王玉琴，宋梅玲*，王宏生

(1.青海省青藏高原優(yōu)良牧草種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海 西寧 810016；2.省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海大學(xué)，青海 西寧 810016)

黃帚橐吾(Ligulariavirgaurea)系菊科橐吾屬多年生草本植物，為高寒草甸最常見的一種毒害草，主要分布于我國西藏東北部、云南西北部、四川、青海、甘肅等地[1]。近年來，高寒草場(chǎng)不斷退化，群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，毒害草滋生蔓延，經(jīng)調(diào)查，青海省橐吾屬植物危害面積為19.4×104hm2，黃帚橐吾的發(fā)生面積占總毒草面積的24%，嚴(yán)重危害區(qū)密度高達(dá)60株/m2，被認(rèn)為是高寒草甸退化的指示物種[2-4]，如不對(duì)其加以防控，將嚴(yán)重影響草地生態(tài)平衡和載畜功能。

毒雜草的蔓延一方面會(huì)對(duì)家畜造成嚴(yán)重的危害(引起家畜中毒，甚至死亡)，另一方面也降低了草地的產(chǎn)量和質(zhì)量[5]。為了控制黃帚橐吾大面積滋生，人們做了大量的研究工作，積極尋找防除黃帚橐吾的有效途徑，雖然有研究利用植物之間的化感作用進(jìn)行黃帚橐吾植物源除草劑的開發(fā)[6]，但對(duì)于黃帚橐吾的防控仍主要以化學(xué)除草劑防治為主[7]。目前用于防除黃帚橐吾的除草劑主要有邁士通、龍拳和“清橐1號(hào)”，其中“清橐1號(hào)”的防效以及對(duì)優(yōu)良牧草的安全性均最佳[7-8]。復(fù)配除草劑“清橐1號(hào)”為青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院草原研究所研制的防除黃帚橐吾高效專用除草劑，對(duì)黃帚橐吾的防效達(dá)95%以上[3]，研究者已對(duì)該藥劑的配方優(yōu)化、防治效果等方面進(jìn)行了研究，但由于除草劑和植物之間相互作用的復(fù)雜性，有關(guān)“清橐1號(hào)”防除黃帚橐吾的作用機(jī)理以及黃帚橐吾的生理機(jī)制還缺乏相關(guān)研究。因此，本研究采用噴霧法對(duì)盆栽黃帚橐吾進(jìn)行防除，通過對(duì)黃帚橐吾根系活力、葉綠素含量、游離脯氨酸、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、可溶性糖以及可溶性蛋白等生理指標(biāo)相對(duì)變化的測(cè)定，初步探討黃帚橐吾植株對(duì)化學(xué)藥劑的生理響應(yīng)以及明確除草劑的作用機(jī)理，以期為高寒草地毒害草黃帚橐吾的防除工作提供理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1供試植株及試驗(yàn)設(shè)計(jì)2020年6月，在青海省海北藏族自治州海晏縣青海湖鄉(xiāng)達(dá)玉德吉村黃帚橐吾危害較重的天然草地上，挖取正常生長(zhǎng)的黃帚橐吾植株移栽至花盆，花盆內(nèi)裝滿滅菌的營養(yǎng)土，移栽后定期對(duì)植株進(jìn)行澆水并觀察植株的生長(zhǎng)情況。7月選取生長(zhǎng)良好，長(zhǎng)勢(shì)均勻，且處于相同生長(zhǎng)期的植株噴灑“清橐1號(hào)”，每平方米用藥液量0.2 mL，對(duì)照用等量清水噴灑，每個(gè)處理重復(fù)20次，合計(jì)40盆。

