郭 旭，張 東，孫曉麗，田榮榮?

（1. 北京城市學院 生物醫(yī)藥學部，北京 100094；2. 國家糧食和物資儲備局科學研究院，北京 100037）

近年來，癌癥已成了威脅全世界人類的常見疾病，患病率和死亡率居高不下。在中國，每10分鐘就有55人死于癌癥；全球約有50%的胃癌、肝癌和食道癌病例來自中國[1]。因此，制定新的癌癥防治策略迫在眉睫。紫蘇籽是為唇形科植物紫蘇Perilla frutescens(L.) Britt.的干燥成熟果實，始載于《名醫(yī)別錄》[2]，在藥食同源的植物資源中有很高的地位，作為中藥和功能性食品在全世界廣泛使用。藥典中記載，紫蘇籽可降氣化痰，止咳平喘，潤腸通便，具有抗動脈粥樣硬化[3-4]、改善學習和記憶力[5]、改善視覺功能[6]、抗老年癡呆[7-8]、抗菌抗炎[9-10]、抗癌抗腫瘤[11-14]的功效。

傳統(tǒng)的藥物研發(fā)一直遵循著一種藥物—一個靶點—一種疾病的模式，無疑這種模式局限了研制藥物的思路，實際上臨床上許多疾病都是多基因多靶點的，治療起來十分的復(fù)雜，這時網(wǎng)絡(luò)藥理學應(yīng)運而生。網(wǎng)絡(luò)藥理學是以系統(tǒng)生物學和多學科藥理學為基礎(chǔ)，提供了一種“多靶點、多效應(yīng)、復(fù)雜疾病”的新型網(wǎng)絡(luò)模式[15]，中醫(yī)藥本身也遵循著整體觀和辨證論治，這與網(wǎng)絡(luò)藥理學不謀而合，近年來，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學對中藥的研究越來越多，也取得了較好的成效[16]。分子對接是應(yīng)用計算機模擬配體和受體的結(jié)合，通過結(jié)合能的大小來判斷二者結(jié)合的可能性，通過可視化軟件判斷結(jié)合方式和位置，預(yù)測藥物和靶點蛋白相互作用的概率，現(xiàn)在多用于新藥的研發(fā)，為繁多的實驗節(jié)省時間[17]。目前對于紫蘇籽的研究多集中在功能性食品的開發(fā)上，對于其治療疾病的作用機制和靶點的研究較少，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學和分子對接的方法，對紫蘇籽發(fā)揮作用的靶點和通路進行預(yù)測，希望可以對未來紫蘇籽進一步研究提供思路和方向。

1 材料與方法

1.1 紫蘇籽的活性成分及靶點收集

通過查閱文獻[18-21]并且利用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP）收集紫蘇籽的活性成分，獲得其口服生物利用度（oral bioavailability，OB）、類藥性（drug-likeness，DL）和小腸上皮細胞滲透率（Caco-2 permeability）值及各活性成分對應(yīng)靶點，匯集靶點，并通過Uniprot數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）將藥物靶點的蛋白名稱轉(zhuǎn)換成 GeneCards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）的基因名稱。

1.2 癌癥/腫瘤相關(guān)靶點的搜集

從人類基因數(shù)據(jù)庫（Gene-Cards，https://www.genecards.org/）中收集與關(guān)鍵詞“cancer”和“tumor”相關(guān)的靶點，使用 Venn在線軟件（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）將活性成分靶點—癌癥和腫瘤相關(guān)靶點取交集，獲得紫蘇籽的潛在抗癌和抗腫瘤靶點。

1.3 活性成分—疾病靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及可視化分析

將交集靶點導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件，建立藥物—活性成分—靶點—疾病網(wǎng)絡(luò)圖。圖中節(jié)點（node）代表紫蘇籽、活性成分、靶點、疾病，邊（edge）分別代表活性成分和靶點或靶點和疾病的交互作用。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI網(wǎng)絡(luò)）的構(gòu)建

將篩選得到的潛在抗癌和抗腫瘤靶點導(dǎo)入String（https://string-db.org, version 11.0）在線平臺數(shù)據(jù)庫，以研究靶蛋白相互作用，設(shè)置物種為“Homo sapiens”，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI網(wǎng)絡(luò)）。

