方小梅， 羅近瑜， 黃科慧， 劉 洋，徐 鑫， 張 建， 易澤林

1. 西南大學(xué) 農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院，重慶 400715；2. 古浪縣防沙治沙技術(shù)推廣中心，甘肅 武威 733100

多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase，PG)是一種參與多種植物發(fā)育過程的果膠消化酶．果膠是一種雜多糖，它是雙子葉植物體細胞初生細胞壁的主要成分，同時也是花粉內(nèi)壁和花粉管壁的主要成分，因此，參與果膠代謝相關(guān)酶和蛋白對植物的生長和生殖發(fā)育至關(guān)重要[1]．PG基因?qū)儆谥参镏械拇蠡蚣易?，在擬南芥[2]、楊樹[3]、蘋果[4]、葡萄[5]和玉米[6]等物種中均進行了PG家族基因的鑒定和表達模式研究．PG基因參與植物發(fā)育的不同階段，如種子萌發(fā)，器官脫落，莢和花藥開裂，花粉粒成熟，花粉管生長，和木質(zhì)部細胞形成[7]．在水稻中的超表達PG基因降低了果膠組分和細胞粘著力，同時，還增加了對非生物逆境的敏感性[8]；而在蘋果中PG基因的超表達導(dǎo)致葉片形態(tài)發(fā)育不正常，果實脫落等表型[9]．PG基因的表達水平在不同器官和組織中顯著不同[10]，超過50%的擬南芥PG基因在花卉組織中高度表達[11]．?dāng)M南芥中的PGX1參與細胞的伸長、膨脹和花的生長和發(fā)育；PGX2能夠促進擬南芥子葉下胚軸的伸長、葉的擴張、莖的木質(zhì)化等；QRT2、ADPG1和ADPG2對擬南芥生殖發(fā)育過程中花粉粒等不同的細胞分裂具有很重要的作用[12-14]．

目前，栽培甜蕎均為自交不親和的兩型花作物，包括長柱花和短柱花，長柱花(L-morph Flower)也稱“Pin”型花，具有長花柱和短雄蕊；短柱花(S-morph Flower)也稱“Thrum”型花，具有短花柱和長雄蕊．這種花粉的互位方式減少了花粉的浪費，促進了異花授粉，提供了花粉的適應(yīng)性[15]，同時，也極易受到環(huán)境影響，開花期出現(xiàn)陰雨天則會導(dǎo)致結(jié)實率降低而影響產(chǎn)量．國內(nèi)外多個研究團隊已利用自交可育野生蕎麥Fagopyrumhomotropicum[16]，通過種間雜交的方式(Fagopyrumesculentum和F.homotropicum)培育出自交可育的等柱花甜蕎，即花柱與雄蕊等長，且自交可育．依據(jù)實驗室前期對甜蕎長、短和等柱花雌雄蕊轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，獲得一個PG基因編碼序列，命名為FePG1，本研究擬對FePG1基因進行基因克隆，系統(tǒng)進化分析，亞細胞定位及表達模式分析，以期為今后驗證甜蕎PG基因家族成員調(diào)控甜蕎花柱異長及作用機理提供理論參考．

1 材料與方法

1.1 供試材料

以花柱異長的自交不親和甜蕎品種烏克蘭大粒蕎和酉蕎2號，花柱等長的自交親和甜蕎品種甜自21和貴甜2號為試驗材料．種植于西南大學(xué)科研基地，于盛花期采集開花當(dāng)日長勢一致的花朵收集其雌雄蕊，置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆茫送?，于盛花期取烏克蘭大粒蕎短柱花的根、莖、葉、花和幼嫩籽粒，置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?/p>

利用Biospin多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(博日，杭州)提取RNA，再經(jīng)瓊脂糖電泳檢測RNA降解和污染情況．用RNA Nano 6000 Assay Kit of the Agilent 生物分析儀 2100 system (Agilent Technologies，CA，USA)檢測RNA完整性，用NanoPhotometer?分光光度計(IMPLEN，CA，USA)檢測RNA的純度，用Qubit?RNA Assay Kit in Qubit?2.0熒光計(Life Technologies，CA，USA)檢測RNA的濃度．利用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)(TaKaRa，北京)試劑盒進行cDNA的合成，于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?/p>