1.2黃帚橐吾生理指標(biāo)測(cè)定分別在施藥后第1天、第5天、第10天、第15天、第30天隨機(jī)挑選 5盆，每盆取新鮮莖葉5 g左右，分別測(cè)定黃帚橐吾根系活力、葉綠素含量、丙二醛、游離脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白含量以及體內(nèi)抗氧化酶(超氧化物歧化酶、過氧化物酶和過氧化氫酶)活性。其中，采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法測(cè)定根系活力，采用分光光度法測(cè)定葉綠素含量，采用硫代巴比妥酸法測(cè)定丙二醛含量，采用酸性茚三酮法測(cè)定游離脯氨酸含量，采用蒽酮比色法測(cè)定可溶性糖含量，采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定可溶性蛋白含量，采用氮藍(lán)四唑光化還原法測(cè)定超氧化物歧化酶活性，采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定過氧化物酶活性，采用高錳酸鉀滴定法測(cè)定過氧化氫酶活性[9-10]。

1.3數(shù)據(jù)分析運(yùn)用SPSS 22.0軟件，采用單因素方差分析比較施藥和不施藥各指標(biāo)隨時(shí)間變化的差異顯著性(P<0.05);采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)分析施藥與不施藥同一時(shí)間各生理指標(biāo)間差異顯著性(P<0.05)。采用Excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1除草劑對(duì)黃帚橐吾根系活力的影響施藥后根系活力呈先降低后增加的趨勢(shì)，而CK呈先降低后增加再降低的趨勢(shì)(圖1)。施藥1 d后，黃帚橐吾的根系活力較CK顯著增加，隨著施藥時(shí)間的延長(zhǎng)，根系活力顯著降低(P<0.05)，在施藥5 d后，根系活力達(dá)到最小值，隨后根系活力有增加趨勢(shì)，但總體低于CK，施藥30 d后，根系活力又有所增加，且高于CK。

圖1 施藥對(duì)黃帚橐吾根系活力的影響Fig.1 Effects of pesticide application on the root activity of L·virgaurea

2.2除草劑對(duì)黃帚橐吾葉綠素含量的影響由圖2可知，施藥后黃帚橐吾葉片內(nèi)葉綠素含量有一定程度的變化，其中葉綠素a含量顯著下降(P<0.05)， 30 d后葉綠素a含量比施藥1 d下降74.1%，而CK的葉綠素a含量下降45.2%，且施藥 30 d后的黃帚橐吾葉綠素a含量比CK降低了56%；施藥后黃帚橐吾葉片內(nèi)類胡蘿卜素含量較CK有所增加，30 d后類胡蘿卜素含量比施藥1 d增加66.9%，而CK的類胡蘿卜素含量增加37.5%，且施藥 30 d后的類胡蘿卜素含量比CK升高了56.8%；葉綠素b含量在施藥前后變化不明顯。

圖2 施藥對(duì)黃帚橐吾葉片葉綠素含量的影響Fig.2 Effects of pesticide application on the chlorophyll content in leaves of L·virgaurea

2.3除草劑對(duì)黃帚橐吾游離脯氨酸和丙二醛含量的影響游離脯氨酸含量的變化趨勢(shì)與丙二醛含量的變化趨勢(shì)一致(圖3)，在施藥后5 d內(nèi)游離脯氨酸的含量略低于CK，施藥10 d后游離脯氨酸含量呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，并逐漸高于CK，在15 d后增加顯著，施藥30 d的游離脯氨酸含量顯著高于CK，是CK的10倍左右。黃帚橐吾體內(nèi)丙二醛含量在施藥后5 d內(nèi)略低于CK，10 d后丙二醛含量逐漸增高，施藥30 d后丙二醛含量顯著高于CK，且是CK的2.8倍。

圖3 施藥對(duì)黃帚橐吾游離脯氨酸和丙二醛含量的影響Fig.3 Effects of pesticide application on the free proline and MDA content of L·virgaurea

