許丙嵩，陳 浩，胡 磊，王 慧

(皖南醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，安徽 蕪湖 241002)

氨基酸是人體內(nèi)一種非常重要的生物分子，其不僅作為蛋白質(zhì)的基本組成單元，在生物體其他諸多生理過程中也扮演著不可或缺的作用，如攝入色氨酸可以刺激神經(jīng)遞質(zhì)血清素的合成和釋放，從而改善情緒和睡眠；體內(nèi)半胱氨酸水平異常會(huì)導(dǎo)致皮膚病、肝病的發(fā)生；即使是最小的非必須氨基酸，如甘氨酸也具有廣譜的抗炎、細(xì)胞保護(hù)和免疫調(diào)節(jié)特性[1-4]。因此在生命科學(xué)領(lǐng)域?qū)Π被岬臋z測(cè)十分重要。組氨酸是一種用于蛋白質(zhì)合成的α-氨基酸，通常被認(rèn)為是嬰兒和兒童的半必需氨基酸，其對(duì)成人的重要性也在不斷被研究證實(shí)。在人體的正常生理活動(dòng)中，組氨酸的作用是至關(guān)重要的，其支鏈上的咪唑環(huán)具有較高的反應(yīng)活性，是許多金屬蛋白和一些特定酶的反應(yīng)位點(diǎn)，所以組氨酸在生物體系中金屬離子的傳輸和神經(jīng)遞質(zhì)的傳送等方面起著重要作用。但是組氨酸在人體內(nèi)的含量必須保持在一定的范圍內(nèi)，組氨酸含量的異常往往與許多疾病息息相關(guān)，比如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肺疾病、血栓障礙、急性肝衰竭、慢性腎疾病甚至認(rèn)知障礙等[5-7]。因此，探索一種簡潔高效的方法用于檢測(cè)體內(nèi)的組氨酸具有重要的科學(xué)意義。

目前用于檢測(cè)組氨酸的方法有庫侖滴定法、高效液相色譜法、循環(huán)伏安法等[8-10]。但這些方法存在著穩(wěn)定性差、分析設(shè)備昂貴、操作復(fù)雜耗時(shí)等劣勢(shì)，而且還不能滿足在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行組氨酸含量的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。近幾十年來，隨著熒光顯微技術(shù)的快速發(fā)展，熒光探針技術(shù)在化學(xué)、生命科學(xué)及基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域逐漸發(fā)展成為重要的研究工具。與傳統(tǒng)的檢測(cè)手段相比，熒光探針具有分析靈敏度好、選擇性好、操作簡便、發(fā)光可調(diào)節(jié)性、對(duì)生物樣品損傷小、可視化觀測(cè)等優(yōu)勢(shì)[11-16]，已經(jīng)受到越來越多的研究者關(guān)注。目前，只有少許識(shí)別組氨酸和含組氨酸的蛋白質(zhì)的熒光探針被報(bào)道，這些探針大部分是以有機(jī)小分子或銅離子絡(luò)合物為受體[17-18]，通常它們有熒光壽命短，光穩(wěn)定性差，對(duì)細(xì)胞有損傷等缺點(diǎn)，不利于長時(shí)間追蹤和檢測(cè)體內(nèi)的組氨酸。近年來，銥（III）配合物具有較大的Stokes 位移、較長的熒光壽命、發(fā)射波長易受配體結(jié)構(gòu)影響等特點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于生物顯影、化學(xué)傳感等方面[19-24]。例如，2008 年，Kwok-Yin Wong[25]課題組開發(fā)了一種“switch-on”型的銥配合物探針1-CF3SO3。在分子中引入了溶劑分子乙腈和水以作為組氨酸的識(shí)別位點(diǎn)。2011 年，李富友[26]科研小組基于上述思想，報(bào)道了一種非發(fā)射的環(huán)金屬銥配合物熒光探針LIr1，在分子設(shè)計(jì)中，引入了溶劑分子二甲基亞砜，該探針具有高的信噪比和良好的生物相容性?；谇捌诠ぷ?，2013年，李富友課題組[27]又設(shè)計(jì)合成了一系列非發(fā)射型的環(huán)金屬銥配合物（LIr1-LIr8），并在分子中引入了不同的末端基團(tuán)、溶劑配體以及抗衡離子。