1.5 GO功能和KEGG通路富集分析

采用DAVID6.8數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/），對紫蘇籽潛在抗癌和抗腫瘤靶點進行 GO功能分析，以了解靶點的生物學過程，KEGG通路分析研究藥物靶點主要信號通路，DAVID平臺列表與背景均設(shè)置為“Homo sapiens”，GO富集分析選擇生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和細胞組成（cellular component，CC）3個模塊，通路分析選擇 KEGG。

1.6 成分-靶點分子對接

利用 Auto Dock軟件進行分子對接，Pymol進行分子對接可視化分析。在紫蘇籽抗癌抗腫瘤靶點的 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖中選取核心靶點與紫蘇籽活性成分進行分子對接，借助PDB數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）找出靶點蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，靶點AKT1（PDB ID:6NPZ）、TP53（PDB ID:3D06）、MAPK1（PDB ID:4ZZN）。所有受體文件均做刪除原配體、水分子及加氫加電荷處理，配體分子為紫蘇籽活性成分，將整理好的靶點蛋白 3D結(jié)構(gòu)和對應(yīng)化合物的結(jié)構(gòu)導(dǎo)入Auto Dock進行分子對接。目前尚無明確的活性成分靶點選擇的唯一標準，一般認為結(jié)合能<0就有自發(fā)結(jié)合的可能，結(jié)合能>0結(jié)合時可能需要外界力量促使其結(jié)合，結(jié)合能越低結(jié)合的可能就越大[22]，將所得結(jié)果使用Pymol進行可視化處理，得到核心靶點蛋白和對應(yīng)化合物的相互作用關(guān)系圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫蘇籽活性成分及靶點的篩選

口服利用度（OB）和類藥性（DL）是藥物活性成分篩選常用指標，通過 TCMSP數(shù)據(jù)庫，獲得紫蘇籽的化學成分87個，以O(shè)B≥30%、DL≥0.18為條件進行篩選，共篩選得紫蘇籽的活性成分17種，為脂肪酸及其油脂伴隨物。利用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP）檢索到紫蘇籽主要活性成分的對應(yīng)靶點，總計883個，刪除重復(fù)項，共獲得288個活性成分靶點。紫蘇籽主要活性成分信息見表1。

表1 紫蘇籽主要活性成分及其參數(shù)Table 1 Main active ingredients and parameters of perilla seeds

2.2 紫蘇籽活性成分抗癌和抗腫瘤靶點收集

在GeneCards數(shù)據(jù)庫中輸入關(guān)鍵詞“cancer”和“tumor”進行疾病靶點搜索，以score≥20進行篩選，得到 1 646個。利用 Venn在線軟件將紫蘇籽活性成分對應(yīng)的107個藥物靶點（刪除未找到基因名稱的靶點）與癌癥及腫瘤相關(guān)的1 646個疾病靶點取交集，通過Venn圖（如圖1）的形式得到 72個紫蘇籽潛在抗癌和抗腫瘤靶點（見表2）。

圖1 藥物靶點與疾病靶點關(guān)系圖Fig.1 The relationship between drug targets and disease targets

表2 紫蘇籽潛在抗癌和抗腫瘤靶點信息Table 2 Information on potential anti-cancer and anti-tumor targets of perilla seeds