2.4除草劑對(duì)黃帚橐吾抗氧化酶活性的影響由圖4可知，施藥處理和CK的黃帚橐吾體內(nèi)的SOD活性變化均呈先增加后降低的趨勢(shì)，均在15 d時(shí)達(dá)到最大值，施藥后SOD活性逐漸高于CK，30 d時(shí)SOD活性又低于CK，但施藥處理與CK之間差異不顯著。施藥后黃帚橐吾體內(nèi)POD活性先增加后降低，在施藥10 d后達(dá)到最大值，且顯著高于CK(P<0.05)，而CK在30 d內(nèi)變化不明顯，另外，施藥的SOD活性除了施藥1 d時(shí)低于CK外，其余均高于CK。施藥處理和CK的黃帚橐吾體內(nèi)的CAT活性均在10 d內(nèi)呈下降趨勢(shì)，施藥處理的CAT活性略高于CK，施藥10 d后的CAT活性均呈增高趨勢(shì)，CK增高較明顯，且在30 d時(shí)顯著高于施藥處理(P<0.05)，施藥后CAT活性與CK相比呈先增加后降低的趨勢(shì)。

圖4 施藥對(duì)黃帚橐吾抗氧化酶活性的影響Fig.4 Effects of pesticide application on the antioxidant enzyme activity of L·virgaurea

2.5除草劑對(duì)黃帚橐吾可溶性糖和可溶性蛋白含量的影響施藥5 d后黃帚橐吾的可溶性糖含量顯著增加(P<0.05)，10 d后比CK顯著增加2倍左右，并隨施藥天數(shù)的延長(zhǎng)呈增加趨勢(shì)。施藥后黃帚橐吾的可溶性蛋白含量呈現(xiàn)先顯著增加后降低的趨勢(shì)，10 d后含量下降不顯著(P>0.05)，且在施藥15 d內(nèi)均高于CK，而CK在施藥5 d后呈現(xiàn)顯著增加(P<0.05)，且在30 d時(shí)可溶性蛋白含量高于施藥處理，高出62.2%(圖5)。

圖5 施藥對(duì)黃帚橐吾可溶性糖和可溶性蛋白含量的影響Fig.5 Effects of pesticide application on the soluble sugar and solube protein of L·virgaurea

3 討論與結(jié)論

根系作為植物吸收營養(yǎng)的重要器官，直接影響植物地上部分的生長(zhǎng)[11]。本試驗(yàn)通過對(duì)黃帚橐吾根系活力的分析可知，施藥后根系活力顯著降低，說明施藥后抑制了植株根系的生長(zhǎng)，進(jìn)而影響植株養(yǎng)分的獲取以及植株正常生長(zhǎng)。葉綠素是光合作用的基礎(chǔ)，而光合作用又是植物正常生長(zhǎng)發(fā)育的物質(zhì)和能量來源[12]，施藥后葉綠素含量與CK相比逐漸降低，且葉綠素a含量降低明顯，說明藥劑降低了黃帚橐吾的光合作用，葉綠素含量的下降也說明植物葉片出現(xiàn)了一定的損傷，并出現(xiàn)局部葉片的黃化現(xiàn)象，與施藥后盆栽植株表現(xiàn)的癥狀一致，該結(jié)果與崔家麗等[13]、劉大麗等[14]以及趙寶平等[15]的研究結(jié)果一致，植物分別在蟲害、氮以及水分等逆境脅迫下，葉綠素含量下降，葉片逐漸變黃。此外，植株體內(nèi)類胡蘿卜素含量與CK相比呈增加趨勢(shì)，說明葉片中的類胡蘿卜素可能通過幫助維持光合作用來降低農(nóng)藥對(duì)植物造成的影響，有研究發(fā)現(xiàn)通過添加類胡蘿卜素來恢復(fù)植物葉片的葉綠素組成以及降低膜氧化程度，說明在逆境脅迫下，類胡蘿卜素起到重要作用[16-17]。