基于上述思想，本文以4-(2-吡啶基)苯甲醛和IrCl3·3H2O 為原料，設(shè)計(jì)合成了一種新型的銥配合物熒光探針(IrL)(圖1)，在分子末端引入醚氧鏈基團(tuán)，以提高分子的生物相容性，系統(tǒng)研究了探針I(yè)rL 對(duì)組氨酸的響應(yīng)機(jī)制，初步探索了探針在細(xì)胞成像方面的應(yīng)用。

圖1 探針I(yè)rL 的合成路線圖

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

試劑：IrCl3·3H2O (99.9%)，4-(2-吡啶基)苯甲醛(95%)，牛血清白蛋白BSA(96%)，均購自阿拉丁試劑有限公司，其它藥品和試劑為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。小牛胸腺DNA，RNA 來源于面包酵母，購自Thermo Fisher 公司。人肝癌細(xì)胞株(HepG2)來源于皖南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室。

儀器：NicoLet FT-IR-is5 型傅里葉變換紅外光譜儀(KBr 壓片，日本島津有限公司)；基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀MALDI-TOF (德國布魯克公司)；Bruker Avance 400 核磁共振儀(TMS為內(nèi)標(biāo)，瑞士布魯克公司)；UV-5900 PC 紫外分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)；HITACHI F-4600 熒光分光度計(jì)(日本日立公司)。

1.2 探針I(yè)rL 的合成

N2氛圍，避光，在100mL三頸燒瓶中依次加入M1(1.34g,4mmol)，IrCl3·3H2O(0.70g,2mmol)，乙二醇單乙醚(15mL)和水(5mL)，在110oC 下反應(yīng)24 h，反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，有橘色固體析出，減壓抽濾，用乙醇洗滌，得橘色固體M2。稱取M2(0.28 g，0.16 mmol)，硝酸銀(0.07 g，0.326 mmol)和乙腈(30 mL)依次放入100 mL 三頸燒瓶中，N2保護(hù)下回流反應(yīng)24 h，反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，減壓抽濾，濃縮濾液，加入少量二氯甲烷，再次減壓抽濾，除去過量的硝酸銀，濃縮濾液，得紫黑色固體IrL 0.38 g。IR (selected bands,cm-1):3442,2923,2867,2426,1636,1607,1562,1478,1431,1384,1272,1196,1097,779,755,570.1H NMR(d6-DMSO,400 MHz)δ:1.08-1.10(t,3 H),2.07 (s,3H),3.23-3.24 (d,2H),3.30-3.53 (m,24 H),3.59(s,2H),4.18-4.21(m,3H),4.56(s,1H),5.74-5.92(m,2H),6.84-6.98(m,2H),7.40-7.46(m,1 H),7.59-7.93 (m,4 H),8.06-8.07 (d,1H),8.26-8.37 (m,3 H),8.68-8.83 (m,1H),9.48-9.64 (m,2H).13C NMR (d6-DMSO,151 MHz) δ:166.7,152.4,128.2,126.9,125.6,125.4,123.9,122.1,120.9,118.5,72.7,72.1,71.9,71.7,70.3,70.2,70.0,69.68,69.4,66.0,60.6,58.4,57.7,15.6,1.6.MALDI-TOF:calculated 997.345,found 935.153 [MNO3-]+.

