李圣豪，石新麗

0 引言

原發(fā)性肝癌是全球第三大癌癥死亡原因，其中肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）約占原發(fā)性肝癌的75%～85%[1]。幾十年來，有效改善晚期肝癌預(yù)后的療法較少。酪氨酸蛋白激酶抑制劑如索拉非尼、瑞戈非尼和樂伐替尼被認(rèn)為是最有效的靶向藥物，并且是晚期肝癌患者的唯一有效療法[2]。然而，最近一項關(guān)于索拉非尼在亞太地區(qū)晚期肝癌患者中的有效性和安全性臨床試驗證明，索拉非尼只能將晚期HCC患者的生存期延長3月，并且出現(xiàn)了耐藥的問題[3]。

免疫治療被譽為腫瘤學(xué)的重大突破。最近研究發(fā)現(xiàn)靶向程序性細(xì)胞死亡受體配體-1（programmed cell death ligand 1,PD-L1）/程序性細(xì)胞死亡受體-1（programmed cell death 1,PD-1）的藥物在HCC治療中具有顯著的抗腫瘤作用[4]，在HCC腫瘤微環(huán)境中，PD-L1主要在腫瘤細(xì)胞和宿主免疫細(xì)胞中表達。PD-L1表達增加導(dǎo)致抗腫瘤T細(xì)胞遷移、增殖和細(xì)胞毒性分泌的抑制[5]。因此，明確PD-L1在肝癌中的調(diào)控機制對于免疫治療至關(guān)重要。

1 PD-L1在宿主免疫細(xì)胞上的表達

1.1 骨髓來源抑制細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cells,MDSCs）

骨髓來源的抑制細(xì)胞在免疫調(diào)節(jié)中起重要作用，但MDSCs在肝細(xì)胞癌患者中的免疫抑制功能尚未闡明。高表達集落刺激因子1（colony stimulating factor 1,M-CSF）和血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A,VEGFA）的肝癌細(xì)胞系顯著誘導(dǎo)MDSCs PD-L1的表達[6]。進一步研究發(fā)現(xiàn)MDSCs有助于腫瘤免疫抑制微環(huán)境形成。HCC患者的腫瘤浸潤性CD11b+CD33+HLADR-MDSCs可以有效抑制CD8+T細(xì)胞的增殖。進一步研究發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin dependent kinase,CCRK）通過激活EZH2/核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear transcription factor-κB,NF-κB）/IL-6級聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致MDSCs積累[7]。相反，值得注意的是，腫瘤性CCRK耗竭上調(diào)了PD-L1表達并增加了腫瘤內(nèi)CD8+T細(xì)胞，從而增強了PD-L1抗體治療肝癌的作用。

1.2 腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞

巨噬細(xì)胞分化與肝細(xì)胞癌的發(fā)生密切相關(guān)。巨噬細(xì)胞分化相關(guān)基因（macrophage differentiation-associated genes,MDGs）中的CDC42與M2巨噬細(xì)胞標(biāo)志物和免疫檢查點呈正相關(guān)，CDC42的表達與Wnt信號通路密切相關(guān)。研究表明CDC42是肝癌中重要的MDGs，并且被證明是研究肝癌中巨噬細(xì)胞分化的新基因[8]。類賴氨酰氧化酶4（lysyl oxidase like 4,LOXL4）是一種胺氧化酶，主要參與細(xì)胞外基質(zhì)重塑，并在肝細(xì)胞癌組織中高表達，但其在介導(dǎo)肝癌發(fā)生中的功能未知。LOXL4對巨噬細(xì)胞的免疫抑制功能主要依賴于IFN介導(dǎo)的STATs依賴性PD-L1活化，從而進一步抑制CD8+T細(xì)胞的功能[9]。

研究發(fā)現(xiàn)肝癌外周血單核細(xì)胞中的腫瘤浸潤性T細(xì)胞的O型蛋白酪氨酸磷酸酶受體（protein tyrosine phosphatase receptor type o,PTPRO）顯著降低，并且PTPRO與肝癌外周血單核細(xì)胞和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞中PD-L1表達的增加有關(guān)。血清IL-6通過激活STAT3/c-MYC/miR-25-3p軸，降低PTPRO的表達，引起PD-L1誘導(dǎo)的免疫抑制來促進腫瘤生長[10]。HCC細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，并以釋放外泌體的形式促進免疫抑制的形成，外泌體通過miR-23a-PTEN-AKT途徑上調(diào)巨噬細(xì)胞中PD-L1的表達，巨噬細(xì)胞進一步抑制T細(xì)胞功能[11]。這些研究為深入了解腫瘤細(xì)胞的腫瘤免疫逃避機制提供了依據(jù)。