1.2 甜蕎FePG1基因克隆

實驗室前期已利用烏克蘭大粒蕎長柱花、短柱花和甜自21等柱花雌雄蕊總RNA進行了轉(zhuǎn)錄組測序，分析測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)FePG1基因在烏克蘭大粒蕎短柱花中高表達、在等柱花中不表達．本研究以烏克蘭大粒蕎短柱花雌雄蕊cDNA為模板，引物序列FePG1-F(5’-ATGGCCACGTTTTGGATTTGTATG-3’)和FePG1-R(5’-TAGCAGTGAACAGGAGGAAGC-3’)，利用PrimeSTAR Max Premix(2X)聚合酶(TaKaRa，北京)進行PCR擴增．?dāng)U增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，用SanPrep柱式DNA凝膠回收試劑盒(Sangon Biotech，上海)對擴增的目的片段進行回收．將目的基因?qū)氲絧MD19-T(TaKaRa，北京)中，經(jīng)藍白斑篩選，挑取白色單菌落到100 μg/mL的LB(Luria-Bertani)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，送至北京華大基因進行測序．

1.3 甜蕎FePG1基因生物信息學(xué)分析

將測序正確的甜蕎FePG1基因序列翻譯成氨基酸，通過ExPASy-prosite (http//www.expasy.org)分析甜蕎FePG1基因的CDS序列保守結(jié)構(gòu)域．編碼蛋白理化性質(zhì)分析和蛋白親水性預(yù)測利用在線工具ProtParam(https：//web.expasy.org/protparam/)進行分析和預(yù)測；編碼蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)分析通過TMpred工具(https：//embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html)進行分析；編碼蛋白信號肽預(yù)測利用在線工具SignalP(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進行預(yù)測．FePG1基因的蛋白序列在NCBI(National Center for Biotechnology Information)數(shù)據(jù)庫中執(zhí)行BlastP搜索(https：//blast.ncbi．nlm．nih．gov /Blast．cgi)．選取來源于30個不同被子植物的PG同源蛋白，采用 MEGA 7.0軟件的鄰接法(NJ)構(gòu)建蛋白序列的系統(tǒng)發(fā)育樹．

1.4 甜蕎FePG1基因的表達分析

分別以兩個自交不親和甜蕎品種烏克蘭大粒蕎和酉蕎2號長柱花、短柱花雌雄蕊cDNA及兩個自交親和甜蕎品種甜自21和貴甜2號等柱花雌雄蕊cDNA為模板，用Primer Primer 5.0軟件設(shè)計基因特異性引物FePG1-F(5’-CCGGAATTCATGGCCACGTTTTGGATTTG-3’)和FePG1-R(5’-TGCTCTAGATTAGCAGTGAACAGGAGGAAGC-3’)．使用TB GreenTMPremix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)試劑盒(TaKaRa，北京)檢測甜蕎FePG1基因在不同花柱類型中的表達差異．以烏克蘭大粒蕎短柱花的根、莖、葉、花和幼嫩籽粒cDNA為模板(PCR反應(yīng)體系和循環(huán)參數(shù)同上)，檢測甜蕎FePG1基因的組織表達情況．