1.3 光譜性能測(cè)試

用二甲基亞砜溶劑配制探針I(yè)rL 的母液濃度為10-3moL/L。選擇L-苯丙氨酸(Phe)、L-丙氨酸(Ala)、L-谷氨酰胺(Gln)、L-谷氨酸(Glu)、L-精氨酸(Arg)、L-賴氨酸(Lys)、L-亮氨酸(Leu)、L-酪氨酸(Tyr)、L-脯氨酸(Pro)、L-色氨酸(Try)、L-絲氨酸(Ser)、L-蘇氨酸(Thr)、L-天冬氨酸(Asp)、L-纈氨酸(Val)、L-異亮氨酸(Iso)、L-組氨酸(His)、L-半胱氨酸(Cys)、牛血清白蛋白(BSA)、脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、谷胱甘肽(GSH)、焦磷酸鈉(ppi)作為生物分子來源。在測(cè)試過程中，移取50 μL 的探針溶液，置于5 mL 的容量瓶中，用磷酸鹽(PBS)緩沖溶液(pH=7.4)定容，在所有的紫外可見吸收和熒光光譜測(cè)試中，探針I(yè)rL 的濃度為10 μmol/L。熒光光譜的測(cè)試條件：激發(fā)波長為405nm，狹縫寬度均為10.0 nm，電壓為500 V。

1.4 細(xì)胞毒性與成像

使用人肝癌細(xì)胞株(HepG2)細(xì)胞作為研究對(duì)象，將可傳代的HepG2 細(xì)胞接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37oC，5%CO2條件下培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度長至70-80%左右時(shí)，在培養(yǎng)基中分別加入不同濃度的探針I(yè)rL(5-30 μmol/L)，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組和調(diào)零組，每組設(shè)三組平行實(shí)驗(yàn)。孵育24 h 后，每孔加入10 μL 3-(4,5-二甲基噻唑-2)2,5-二苯基四氮唑溴鹽)(MTT)溶液(10 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。移除培養(yǎng)基，每孔加入100 μL 二甲基亞砜，恒溫低速震蕩15 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm 處每個(gè)孔的吸光值。

將可傳代的HepG2 細(xì)胞接種于共聚焦小皿中，細(xì)胞密度長至60%左右時(shí)，分別進(jìn)行以下兩個(gè)實(shí)驗(yàn)：(1)探針I(yè)rL(10 μmol/L)加到共聚焦小皿培養(yǎng)30min，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗兩遍，可直接用于顯影。(2) 用4%的多聚甲醛常溫固定細(xì)胞15 min 后，用PBS 沖洗三遍，然后加入含有探針I(yè)rL(10 μmol/L)的新鮮培養(yǎng)基，在37oC 條件下培養(yǎng)20 min，PBS 洗三遍，隨后進(jìn)行顯影。

2 結(jié)果與討論

2.1 選擇性實(shí)驗(yàn)

選擇性是評(píng)價(jià)探針性能的重要指標(biāo)。人體內(nèi)環(huán)境復(fù)雜，探針在細(xì)胞內(nèi)可能會(huì)受到生物大分子如DNA，RNA，BSA 以及其他各種氨基酸的影響。為了確定探針對(duì)組氨酸的選擇性，利用熒光光譜對(duì)探針進(jìn)行選擇性測(cè)試。向探針中分別加入DNA，RNA，BSA 以及其他氨基酸，并觀察探針對(duì)它們的熒光響應(yīng)。如圖2(a)所示，探針I(yè)rL 本身熒光很弱，當(dāng)向探針I(yè)rL 中加入20 倍當(dāng)量的組氨酸和BSA(一種含組氨酸的蛋白質(zhì))時(shí)，探針I(yè)rL 顯示出明顯的熒光增強(qiáng)現(xiàn)象，并伴隨著明亮的綠色熒光(圖2(b))，而加入其他的生物分子，如DNA、RNA 和其他氨基酸后，探針I(yè)rL 的熒光強(qiáng)度沒有發(fā)生顯著的變化。說明探針I(yè)rL 可專一響應(yīng)組氨酸，是一種識(shí)別組氨酸和含組氨酸的蛋白質(zhì)的光開關(guān)型熒光探針。