1.3 單核細(xì)胞

活化單核細(xì)胞釋放的自分泌腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）和IL-10刺激單核細(xì)胞自身PD-L1的表達。PD-L1陽性單核細(xì)胞可有效抑制腫瘤特異性T細(xì)胞免疫，并促進人體內(nèi)腫瘤的生長。腫瘤來源的可溶性因子透明質(zhì)酸片段誘導(dǎo)了腫瘤相關(guān)的單核細(xì)胞中關(guān)鍵糖酵解酶PFKFB3的上調(diào)，該酶通過激活細(xì)胞中的NF-κB信號促進PD-L1的表達[12]。該機制揭示了細(xì)胞代謝可以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中單核細(xì)胞的促腫瘤功能。

在腫瘤微環(huán)境中，免疫逃逸的關(guān)鍵驅(qū)動因素腫瘤細(xì)胞內(nèi)源性骨橋蛋白（osteopontin,OPN）具有致癌活性，肝癌組織中OPN和PD-L1表達以及腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophage,TAM）浸潤之間存在正相關(guān)。OPN促進了巨噬細(xì)胞趨化性遷移和替代激活，并通過激活巨噬細(xì)胞中的CSF1-CSF1R途徑促進腫瘤細(xì)胞中PD-L1的表達[13]，阻斷該途徑可防止TAM轉(zhuǎn)運，從而增強免疫檢查點抑制劑治療HCC的療效。

M1型巨噬細(xì)胞被認(rèn)為具有殺傷腫瘤作用，但一些研究報道了其對腫瘤的促進作用。CD68+HLADR+M1型巨噬細(xì)胞的浸潤與HCC細(xì)胞中PD-L1表達水平有關(guān)，M1型巨噬細(xì)胞分泌IL-1β可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞NF-κB p65和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子-1（interferon regulatory factor-1,IRF-1）的表達，促進PD-L1表達[14]。

PD-L1水平的升高代表了腫瘤細(xì)胞響應(yīng)內(nèi)源性抗腫瘤活性而產(chǎn)生的適應(yīng)性免疫抵抗機制，腫瘤細(xì)胞PD-L1的上調(diào)主要是由腫瘤微環(huán)境中存在的活化CD8+T細(xì)胞誘導(dǎo)的，它是HCC有利的預(yù)后因素[15]。也有研究認(rèn)為PD-L1能下調(diào)腫瘤微環(huán)境中T細(xì)胞活化相關(guān)的基因。高表達PD-L1的小鼠肝癌細(xì)胞系BNL-MEA與CD8+T細(xì)胞共培養(yǎng)可降低T細(xì)胞增殖以及細(xì)胞因子IFN-γ和TNF-α的表達[16]。雖然表達PD-L1的腫瘤顯示出對抗PD-1治療更好的反應(yīng)，但是CD8+T細(xì)胞的耗竭消除了抗PD-1的抗腫瘤效果。

2 PD-L1的表觀遺傳調(diào)控

果蠅zeste基因增強子的人類同源物2（enhancer of zeste homolog 2,EZH2）以IFN-γ依賴性方式負(fù)調(diào)控肝癌細(xì)胞系PD-L1的表達。EZH2可以通過上調(diào)CD274啟動子上的組蛋白H3的N端第27位賴氨酸三甲基化水平（編碼PD-L1）和干擾素調(diào)節(jié)因子1（IRF1）來抑制PD-L1表達[17]，EZH2是免疫聯(lián)合治療HCC的潛在治療靶點。

3 PD-L1轉(zhuǎn)錄調(diào)控

3.1 STAT3信號通路

研究發(fā)現(xiàn)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3,STAT3）與PD-L1啟動子結(jié)合，轉(zhuǎn)錄調(diào)控PD-L1表達[18]。

