脂肪酸氧化相關(guān)因子CPT1A和總蛋白中PPARα顯著下調(diào)，同時(shí)核蛋白中PPARα也顯著下調(diào)，且隨Ola劑量增加下調(diào)程度增大，胞質(zhì)蛋白中PPARα變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示細(xì)胞核中PPARα劑量下調(diào)；OCTN2也出現(xiàn)了下調(diào)的結(jié)果，其中2.0 mg/kg劑量組變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)．

*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．

4 討 論

根據(jù)《精神分裂癥防治指南》(2版)，本實(shí)驗(yàn)?zāi)M臨床上急性期患者診療方案，設(shè)計(jì)了0.25，0.5，1.0和2.0 mg/kg奧氮平4個(gè)劑量組(等同于臨床每60 kg用藥5～20 mg)每14 d的藥物處理實(shí)驗(yàn)．實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在臨床劑量范圍內(nèi)，Ola劑量與脂代謝副反應(yīng)程度之間相關(guān)聯(lián)，不同劑量Ola會(huì)介導(dǎo)不同程度的代謝副反應(yīng)．1.0 mg/kg和2.0 mg/kg(等同于臨床常用的每60 kg用藥10 mg和20 mg)劑量組的各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)最為顯著．因此，在這類(lèi)藥物的使用過(guò)程中，臨床監(jiān)測(cè)是非常必要的．

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，為了盡量減少大鼠因灌胃、注射等給藥方式而產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)，我們采用了主動(dòng)口服給藥，使之更接近臨床病人用藥的方式[12-13]．此外，在藥物作用時(shí)間上，因臨床研究發(fā)現(xiàn)，抗精神病藥導(dǎo)致體質(zhì)量增加及糖脂代謝變化不同于單純性肥胖，其糖脂代謝有其自身的特點(diǎn)，尤其在治療干預(yù)前2～4周，體型指標(biāo)及血脂指標(biāo)出現(xiàn)顯著變化[14-15]．因此，本研究選擇了14 d的給藥時(shí)間，等同于臨床4～6周治療時(shí)間．結(jié)果發(fā)現(xiàn)，藥物處理14 d后，動(dòng)物出現(xiàn)顯著的體質(zhì)量增加和脂代謝變化，尤其是1.0 mg/kg和2.0 mg/kg劑量組．因此，我們認(rèn)為SD大鼠能較好地模擬藥源性代謝紊亂，這為進(jìn)一步分子機(jī)制的探析提供了穩(wěn)定的動(dòng)物模型．

SREBP1是調(diào)節(jié)肝臟脂代謝的關(guān)鍵因子[16-17]，與脂肪合成密切相關(guān)[18-20]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Ola通過(guò)增加肝臟中SREBP1入核，激活下游脂肪合成相關(guān)靶基因Fasn，Acc1和Scd1的轉(zhuǎn)錄，增加脂質(zhì)合成．PPARα，CPT1A，OCTN2與肝臟脂肪酸氧化相關(guān)[20-24]，CPT1A是脂肪酸β氧化的限速酶；OCTN2作為最主要的肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[21]，負(fù)責(zé)肉堿的攝取轉(zhuǎn)運(yùn)，也是脂肪酸β氧化的關(guān)鍵因子，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充肉堿可以在一定程度上減輕抗精神分裂癥藥介導(dǎo)的肝臟脂質(zhì)積聚[22]，進(jìn)一步說(shuō)明OCTN2在抗精神分裂癥藥介導(dǎo)的脂代謝紊亂中的關(guān)鍵作用；PPARα是脂肪分解過(guò)程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，參與CPT1A和OCTN2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[25-26]．我們發(fā)現(xiàn)奧氮平通過(guò)減少PPARα的入核，下調(diào)下游脂肪酸氧化關(guān)鍵因子CPT1A和OCTN2的蛋白表達(dá)，抑制脂肪酸的β氧化，脂質(zhì)分解減弱．Ola介導(dǎo)的脂質(zhì)代謝紊亂是脂質(zhì)合成增多及分解減小共同作用的結(jié)果．

5 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：2周Ola給藥處理后，SD大鼠出現(xiàn)脂質(zhì)代謝紊亂，該效應(yīng)與Ola劑量存在顯著相關(guān)，尤其是臨床常用劑量(1.0 mg/kg和2.0 mg/kg)存在較大的誘發(fā)脂代謝紊亂的風(fēng)險(xiǎn)．該副反應(yīng)可能與Ola上調(diào)脂肪合成因子SREBP1及其下游靶標(biāo)基因Fasn，Acc1，Scd1和下調(diào)脂肪酸氧化相關(guān)因子PPARα，CPT1A和OCTN2有關(guān)(圖5)．

圖5 奧氮平介導(dǎo)肝臟脂代謝紊亂的可能通路