王 歡， 劉明珠， 蘆永昌*

(1.青海民族大學(xué)藥學(xué)院，青海 西寧 810007；2.青海省青藏高原植物資源化學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810007；3.青海省藥物分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810007；4.青海省現(xiàn)代藏藥創(chuàng)制工程技術(shù)研究中心，青海 西寧 810007)

高山辣根菜(Pegaeophytonscapiflorum)為十字花科植物無(wú)莖薺的干燥根和根莖[1-3]。根莖頂端有數(shù)個(gè)分枝，有密集橫環(huán)紋，其上有葉柄殘基。根圓柱形，長(zhǎng)5-16cm，直徑0.6-1.5cm。表面黃棕色至灰黃褐色，粗糙，有明顯的皺紋和縱溝。質(zhì)松泡，易折斷，斷面不整齊，皮部淡棕色至黃棕色，木部淡黃白色至淺黃棕色，周邊與中心部呈灰白與黃色相間的花紋?！恫蒯t(yī)卷》記載其主要用于肺熱及肺病引起的咳嗽、咯血、肺水腫、氣管炎和發(fā)熱等的治療。藏醫(yī)經(jīng)典著作中對(duì)其功效的記載為清熱滋陰和涼血止血[4-5]。本試驗(yàn)研究高山辣根菜中多糖的含量。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑、藥材

ST-08B型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(永康市帥通工具有限公司)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(賽墨飛世爾科技有限公司)；UV-Vis 1240型紫外—可見(jiàn)分光光度計(jì)(島津(香港)有限公司)；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市江南儀器廠(chǎng))；電子天平(梅特勒—托力多儀器有限公司)；DZF6050型真空干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

葡萄糖、苯酚、95%乙醇、濃硫酸、0.3mol/L HCl、0.3mol/L NaOH均為分析純。

2020年7月，高山辣根菜采于青海省，經(jīng)青海民族大學(xué)蘆永昌教授鑒定為高山辣根菜。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1對(duì)照品貯備液的制備

精密稱(chēng)取105℃烘干至恒重的葡萄糖對(duì)照品1.0g葡萄糖，用適量蒸餾水溶解再用水定容到100ml容量瓶中，搖勻。再?gòu)闹形?ml移入25ml容量瓶，用水定容，搖勻，即得0.4mg/ml的對(duì)照品貯備液。

1.2.2 苯酚溶液的制備

稱(chēng)取苯酚25.0g，用適量蒸餾水溶解，最后定容于500ml棕色容量瓶中，搖勻，即得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的苯酚溶液，置冰箱中冷藏備用。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備

精密量取標(biāo)準(zhǔn)液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，分別置于10ml容量瓶中，再依次加入1.0(空白對(duì)照)、0.8、0.6、0.4、0.2、0ml蒸餾水使成1.0ml，加入新制的5%苯酚溶液1.0ml，搖勻，迅速沿壁加入濃硫酸5ml，搖勻，室溫冷卻后，加水定容至刻度。將以上樣品于30℃水浴中加熱顯色15min，室溫冷卻，于紫外—可見(jiàn)分光光度計(jì)上490nm波長(zhǎng)處測(cè)其相對(duì)應(yīng)的吸光度，記錄數(shù)據(jù)。以吸光度A對(duì)其相對(duì)應(yīng)的葡萄糖濃度C進(jìn)行線(xiàn)性關(guān)系擬合，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，如圖1所示。研究結(jié)果表明，線(xiàn)性關(guān)系良好，相關(guān)方程為A=0.0191C+0.0291，r=0.9995。

1.2.4 最大吸收波長(zhǎng)的選擇

取對(duì)照品溶液1ml于10ml容量瓶中，以1ml蒸餾水同法顯色做空白，按照1.2.3項(xiàng)下的操作方法顯色，在350-700nm間進(jìn)行紫外光譜掃描(掃描間距2nm)。另取樣品溶液1ml同法顯色重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者均在490nm處有最大吸收峰，因此確定最大檢測(cè)波長(zhǎng)為490nm[6-8]。

1.2.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)和相關(guān)文獻(xiàn)的參考下[9-11]，對(duì)提取過(guò)程采取正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。以高山辣根菜多糖提取液中多糖提取率為考察指標(biāo)，對(duì)工藝中的固液比、提取溫度、提取時(shí)間、提取次數(shù)進(jìn)行考察，因素及水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平Table.1 Orthogonal experimental factors