STAT3活性降低，則降低IFN-γ誘導(dǎo)的PD-L1表達，并恢復(fù)T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞功能[19]。另外，STAT3上游分子通路對STAT3的磷酸化和糖基化修飾，也影響PD-L1的表達。D蛋白酪氨酸磷酸酶受體（protein tyrosine phosphatase receptor type D,PTPRD）是一種重要的腫瘤抑制基因，可通過抑制STAT3磷酸化，抑制PD-L1的表達[20]。高爾基膜蛋白1（Golgi membrane protein 1,GOLM1）作為一種致癌基因，通過選擇性地與EGFR結(jié)合促進肝癌的生長和轉(zhuǎn)移。另外，研究還發(fā)現(xiàn)GOLM1通過增強EGFR的水平來促進STAT3的磷酸化，進而上調(diào)PD-L1的轉(zhuǎn)錄表達[21]。Toll樣受體 9（Tolllike receptors 9,TLR9）負(fù)調(diào)節(jié)PARP1表達，從而介導(dǎo)STAT3多聚ADP核糖基化修飾（Poly（ADPribosyl）ation,PARylation）的減少和STAT3 Tyr705磷酸化的增加,促進PD-L1轉(zhuǎn)錄[22]。

3.2 MAPK信號通路

有絲分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）信號通路與肝癌中PD-L1基因的表達有關(guān)。表皮生長因子（epidermal growth factor,EGF）或IFN-γ的刺激可增加PD-L1轉(zhuǎn)錄和蛋白水平的表達。表皮生長因子受體、絲裂原活化蛋白激酶激酶1和絲裂原活化蛋白激酶激酶2阻斷，可抑制EGF和IFN-γ誘導(dǎo)的PD-L1轉(zhuǎn)錄和蛋白表達水平上調(diào)。IFN-γ增加了PD-L1的轉(zhuǎn)錄活性，而MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)增加了PD-L1 mRNA的穩(wěn)定性[23]。另外MAPK還受到其他信號通路的調(diào)控，受體酪氨酸激酶C-MET與肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor,HGF）結(jié)合形成二聚體，導(dǎo)致C-MET羧基末端酪氨酸磷酸化，進而導(dǎo)致MAPK和PI3K活化。HGF誘導(dǎo)的C-MET活化發(fā)生在PD-1/PD-L1信號通路的活化過程中，因此在HCC中C-MET調(diào)節(jié)PD-L1的表達[24]。

3.3 IFN-γ信號通路

腫瘤浸潤性T細(xì)胞釋放IFN-γ誘導(dǎo)PD-L1表達[25]。IFN-γ通過上調(diào)小鼠和人HCC細(xì)胞中IRF-1的表達誘導(dǎo)PD-L1轉(zhuǎn)錄和蛋白水平表達[26]。研究也發(fā)現(xiàn)人肝癌細(xì)胞系中IFN-γ主要依賴JAK/STAT1/IRF1途徑誘導(dǎo)PD-L1表達[27]。轉(zhuǎn)錄因子IRF-1和IRF-2信號通路均調(diào)節(jié)HCC細(xì)胞中的PD-L1的表達。IRF-2過表達可以抑制IFN-γ誘導(dǎo)的PD-L1啟動子活性和蛋白水平。而IRF-1拮抗IRF-2與PD-L1中的IRE啟動子結(jié)合，為HCC免疫檢查點抑制劑治療中PD-1/PD-L1途徑的調(diào)控提供了新的啟示。研究發(fā)現(xiàn)TNF-α通過上調(diào)IFN-γ受體的表達來增強IFN-γ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。另外，研究發(fā)現(xiàn)IFN刺激基因12a（IFN stimulates gene 12a,ISG12a）通過抑制Axin泛素化降解來促進β-catenin蛋白酶體降解，從而抑制了經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[28]。β-catenin被鑒定為PD-L1的轉(zhuǎn)錄因子。ISG12a抑制Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可抑制免疫檢查點PD-L1的表達，從而使NK細(xì)胞對癌細(xì)胞殺傷敏感，這項研究揭示了IFN抗癌作用的潛在機制。