續(xù)表2

2.3 紫蘇籽活性成分-抗癌和抗腫瘤靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用 Cytoscape 3.7.2 軟件建立藥物-活性成分-靶點-疾病的可視化網(wǎng)絡(luò)圖（圖2），共有 118個節(jié)點、126條邊，其中三角形藍色節(jié)點u代表紫蘇籽，11個紫色圓形節(jié)點代表紫蘇籽的活性成分，72個淺藍色菱形節(jié)點代表癌癥和腫瘤靶點，粉色方形節(jié)點代表癌癥和腫瘤，126條邊代表節(jié)點之間的相互作用。節(jié)點的顏色和大小表示該靶點重要性，節(jié)點越大顏色越深說明該節(jié)點越重要。該網(wǎng)絡(luò)中化合物的平均度值為 2.14，由高到低依次為木犀草素（degree=43）、β-胡蘿卜素（degree=21）、豆甾醇（degree=18）、β-谷甾醇（degree=17）、鄰苯二甲酸,丁基異己酯（degree=9）、(E)-(4-甲基亞芐基-(4-苯基三唑-1-基)胺（degree=6）、巨頭鯨魚酸（degree=3）、24-亞甲基苯酚（degree=3）、鈍葉甾醇（degree=3）、枸櫞固二烯醇（degree=3）。由圖可知，木犀草素作用于MET、ADCY2、NUF2、PTGES、CD40LG、INSR、SLC2A4、XIAP、GSTP1、TOP2A、IL4、IFNG、TYR等 41個靶點；β-胡蘿卜素作用于 MMP10、GJA1、F3、CASP7、MYC、CTNNB1、CAV1、CYP1A2、CYP3A4、HMOX1、MMP1、CASP8等 19個靶點；β-谷甾醇作用于MAP2、PON1、TGFB1、PRKCA、BAX、OPRM1、SLC6A4、CHRNA2、GABRA5、PDE3A、CHRM4、GABRA2等15個靶點；豆甾醇作用于CHRNA7、GABRA1、ADRA1B、GABRA3、HTR2A、ADRB1、CTRB1、MAOA、LTA4H等 16個靶點。靶點最多的成分是木犀草素。

圖2 紫蘇籽活性成分-抗癌和抗腫瘤靶點網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Perilla seed active ingredients-anti-cancer and anti-tumor target network

2.4 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

應(yīng)用STRING在線平臺對紫蘇籽的72個潛在抗癌和抗腫瘤靶點進行PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，設(shè)置物種為“Homo sapiens”（人類），將蛋白相互作用評分置信度設(shè)置為0.900，隱藏離散的靶點，獲得 PPI網(wǎng)絡(luò)圖（如圖3）。該網(wǎng)絡(luò)中包含72個節(jié)點，241條邊，平均節(jié)點度為 6.69。根據(jù)節(jié)點度值大小，關(guān)鍵靶點依次有腫瘤抑制蛋白 p53（TP53）、RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT1）、絲裂原激活的蛋白激酶1（MAPK1）、禽肉瘤病毒 17的轉(zhuǎn)化基因（JUN）、腫瘤壞死因子（TNF）、轉(zhuǎn)錄因子 p65（RELA）、白介素 6（IL6）、血管內(nèi)皮生長因子 A（VEGFA）、Myc原癌基因蛋白（MYC）、G1/S-特異性周期蛋白-D1（CCND1）、半胱天冬酶 3（CASP3）、人連環(huán)蛋白β1（CTNNB1）、視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白 1多克隆抗體（RB1）、半胱氨酸蛋白酶8（CASP8）、細胞周期素依賴性激酶抑制因子 1A（CDKN1A）、表皮生長因子（EGFR）這些靶蛋白在 PPI 網(wǎng)絡(luò)中具有重要地位，與其他多個靶點相連，可能與紫蘇籽發(fā)揮抗癌和抗腫瘤作用關(guān)系密切。

圖3 紫蘇籽潛在抗癌和抗腫瘤靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.3 PPI Network of potential anti-cancer and anti-tumor targets of perilla seed

2.5 GO功能富集分析

將紫蘇籽 72個潛在抗癌和抗腫瘤靶點進行GO 富集分析（見圖4），獲得607條生物學過程條目，其中P<0.05的生物學過程有330條，富集的前 30個生物學功能依次為對藥物的反應(yīng)（23個靶點）、凋亡過程的負調(diào)控（22個靶點）、從RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控（27個靶點）、對雌二醇的反應(yīng)（12個靶點）、肝再生（8個靶點）、在沒有配體的情況下的外在凋亡信號通路（8個靶點）、一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控（8個靶點）、積極調(diào)控細胞增殖（16個靶點）、基因表達的正調(diào)控（13個靶點）、對有毒物質(zhì)的反應(yīng)（9個靶點）、酶結(jié)合（24個靶點）、相同的蛋白質(zhì)結(jié)合（23個靶點）、蛋白質(zhì)結(jié)合（64個靶點）、蛋白質(zhì)異二聚活性（17個靶點）、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（13個靶點）、蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)合（10個靶點）、BH3域綁定（4個靶點）、蛋白質(zhì)均二聚活性（16個靶點）、細胞因子活性（9個靶點）、泛素蛋白連接酶結(jié)合（10個靶點）、膜筏（11個靶點）、胞質(zhì)溶膠（34個靶點）、核質(zhì)（30個靶點）、核（42個靶點）、細胞表面（13個靶點）、細胞外空間（19個靶點）、蛋白質(zhì)復(fù)合物（11個靶點）、小窩（6個靶點）、細胞質(zhì)（39個靶點）、受體復(fù)合體（7個靶點）。