圖2 (a)探針I(yè)rL 與各種生物分子作用后的熒光發(fā)射光譜；(b)在紫外燈(365 nm)照射下，探針I(yè)rL 加入組氨酸前后的熒光照片。

為了進(jìn)一步證明探針I(yè)rL 在與其他生物大分子存在時(shí)仍對(duì)組氨酸具有較高的選擇性，進(jìn)行了與其他生物分子共存的競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)。在相同情況下，分別在探針I(yè)rL 的PBS 緩沖液中加入20 倍當(dāng)量的其他生物分子和等量的組氨酸，測(cè)試加入組氨酸前后，探針與其他生物分子作用后熒光強(qiáng)度比值(I/I0)的變化。結(jié)果如圖3 可知，在加入組氨酸前，探針I(yè)rL 與其他生物分子作用后的熒光強(qiáng)度比值較低(I/I0<10)，而當(dāng)組氨酸與其他生物分子共存時(shí)，探針I(yè)rL 的熒光強(qiáng)度比值明顯增強(qiáng)(I/I0>60)，這表明在其他生物分子的存在下，探針I(yè)rL 對(duì)組氨酸依舊有很高的選擇性，而且不受其他生物分子的干擾。

圖3 其他生物分子對(duì)探針I(yè)rL 識(shí)別組氨酸的影響。1,Cys;2,DNA;3,GSH;4,ppi;5,RNA;6,Phe;7,Ala;8,Glu;9,Gln;10,Arg;11,Lys;12,Leu;13,Tyr;14,Val;15,Pro;16,Trp;17,Ser;18,Thr;19,Asp;20,IIe;21,BSA;22,His.

2.2 熒光滴定實(shí)驗(yàn)

為了進(jìn)一步探究探針I(yè)rL 和組氨酸的作用過程，測(cè)得了組氨酸滴加至探針I(yè)rL 的PBS 溶液過程中熒光發(fā)射光譜的變化。如圖4(a)所示，隨著組氨酸的加入，探針I(yè)rL 的發(fā)射峰強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。以探針I(yè)rL 在500 nm 處加入組氨酸后的熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，組氨酸的濃度為橫坐標(biāo)作圖，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4(b)所示，探針I(yè)rL 的熒光強(qiáng)度與組氨酸的濃度在0-1.8×10-4mol/L 范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系，其線性回歸方程為y=4.92x-19.13 (R2=0.97)，利用公式3σ/slope[28](slope 為方程中的斜率)可計(jì)算出檢測(cè)限為0.132 μmol/L。

圖4 (a)探針I(yè)rL 與不同濃度組氨酸反應(yīng)的熒光發(fā)射光譜圖;(b)探針I(yè)rL 的熒光強(qiáng)度值與組氨酸濃度之間的關(guān)系。

2.3 識(shí)別機(jī)理研究

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果并結(jié)合有關(guān)文獻(xiàn)[25-27,29]，本文初步推測(cè)了探針I(yè)rL 與組氨酸可能的反應(yīng)機(jī)理，如圖5 所示。為了進(jìn)一步驗(yàn)證此推測(cè)，借助MALDI-TOF 質(zhì)譜圖研究探針和組氨酸結(jié)合后的產(chǎn)物，從圖6 中可以看出，探針I(yè)rL 與組氨酸結(jié)合后，在質(zhì)譜圖中找到一個(gè)與產(chǎn)物IrL-Histidine 相對(duì)應(yīng)的峰，出峰位置在1008.180，這表明探針中的乙腈分子被組氨酸所取代并形成相應(yīng)的產(chǎn)物。為進(jìn)一步理解探針I(yè)rL 對(duì)組氨酸的光學(xué)響應(yīng)，通過激發(fā)態(tài)的密度泛函理論來研究探針I(yè)rL 與組氨酸反應(yīng)前后的電荷變化，計(jì)算采用G09 程序和6-31G*基組(對(duì)于C、H、N、O 原子)及LanL2dz 基組(對(duì)于Ir 原子)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7 和表1 所示。理論計(jì)算結(jié)果表明探針I(yè)rL 在500 nm 處的發(fā)射峰是HOMO 到LUMO 的躍遷，HOMO 和LUMO 軌道的電子云主要集中在配體L 上，是LLCT 躍遷；與組氨酸反應(yīng)后，產(chǎn)物IrL-Histidine 最大發(fā)射峰理論值在504 nm 處，HOMO 軌道上的電子云主要集中在組氨酸配體上，LUMO 軌道上的電子云主要集中在配體L 和金屬銥上，是L1L2CT 和L1MCT 的躍遷，反應(yīng)前后電子云轉(zhuǎn)移的不同，有可能會(huì)提高探針的熒光強(qiáng)度。理論計(jì)算結(jié)果與熒光發(fā)射光譜的實(shí)驗(yàn)值基本一致，也再次證明了識(shí)別機(jī)理的合理性。