3.4 雄激素受體（androgen receptor,AR）信號通路

雄激素受體作為PD-L1的轉(zhuǎn)錄抑制因子負(fù)調(diào)控PD-L1[29]。體外實驗發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞中AR的過表達增強了CD8+T的功能，AR低表達的腫瘤對PD-L1抑制劑的反應(yīng)較好。因此，AR抑制PD-L1的表達可能與HCC中的性別差異有關(guān)。另外有研究發(fā)現(xiàn)，羥類固醇17-β脫氫酶6（hydroxysteroid 17-β dehydrogenase 6,HSD17B6）是參與合成二氫睪丸激素的關(guān)鍵蛋白，在HCC的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。HSD17B6可通過產(chǎn)生雙氫睪酮（dihydrotestosterone,DHT）抑制TGF-β1和PD-L1的表達[30]。

3.5 其他特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控

氧化應(yīng)激反應(yīng)1（oxidative stress response 1,OXSR1）與部分腫瘤的惡性進展密切相關(guān)。OXSR1在肝癌組織中上調(diào)，促進腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。此外，OXSR1的表達水平與HCC中腫瘤浸潤免疫細(xì)胞的浸潤水平和PD-L1表達呈正相關(guān)[31]。MYC原癌基因上調(diào)淋巴瘤中PD-L1的表達，HCC細(xì)胞中敲低MYC，增加了PD-L1 mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達[32]。MYC抑制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活子-1 (signal transducer and activator of transcription 1,STAT1) 的表達，STAT1是IFN-γ信號通路的重要組成部分，IFN-γ刺激HCC細(xì)胞促進PD-L1表達。Hippo信號通路在多種癌癥類型中失活，導(dǎo)致定位在細(xì)胞質(zhì)當(dāng)中的Yes1相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子（Yes-associated transcriptional regulator,YAP1）進入細(xì)胞核，調(diào)控下游相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn)，YAP1抑制劑可以降低肝癌組織PD-L1的表達，破壞腫瘤的免疫抑制微環(huán)境，從而改善HCC的治療效果[33]。

4 轉(zhuǎn)錄后調(diào)控PD-L1的表達

4.1 MicroRNAs對PD-L1的調(diào)節(jié)

MicroRNA-1（miR-1）是一種腫瘤抑制性microRNA，直接調(diào)控PD-L1表達。miR-1的缺失促進對索拉非尼耐藥的肝癌細(xì)胞中PD-L1的表達[34]。癌基因轉(zhuǎn)錄因子核因子E2相關(guān)因子2（Nuclear factor,erythroid 2 like 2,NRF-2）可抑制miR-1的表達，NRF-2/miR-1/PD-L1調(diào)控軸有助于索拉非尼耐藥肝癌細(xì)胞耐藥性的維持和發(fā)展，并為克服HCC中索拉非尼耐藥性提供了潛在的治療靶點。另外研究發(fā)現(xiàn)miR-155-5p和miR-194-5p可通過X失活的特異性轉(zhuǎn)錄本（X inactive specific transcript,XIST）上調(diào)PD-L1的表達[35]。

4.2 LncRNAs對PD-L1的調(diào)節(jié)

在HCC中，長鏈非編碼RNA PCED1B-AS1（PCED1B antisense RNA 1,PCED1B-AS1）和hsamiR-194-5p表達上調(diào)。PCED1B-AS1與PD-Ls正相關(guān)，而與hsa-miR-194-5p負(fù)相關(guān)。PCED1B-AS1與抑制PD-Ls表達的hsa-mir-194-5p相互作用，增強PD-Ls的表達[36]。癌癥易感性候選物11（cancer susceptibility 11,CASC11）募集真核翻譯起始因子4A3（eukaryotic translation initiation factor 4A3,EIF4A3），并增強E2F1 mRNA的穩(wěn)定性，促進NF-κB信號和PI3K/AKT/mTOR通路的激活，調(diào)節(jié)PD-L1的表達[37]。研究還表明，肝癌中長鏈非編碼RNA MIAT的表達與PD-1、PD-L1和CTLA4等免疫檢查點分子的表達呈正相關(guān)[38]。

LINC00657在HCC組織和細(xì)胞系中過表達，與預(yù)后不良有關(guān)。LINC00657通過降低miR-42調(diào)節(jié)PD-L1的表達，PD-L1的3'UTR與miR-424高度保守，miR-424可顯著抑制PD-L1的mRNA和蛋白表達水平[39]。長鏈非編碼RNA KCNQ1重疊轉(zhuǎn)錄本1（KCNQ1 overlapping transcript 1,KCNQ1OT1）已被證明與部分腫瘤細(xì)胞的耐藥性有關(guān)。KCNQ1OT1充當(dāng)miR 506的競爭性內(nèi)源RNA，并在索拉非尼耐藥的肝癌細(xì)胞中促進PD-L1的表達[40]。