1.5 甜蕎FePG1基因的亞細胞定位

將本實驗室保存的煙草種子播種至裝滿基質(zhì)土的花盆(15 cm×15 cm×12 cm)中，花盆置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為光周期16/8(光照/黑暗) h、溫度25 ℃、濕度60%，待培養(yǎng)4周后備用．根據(jù)目的基因FePG1的序列設(shè)計帶有StuI酶切位點的引物FePG1-F(5’-AAAAGGCCTATGGCCACGTTTTGGATTTG-3’)和FePG1-R(5’-TTTTCCGGATTAGCAGTGAACAGGAGGAAGC-3’)，擴增FePG1基因的ORF(開放閱讀框)區(qū)域，擴增產(chǎn)物經(jīng)切膠回收．用限制性內(nèi)切酶StuI對pH=7 LIC5.0-TET2rc-N-eGFP進行單酶切．酶切產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳，回收純化目的條帶，用T4連接酶將擴增產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物經(jīng)12 h連接，而后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，12 h培養(yǎng)，挑取陽性克隆進行菌液PCR驗證，驗證成功的單克隆子擴大培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒并進行酶切驗證．依據(jù)pH=7 LIC5.0-TET2rc-N-eGFP的StuI酶切骨架設(shè)計引物F(5’- ACGTCTATATCATGGCCGACA-3’)和R(5’-GTGACTCCCTTAATTCTCATGTATGATA-3’)，將得到重組質(zhì)粒pH=7 LIC5.0-N-eGFP-FePG1測序驗證．將重組質(zhì)粒pH=7 LIC5.0-N-eGFP-FePG1和對照質(zhì)粒pH=7 LIC5.0-TET2rc-N-eGFP分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101．將菌液進行PCR檢測后再注射到煙草葉片背面，經(jīng)過常溫黑暗處理12 h后觀察葉片信號．切取侵染3 d后的煙草葉片進行制片，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光在煙草下表皮細胞內(nèi)的分布情況．

2 結(jié)果與分析

2.1 FePG1基因克隆

利用前期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，以花柱異長的自交不親和甜蕎品種烏克蘭大粒蕎短柱花雌雄蕊cDNA為模板，通過PCR擴增得到FePG1基因(圖1a)．分析FePG1基因的CDS片段，全長1 215 bp，編碼404個氨基酸(圖1b)．相對分子質(zhì)量為4.3×104，化學(xué)分子式為C1895H3018N508O596S18，等電點為5.19.其中包括30個親水性氨基酸(Arg+Lys)、42個酸性氨基酸(Asp+Glu)、39個堿性氨基酸(Arg+Lys+His)和132個疏水性氨基酸(Ala，Lle，Leu，Met，Val)．使用NCBI中Conserved Domains對FePG1蛋白序列進行功能結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果表明該蛋白含有一個典型PL-6(多糖裂解酶，大多與果膠的形成及功能關(guān)系密切)超家族結(jié)構(gòu)域(圖1c)，占該基因序列的90%以上．

圖1 甜蕎FePG1基因克隆(a)、cDNA序列和氨基酸序列(b)和PL-6超家族結(jié)構(gòu)域(c)

2.2 甜蕎FePG1蛋白序列及分子系統(tǒng)發(fā)育分析

利用ProtParam預(yù)測得到FePG1蛋白親水性平均系數(shù)為+0.058，脂肪族氨基酸指數(shù)為95.30，再利用ProtScal進一步分析疏水性氨基酸多于親水性氨基酸，疏水性最大值為3.189(第10位和第12位的氨基酸)，最小值為-2.467(第259位的氨基酸)(圖2a)，推測FePG1基因編碼的蛋白為疏水性蛋白．

通過信號肽預(yù)測在線工具SignalP分析得出，F(xiàn)ePG1蛋白為信號肽的可能性為0.999，其他類型僅0.001(圖2b)．因此，該蛋白存在信號肽，屬于分泌性蛋白．

系統(tǒng)發(fā)育分析表明(圖2c)，甜蕎FePG1蛋白與石竹目藜科作物甜菜、菠菜同源蛋白的親緣關(guān)系較近，其次為大戟科的橡膠樹、木薯，以及楊柳科的楊樹、柳樹等；與擬南芥親緣關(guān)系較遠．