2 結(jié)果與分析

2.1 提取次數(shù)對(duì)多糖得率的影響

在溫度為85℃中回流提取，固定料液比(液為水)1∶20，提取時(shí)間2h，分別對(duì)2.0g高山辣根菜粉末提取1、2、3、4、5次，過(guò)濾且將濾液定容于50ml容量瓶中。再?gòu)纳鲜鋈芤褐腥?ml定溶于25ml容量瓶。繼續(xù)從以上稀釋的樣品中取1.0ml，加以上顯色劑于10ml容量瓶中顯色，定容后測(cè)其相對(duì)應(yīng)的吸光度，總多糖提取率的結(jié)果如圖2所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，提取3、4、5次的提取率和提取2次時(shí)的提取率相差不大，考慮節(jié)省時(shí)間，最優(yōu)提取次數(shù)選為提取2次。

2.2 固液比對(duì)多糖得率的影響

溫度為85℃中回流提取，固定提取次數(shù)2次，提取時(shí)間2h，分別對(duì)2.0g藥材加入1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30的水進(jìn)行提取，過(guò)濾并將濾液定容于50ml容量瓶中。以上容量瓶中取1ml定溶于25ml容量瓶，再繼續(xù)從以上稀釋后樣品中取1.0ml加入以上顯色劑于10ml容量瓶中顯色定容后測(cè)吸光度，多糖的提取率如圖3所示。由試驗(yàn)結(jié)果可知，料液比在1∶20后提取率增加不明顯，考慮節(jié)省資源，最佳料液比選為1∶20。

2.3 提取時(shí)間對(duì)總多糖提取率的影響

溫度為85℃中回流提取，固定料液比1∶20，提取次數(shù)2次，分別對(duì)2.0g藥材進(jìn)行1、1.5、2、2.5、3h提取，過(guò)濾且將濾液定容于50ml容量瓶中。從上述溶液中移取1ml定溶于25ml容量瓶，再繼續(xù)從以上稀釋液中移取1.0ml，加入顯色劑于10ml容量瓶中顯色定容后測(cè)其相對(duì)應(yīng)的吸光度，結(jié)果如圖4所示。由試驗(yàn)結(jié)果可知，提取時(shí)間為2h后，多糖的提取率增加不明顯，因此，該試驗(yàn)最佳提取時(shí)間選為2h。

2.4 提取溫度對(duì)多糖得率的影響

固定料液比1∶20，提取次數(shù)2次，提取時(shí)間為2h，分別對(duì)2.0g藥材在65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃進(jìn)行提取，過(guò)濾且將濾液定容于50ml容量瓶中。從以上溶液中移取1ml定溶于25ml容量瓶，再?gòu)囊陨舷♂屓芤褐腥?.0ml，加顯色劑于10ml容量瓶中顯色定容后測(cè)其相對(duì)應(yīng)的吸光度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。由研究結(jié)果可知，總多糖提取率在溫度為85℃后提取率變化不大，因此，最佳的提取溫度為85℃。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table.2 Orthogonal test results

表3 總多糖方差分析表Table.3 Analysis of variance of total polysaccharides

從表2可以看出，提取高山辣根菜中多糖時(shí)，料液比、提取時(shí)間、水浴溫度和提取次數(shù)四因素對(duì)多糖提取率影響的主次順序?yàn)樘崛囟?提取次數(shù)>提取時(shí)間>固料比，最佳提取工藝為：A2B3C1D2，即固液比為1∶20，提取時(shí)間為2.5h，提取次數(shù)為1次，提取溫度為85℃，在此條件下多糖提取率達(dá)0.16 mg/g。

2.4.1 精密度試驗(yàn)

精密吸取樣品溶液1.0ml，按“1.2.3”項(xiàng)下條件重復(fù)測(cè)定5次，吸光度的RSD=1.58%。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取樣品溶液1ml，按“1.2.3”項(xiàng)下條件操作，每隔20min測(cè)定1次吸光度，重復(fù)測(cè)定6次，RSD為 0.97%。表明在2h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一樣品5份，按“1.2.3”項(xiàng)下條件平行操作，測(cè)得吸光度。RSD為1.05%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.4 加樣回收試驗(yàn)

精密吸取樣品溶液6份，均為 0.2ml，分別加入葡萄糖對(duì)照液 0.1、0.1、0.2、0.2、0.3、0.3ml，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方法測(cè)定吸光度，測(cè)得總生物堿的平均加樣回收率為99.8%，RSD=0.49%。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)選出高山辣根菜中水溶性總多糖的最優(yōu)工藝為：A2B3C1D2，即固液比為1∶20，提取時(shí)間為2.5h，提取次數(shù)為1次，提取溫度為85℃，驗(yàn)證試驗(yàn)證明結(jié)果具有較好的重復(fù)性和精密度。