5 翻譯后修飾對PD-L1的調(diào)控作用

EGF刺激促進了HCC細(xì)胞中PD-L1 mRNA和蛋白的表達。EGF處理導(dǎo)致PD-L1啟動子處的H3-Thr11磷酸化增強，抑制表皮生長因子受體可以逆轉(zhuǎn)EGF誘導(dǎo)的PD-L1 mRNA和蛋白的表達。抑制丙酮酸激酶同工型M2（pyruvate kinase M2,PKM2）則顯著阻止EGF誘導(dǎo)的PD-L1表達和H3-Thr11的磷酸化[41]。肝癌患者的腫瘤組織樣本中觀察到聚腺苷酸二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶-1（poly(ADPribose)polymerase-1,PARP-1）和磷酸化的糖原合成酶激酶3β（p-glycogen synthase kinase 3 beta,p-GSK3β）或PD-L1表達之間呈負(fù)相關(guān)，抑制PARP1活性可以增強GSK3β磷酸化，上調(diào)PD-L1表達，并最終抑制T細(xì)胞浸潤[42]。

6 免疫檢查點抑制劑的臨床應(yīng)用

腫瘤免疫治療的特點在于激發(fā)特異性免疫反應(yīng)。國產(chǎn)卡瑞利珠單抗單藥用于晚期肝癌的治療，客觀緩解率14.7%，6月生存率74.4%，12月生存率55.9%，中位生存期13.8月[43]。替雷利珠單抗單藥治療晚期二線肝細(xì)胞癌患者的ORR高達18.8%，DCR達56.3%，在同類藥物中處于領(lǐng)先水平[44]。另外，PD-L1單抗在肝膽腫瘤治療中也開展了很多臨床試驗。一項關(guān)于阿替利珠單抗聯(lián)合貝伐單抗一線治療晚期肝細(xì)胞肝癌患者的研究結(jié)果顯示，索拉非尼組mOS為13.2月，聯(lián)合組可使死亡風(fēng)險降低42%；聯(lián)合組的mPFS為6.8月，索拉非尼組為4.3月，疾病進展風(fēng)險降低41%。此外，在中國患者中帶來更大獲益，降低了56%的死亡風(fēng)險[45]。該聯(lián)合方案不僅被NCCN指南納入肝癌患者的一線治療，也被FDA批準(zhǔn)為肝癌史上首個免疫聯(lián)合的一線治療方案。2020 CSCO指南將阿替利珠單抗聯(lián)合貝伐單抗組合納入晚期肝癌一線治療的Ⅰ級推薦。

7 總結(jié)與展望

綜上所述，肝癌免疫微環(huán)境中PD-L1在多種細(xì)胞上表達，包括巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等。PD-L1的表達可明顯抑制效應(yīng)T細(xì)胞的抗腫瘤作用。目前針對PD-L1的研究主要集中在免疫治療方面，但也有研究發(fā)現(xiàn)，PD-L1也可不依賴PD-1/PD-L1途徑，發(fā)揮促進腫瘤生長的作用。另外PD-L1表達的調(diào)控受到多種因素的調(diào)控，包括轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后翻譯和翻譯后修飾等多層面的調(diào)控，而且不同層次和信號通路之間交叉調(diào)控，機制復(fù)雜，見表1。PD-L1陽性的患者可在免疫檢查點抑制劑的治療中獲益，但是PD-L1陽性的患者并未在治療中完全有效。相反，PD-L1陰性的患者也可以在免疫檢查點抑制劑治療中獲益。免疫檢查點抑制劑治療失敗的原因可能是腫瘤細(xì)胞免疫原性的突變、腫瘤細(xì)胞上多種免疫檢查點的配體的表達以及T細(xì)胞的浸潤缺陷。因此，免疫檢查點抑制劑的聯(lián)合治療策略，為免疫檢查點抑制劑的應(yīng)用拓展了新空間，同時也顯現(xiàn)出非常顯著的治療效果，最終將為患者帶來更多的選擇，延長患者生存期。

表1 肝癌PD-L1的調(diào)控機制Table 1 Regulatory mechanism of PD-L1 in liver cancer