圖4 紫蘇籽潛在抗癌和抗腫瘤靶點GO功能富集結(jié)果柱形圖Fig.4 Bar graph of GO enrichment results of potential anti-cancer and anti-tumor targets of perilla seed

2.6 KEGG信號通路分析

對紫蘇籽 72個潛在抗癌和抗腫瘤靶點進行KEGG通路注釋分析，獲得 108條信號通路條目，其中P<0.05的通路有102條，富集的前20條通路分析結(jié)果見表3，包括膀胱癌（Bladder cancer）、甲狀腺癌（Thyroid cancer）、胰腺癌（Pancreatic cancer）、子宮內(nèi)膜癌（Endometrial cancer）、前列腺癌（Prostate cancer）、小細胞肺癌（Small cell lung cancer）、大腸癌（Colorectal cancer）、胃癌（Gastric cancer）、乳腺癌（Breast cancer）等通路，KEGG富集分析可視化圖見圖5，其中Rich Factor（富集因子）數(shù)值越大代表富集程度越大；Pvalue經(jīng)過多重校驗的P值，用綠色－紅色表示，顏色越紅代表P值越小，說明富集越明顯。

表3 紫蘇籽抗癌和抗腫瘤靶點的KEGG通路富集Table 3 Enrichment of KEGG pathway for anti-cancer and anti-tumor targets of perilla seeds

續(xù)表3

圖5 KEGG富集分析可視化圖Fig.5 Visualization of KEGG enrichment analysis

2.7 分子對接結(jié)果

由表4可知，三個靶蛋白與紫蘇籽的三種活性成分木犀草素、豆甾醇和β-胡蘿卜素的結(jié)合能均小于-5 KJ/mol，以上靶點和活性成分均可自發(fā)結(jié)合且結(jié)合的可能性較高。分子對接的結(jié)果還要參考結(jié)合常數(shù) Ki和氫鍵個數(shù)來判斷最終結(jié)合的概率，一般來說，結(jié)合常數(shù)Ki越小越好，氫鍵個數(shù)越多越好。因此對接活性最好的是木犀草素和TP53，二者的對接模型見圖6。

表4 紫蘇籽活性成分與抗癌抗腫瘤潛在作用靶點的分子對接結(jié)果Table 4 Results of molecular docking between active components of perilla seeds and potential anti-cancer and anti-tumor targets

圖6 紫蘇籽抗癌的有效靶點在癌癥通路中的富集分析Fig.6 Enrichment analysis of effective anti-cancer targets of perilla seeds in cancer pathways

圖7 TP53與木犀草素分子對接模型Fig.7 Molecular docking model of TP53 and luteolin

圖8 TP53與木犀草素分子對接2D模式圖Fig.8 2D model diagram of TP53 and luteolin target-molecular docking

3 討論與結(jié)論

紫蘇籽是我國寶貴的藥食同源資源之一，其中含有花生四烯酸、木犀草素、β-谷甾醇、豆甾醇、類胡蘿卜素等多種豐富的活性成分，這些成分在人體中能夠發(fā)揮多重作用，達到防病治病的效果。有關(guān)研究結(jié)果顯示，從先天的遺傳突變，激素影響到日常生活中的煙草，飲食，輻射等都是誘發(fā)癌癥的因素之一[23]。其中日常的飲食中攝入脂肪的含量和種類是與患癌風險有一定相關(guān)性的，這提示我們可以從飲食方面預(yù)防癌癥，干預(yù)癌癥的治療。紫蘇籽的提取物有一定的抗癌抗腫瘤作用，但是其主要活性成分和作用機制尚未得到驗證。通過網(wǎng)絡(luò)分析，獲得紫蘇籽17種主要活性成分，72個抗癌抗腫瘤靶點，其中木犀草素、β-谷甾醇、豆甾醇、類胡蘿卜素與靶點、通路的關(guān)聯(lián)度最高，在紫蘇籽活性成分-抗癌抗腫瘤靶點網(wǎng)絡(luò)中與眾多疾病靶點互相連接，由此可知，這些成分是紫蘇籽抗癌抗腫瘤的重要基礎(chǔ)。通過PPI蛋白網(wǎng)絡(luò)分析可視化我們可以看到與紫蘇籽對癌癥腫瘤發(fā)揮作用的關(guān)鍵靶點分別為：AKT1、TP53、MAPK1、JUN、TNF、RELA、IL6、VEGFA、CASP3、CTNNB1、CCND1、MYC等，參考查閱文獻可知，AKT1[24-25]是與乳腺癌相關(guān)的靶點；TP53[26]是與乳腺癌、肺癌、腦瘤和腎上腺皮質(zhì)癌相關(guān)的靶點；MAPK1是與宮頸癌[27]、胃癌[28]、胰腺癌[29]等相關(guān)的靶點。