圖2 FePG1蛋白序列、空間結(jié)構(gòu)分析及系統(tǒng)發(fā)育進化樹

2.3 FePG1基因的表達驗證及表達模式分析

在課題組前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，為了驗證FePG1基因在甜蕎中的表達情況，本研究分別提取了盛花期烏克蘭大粒蕎長柱和短柱花雌雄蕊、甜自21等柱花雌雄蕊、酉蕎2號長柱和短柱花雌雄蕊、貴甜2號等柱花雌雄蕊進行驗證．通過qRT-PCR技術(shù)分析，結(jié)果表明FePG1基因在自交親和甜蕎品種貴甜2號和甜自21的雌雄蕊中幾乎不表達，在自交不親和甜蕎烏克蘭大粒蕎和酉蕎2號中高表達，且在短柱花雌雄蕊表達量均顯著高于長柱花雌雄蕊(圖3a)．

為了進一步分析FePG1基因的組織表達特異性，提取盛花期烏克蘭大粒蕎的根、莖、葉、花和幼嫩籽粒通過qRT-PCR進行表達驗證，結(jié)果表明FePG1基因只在花中高表達，在根、莖、葉和幼嫩籽粒中基本不表達(圖3b)，在甜蕎花中特異性表達．

GT和TZ分別表示自交親和等柱花甜蕎品種貴甜2號(GT)和甜自21(TZ)，WC和WD分別表示自交不親和甜蕎烏克蘭大粒蕎長柱花和短柱花，YQC和YQD分別表示自交不親和甜蕎酉蕎2號長柱花和短柱花．圖a和圖b中不同小寫字母表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)．

2.4 FePG1基因的亞細胞定位分析

FePG1基因注釋為轉(zhuǎn)錄因子，為了在亞細胞水平上研究FePG1基因的表達情況，利用注射法侵染煙草下表皮觀察FePG1-eGFP融合蛋白和eGFP空載蛋白．以eGFP空載蛋白為對照，由于其在細胞中的定位沒有特異性，所以在細胞膜和細胞核中觀察到熒光信號(圖4a)．在煙草葉片細胞中檢測到FePG1-eGFP分布較多，主要集中于細胞膜和細胞質(zhì)中(圖4b)．

從左至右，分別為GFP熒光、明場、GFP熒光信號和明場疊加圖．

3 結(jié)論與討論

甜蕎屬于蓼科蕎麥屬作物．前人對蕎麥屬作物甜蕎、苦蕎和金蕎麥籽粒轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果表明，與蕎麥屬同源基因最多的物種是甜蕎(23%)、葡萄(11.3%)[17]．對甜蕎花序[18]、籽粒[19]轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果表明甜蕎與葡萄、碧桃、蓖麻、毛果楊親緣關(guān)系較近．本研究從甜蕎雌雄蕊中克隆到的FePG1 蛋白，經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育分析，與石竹目藜科作物甜菜、菠菜，以及大戟科和楊柳科同源蛋白的親緣關(guān)系較近，與前人研究結(jié)果一致．

多聚半乳糖醛酸酶在細胞分離的生命周期過程中起著重要作用，對擬南芥細胞壁修飾、脫落和開裂均有重要影響[12]．50%以上擬南芥的PG基因在花組織中高表達[11]．本文研究基于前期轉(zhuǎn)錄組測序克隆了一個FePG1基因，利用兩個自交親和甜蕎和兩個自交不親和甜蕎為材料，qRT-PCR實驗表明FePG1基因在自交親和甜蕎雌雄蕊中不表達，在自交不親和甜蕎中表達，且其表達量在短柱花雌雄蕊中顯著高于長柱花，表明FePG1基因可能與甜蕎自交不親和有關(guān)，且與花柱異長發(fā)育有關(guān)．

多聚半乳糖醛酸酶是GH28家族的果膠降解糖苷水解酶的重要成員之一，GH28亞細胞定位顯示存在針對分泌途徑的信號序列[7]．本研究通過亞細胞定位證明FePG1蛋白為存在于細胞膜和細胞質(zhì)的跨膜蛋白，與本實驗FePG1蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果相吻合．據(jù)此，我們推斷FePG1基因編碼是一種存在于細胞膜和細胞質(zhì)中的跨膜蛋白，但是否與分泌途徑有關(guān)系需進一步探究．