表1 探針I(yè)rL 與組氨酸作用前后的理論計(jì)算結(jié)果

圖5 探針I(yè)rL 與組氨酸的可能反應(yīng)機(jī)理圖

圖6 探針I(yè)rL 與組氨酸作用后的MALDI-TOF 譜圖

圖7 探針I(yè)rL 和IrL-Histidine 的分子軌道能級(jí)圖

2.4 細(xì)胞毒性和細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)

高的細(xì)胞存活率是探針在生物學(xué)應(yīng)用的重要條件。在進(jìn)行生物細(xì)胞顯影之前采用標(biāo)準(zhǔn)的MTT 法評(píng)估了探針I(yè)rL 的細(xì)胞毒性。圖8 顯示了探針I(yè)rL 作用細(xì)胞24h 后的細(xì)胞存活率。從圖中可以看出，細(xì)胞存活率隨著探針濃度的增加而下降，但是當(dāng)探針濃度為25 μmol/L，細(xì)胞存活率也保持在80%。綜上所述，探針具有較低的生物毒性，可以良好的適用于生物學(xué)研究。

圖8 不同濃度的探針I(yè)rL 對(duì)HepG2 細(xì)胞的毒性測(cè)試。

利用激光共聚焦顯微鏡對(duì)探針I(yè)rL 進(jìn)行細(xì)胞成像研究，由圖9 可知，探針I(yè)rL 與HepG2 細(xì)胞共孵育30 min 后，在細(xì)胞內(nèi)的熒光較弱，可能是由于探針分子較大，不利于其進(jìn)入活體細(xì)胞；但當(dāng)HepG2 細(xì)胞用4%多聚甲醛固定后，發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞的細(xì)胞核區(qū)域展現(xiàn)出較強(qiáng)的熒光信號(hào)，說明探針是與細(xì)胞內(nèi)的組氨酸結(jié)合從而發(fā)出明亮的熒光。此結(jié)果表明探針I(yè)rL 可著色固定細(xì)胞的細(xì)胞核區(qū)域。

圖9 探針I(yè)rL 在活的HepG2 細(xì)胞和固定后的HepG2 細(xì)胞中的共聚焦成像圖。標(biāo)尺為20 μm。

3 結(jié)論

本文設(shè)計(jì)合成了一種用于檢測(cè)組氨酸和含組氨酸的蛋白質(zhì)的環(huán)金屬銥配合物探針I(yè)rL。結(jié)果表明，探針I(yè)rL 可專一性識(shí)別組氨酸和含組氨酸的蛋白質(zhì)伴隨著熒光增強(qiáng)現(xiàn)象，且不受其他生物分子的影響。利用質(zhì)譜和理論計(jì)算研究了探針識(shí)別組氨酸的機(jī)理，結(jié)果表明探針中的乙腈分子被組氨酸取代并形成相應(yīng)的產(chǎn)物。細(xì)胞成像結(jié)果表明探針I(yè)rL 主要聚集在固定細(xì)胞的細(xì)胞核區(qū)域。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果為后期設(shè)計(jì)銥配合物熒光探針識(shí)別生物體內(nèi)的組氨酸奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。