通過分子對接，我們發(fā)現(xiàn)木犀草素與 TP53的對接活性最好，自發(fā)結(jié)合的可能性最大。紫蘇籽中的木犀草素屬于黃酮類物質(zhì)，研究表明，黃酮類成分對高血壓、炎癥、過敏癥、癌癥等有一定的預(yù)防和治療作用。其中的抗癌特性與細胞活力下降、細胞周期停滯、細胞凋亡的誘導(dǎo)、轉(zhuǎn)移和抑制腫瘤血管的生成有關(guān)[30]。木犀草素能夠抑制很多類型的癌細胞的增殖。例如，木犀草素能夠阻滯人類胃癌和前列腺癌以及黑色素瘤細胞的G1期細胞周期；木犀草素誘導(dǎo)黑色素瘤細胞G1期阻滯與抑制 CDK2活性有關(guān)等。Chian等分別給予生理鹽水、單純順鉑、單純木犀草素或順鉑+木犀草素聯(lián)合治療小鼠非小細胞肺癌，發(fā)現(xiàn)木犀草素能抑制無胸腺裸鼠皮下生長的非小細胞肺癌細胞系 A549細胞的異種移植腫瘤的生長[31]；木犀草素可以結(jié)合和抑制DNA拓撲異構(gòu)酶I和II，這兩種酶是修復(fù)受損 DNA所必需的，并直接嵌入底物DNA，導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂。木犀草素的這一作用通過p53介導(dǎo)的p21/waf1表達誘導(dǎo)細胞周期停滯[32]，另外 Kang等[33]發(fā)現(xiàn)木犀草素可以增加Nrf2和p53之間的相互作用，增加了抗氧化酶和凋亡相關(guān)蛋白的表達，進而使得木犀草素有很好的抗結(jié)腸癌效果。文獻中的信息與網(wǎng)絡(luò)藥理學KEGG信號通路分析所得的結(jié)果保持一致。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學和分子對接的方法初步分析了紫蘇籽對癌癥和腫瘤的治療作用，預(yù)測了紫蘇籽抗癌抗腫瘤的潛在靶點以及相關(guān)的信號通路和生物過程，揭示了紫蘇籽抗癌抗腫瘤是多成分、多靶點、多通路共同作用的結(jié)果。中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學是古代中醫(yī)藥和現(xiàn)代藥物發(fā)展領(lǐng)域在網(wǎng)絡(luò)、藥理學、生物學以及計算機之間的跨學科領(lǐng)域的發(fā)展與融合，通過數(shù)據(jù)庫中大量的數(shù)據(jù)整合與計算預(yù)測，通過網(wǎng)絡(luò)可視化挖掘出紫蘇籽的主要活性成分、抗癌抗腫瘤作用靶點和通路，為紫蘇籽的抗癌抗腫瘤研究提供理論依據(jù)。本研究對紫蘇籽抗癌抗腫瘤的作用機制及未來的實驗驗證提供了理論依據(jù)，以期對后期的藥物開發(fā)和臨床應(yīng)用提供參考。

備注：本文的彩色圖表可從本刊官網(wǎng)（http:// lyspkj.ijournal.cn）、中國知網(wǎng)、萬方、維普、超星等數(shù)據(jù)庫下載獲取。