逆境脅迫下植物為了保護(hù)自身免受損害進(jìn)化出多種防御機(jī)制，首先是植物體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的增加，而游離脯氨酸是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，可以提高植物在非生物或生物脅迫下的耐受性[18]，具有穩(wěn)定細(xì)胞膜[19]，維持細(xì)胞膨脹和滲透平衡[20]及清除活性氧和抗氧化[21]等功能。在本試驗(yàn)中黃帚橐吾體內(nèi)游離脯氨酸的含量隨著施藥時(shí)間的增加呈增加趨勢(shì)，且在30 d時(shí)游離脯氨酸含量顯著增加，含量為CK的10倍，這說明施藥后黃帚橐吾植株為了緩解不良環(huán)境對(duì)生長(zhǎng)造成的影響，通過積累游離脯氨酸含量來維持組織細(xì)胞間的水分平衡，從而來適應(yīng)農(nóng)藥脅迫。另外，有研究表明添加外源脯氨酸能提高植物耐受性，緩解生長(zhǎng)抑制[22-23]，進(jìn)一步證實(shí)了本文的結(jié)果。

植物在遭受逆境脅迫時(shí)，首先是植物的細(xì)胞膜遭到破壞[22]，而植物也會(huì)產(chǎn)生丙二醛與活性氧發(fā)生過氧化反應(yīng)來保護(hù)細(xì)胞膜。在本試驗(yàn)中，黃帚橐吾施藥后丙二醛含量逐漸升高，并在30 d時(shí)急劇增加，是CK的2.8倍，可能由于藥劑破壞了植株的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)葉片產(chǎn)生大量的丙二醛，使植物代謝失調(diào)，降低了膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性，促使黃帚橐吾衰老，進(jìn)而達(dá)到防除的目的，這一結(jié)果與張騰國等[24]的結(jié)論相似。同時(shí)，植物為了能夠保持正常的生長(zhǎng)代謝活動(dòng)，體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的抗氧化酶(SOD、POD和CAT)來降低體內(nèi)氧自由基水平，減少對(duì)細(xì)胞膜的損傷，使體內(nèi)正常生長(zhǎng)代謝得以維持，并提高植物的抗逆性[25-26]。這一點(diǎn)在黃帚橐吾受到農(nóng)藥脅迫后的SOD、POD和CAT活性酶的變化趨勢(shì)中(先升高后降低)能夠得到很好的印證，并且抗氧化酶在施藥15 d左右出現(xiàn)降低趨勢(shì)，有可能是農(nóng)藥脅迫超出了黃帚橐吾的承受范圍，破壞了酶的作用中心，抗氧化酶活性降低，細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化程度加劇，進(jìn)而使植物生長(zhǎng)抑制，衰老加快。

可溶性糖和可溶性蛋白在植物抵御逆境脅迫時(shí)也起到關(guān)鍵作用，可以使植物細(xì)胞內(nèi)的水分受到一定的束縛[27]。黃帚橐吾施藥后，葉片內(nèi)可溶性糖含量逐漸增加，并顯著高于CK，可溶性蛋白含量先增加后減少，這是由于植株通過積累可溶性糖和可溶性蛋白來維持細(xì)胞間的水分平衡和滲透勢(shì)來使植物適應(yīng)農(nóng)藥脅迫[28]，可溶性蛋白的減少可能是由于隨著時(shí)間的推移，黃帚橐吾本身的耐受力被損害，葉片逐漸衰老，可溶性蛋白的合成受到抑制，使其含量逐漸降低。

綜上所述，“清橐1號(hào)”防除黃帚橐吾后黃帚橐吾植株的根系生長(zhǎng)和光合作用均受到抑制，且復(fù)配劑在一定程度上破壞了細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、抗氧化系統(tǒng)以及細(xì)胞間的水分平衡，丙二醛、游離脯氨酸、可溶性糖含量的增加以及抗氧化酶活性的先增加后減少，進(jìn)而破壞植物組織，抑制植株生長(zhǎng)，導(dǎo)致黃帚橐吾衰老加快并死亡，最后達(dá)到防除目的。本試驗(yàn)僅僅分析了“清橐1號(hào)”復(fù)配除草劑對(duì)黃帚橐吾生理生化的影響，對(duì)草地其他植物以及環(huán)境方面的影響有待進(jìn)一步研究。同時(shí)，應(yīng)在此基礎(chǔ)上加速推廣應(yīng)用，使其在草地生態(tài)中發(fā)揮應(yīng)有的作用。