金玉霞，李素萍，李晶，唐萍

外胚層發(fā)育不良（ectodermal dysplasias，ED）是一種遺傳性疾病，以汗腺、毛發(fā)、牙齒、指甲等兩個或兩個以上外胚層發(fā)育不良或形態(tài)缺陷為主要特征。少汗型外胚層發(fā)育不良（hypohidrotic ectodermal dysplasia，HED）是 ED最 常 見的亞型，發(fā)病率約為1/100 000[1]，可分為常染色體顯性遺傳、隱性遺傳及X-連鎖遺傳。X-連鎖少汗型外胚層發(fā)育不 良（X-linked hypohidrotic ectodermal dysplasia，XL-HED）在臨床上較為罕見，其“在線《人類孟德爾遺傳》（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）”編號為305100，主要由OMIM編號為300451的Ectodysplasin A（EDA）基因突變導致，呈X-連鎖隱性遺傳。

XL-HED臨床表現(xiàn)具有異質(zhì)性，主要表現(xiàn)為汗腺分泌少、毛發(fā)稀少、先天性牙齒缺如等[2]。絕大多數(shù)XL-HED患者為男性，但由于患者汗腺存在不可逆性損傷、散熱功能異常，因此患者在嬰幼兒期常出現(xiàn)高熱，甚至會危及生命[3-4]。此外，成年XL-HED患者存在特殊面容[5]，會給患者及其家庭帶來沉重的身心負擔。目前，臨床尚無有效治療XL-HED的方法，而遺傳咨詢及準確的產(chǎn)前診斷是預防和減少XL-HED患兒出生的有效措施[6]。本研究通過高通量測序法及Sanger測序法檢出先證者基因突變，之后對其家系成員進行了遺傳學分析，從而明確了致病基因突變位點，為后續(xù)該家系成員遺傳咨詢及產(chǎn)前診斷提供了參考依據(jù)。

本文要點：

X-連鎖少汗型外胚層發(fā)育不良是一種罕見的遺傳性疾病，發(fā)病率極低。本研究通過對疑似存在X-連鎖少汗型外胚層發(fā)育不良家族史的孕婦進行遺傳咨詢，采用高通量測序法及Sanger測序法對先證者、可能的致病基因攜帶者及孕婦本人進行基因突變分析等明確Ectodysplasin A（EDA）基因半合子突變是X-連鎖少汗型外胚層發(fā)育不良的致病性突變。本研究通過對先證者及其家系成員進行遺傳咨詢及產(chǎn)前診斷等避免了X-連鎖少汗型外胚層發(fā)育不良患兒的出生，并為該家系成員后續(xù)遺傳咨詢及產(chǎn)前診斷提供了重要參考依據(jù)，本研究發(fā)現(xiàn)的致病性基因突變類型為已知致病性變異，后續(xù)仍需進一步關注X-連鎖少汗型外胚層發(fā)育不良的致病性基因及基因突變類型。

1 對象與方法

1.1 研究對象 先證者（Ⅱ3），男，28歲，因少汗、皮膚干燥、易出現(xiàn)高熱而于2020年2月來嘉興市婦幼保健院咨詢。先證者自幼無汗，體溫常高達39～40 ℃，皮膚及呼吸道黏膜干燥，頭發(fā)干枯稀少（目前戴假發(fā)），眉毛、睫毛稀疏，體毛、腋毛均稀少，牙齒數(shù)目尚可、但偏小，特殊面容、面部皮膚暗黑，眼周、口周伴色素沉著，額頭膨隆，眼眶凹陷，下頜突出，唇前突（見圖1）、趾（指）甲基本正常。先證者父母非近親結婚，弟弟（Ⅱ4）存在類似病史，姐姐（Ⅱ2）表型基本正常但頭發(fā)偏少、牙齒細小且稍尖，外甥女（Ⅲ1）亦存在牙齒形狀異常（呈尖形），姐夫及其家系成員無類似情況。先證者因其姐姐再次妊娠而前來進行遺傳咨詢，希望了解胎兒發(fā)病風險并行產(chǎn)前診斷，遂繪制其家系圖譜（見圖2）。本研究經(jīng)嘉興市婦幼保健院醫(yī)學倫理委員會審核批準〔批準號：2020產(chǎn)前倫（快）-1〕。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 分別采集先證者及其姐姐、外甥女外周靜脈血各2 ml，采用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝；采用血液基因組DNA抽提試劑盒（QIAGEN DNA Blood mini kit，Germany）并嚴格按照操作說明提取基因組DNA；采用NanoDrop（Thermo Scientific，USA）測定DNA濃度和純度。

1.2.2 高通量測序 采用目標芯片捕獲高通量測序法對ED相關基因進行檢測，所用合成芯片（美國NimbleGen公司）于華大基因研究院定制，具體操作步驟如下：（1）將制備好的DNA片段進行末端補平、接頭連接，并經(jīng)非捕獲聚合酶鏈反應（non-captured PCR）構建完整的文庫；（2）先通過合成芯片上帶有生物標記素的單鏈DNA探針進行雜交，再利用鏈霉親和素標記的磁珠將選取的特定基因的外顯子及側翼±30 bp區(qū)域進行富集，并經(jīng)聚合酶鏈反應（PCR）擴增富集后產(chǎn)物、進行實時熒光定量PCR（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）檢測以獲得序列捕獲雜交效率；（3）qPCR檢測合格后將一定數(shù)量的文庫進行上機測序并對數(shù)據(jù)進行質(zhì)控、分析和解讀，所用儀器為Illumina HiSeq2000。

圖1 先證者家系圖譜Figure 1 Pedigree map of the proband

圖2 先證者面部特征Figure 2 Facial features of the proband

1.2.3 基因突變致病性分析 基于1000 Genomes Project數(shù)據(jù)庫、人類基因突變數(shù)據(jù)庫（HGMD）、OMIM、人類基因組遺傳變異（Clinical Genome Variation）ClinVar數(shù)據(jù)庫、ED基因突變數(shù)據(jù)庫及文獻檢索結果分析檢測到的基因突變，同時使用 Polymorphism Phenotyping version 2、Protein Variation Effect Analyzer（PROVEAN）對錯義變異進行功能預測和致病性分析，參考美國醫(yī)學遺傳學和基因組學學院（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）相關指南對基因突變致病性進行判讀。

1.2.4 Sanger測序 根據(jù)所發(fā)現(xiàn)的基因突變查詢美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫以獲取EDA基因的DNA序列，設計PCR引物（引物序列：F'ATGGGACCTGATGGATTATTTA，R'AGTTTCAAGCGATTCTCCTG）并由華大基因科技有限公司合成、純化；分別采用瓊脂糖凝膠純化PCR產(chǎn)物，并采用ABI Big Dye Rterminator reagents 2.0試劑盒、ABI 3100基因分析儀（Applied Biosystem，F(xiàn)oster，USA）進行Sanger測序，最后將測序結果導入Polyphred軟件進行突變位點分析。

1.2.5 羊水母源污染鑒定和產(chǎn)前診斷 明確先證者基因突變位點后告知其相關情況，先證者簽署知情同意書。先證者姐姐于妊娠18周在超聲引導下行羊膜腔穿刺術以采集羊水，其中部分羊水用于細胞培養(yǎng)及染色體核型分析，部分羊水用于提取基因組DNA。選用PowerPlex16試劑盒進行基因型分析以排除羊水標本母源污染，確定無母源污染后對羊水DNA的EDA基因進行有針對性的Sanger測序，但羊水DNA提取濃度低導致Sanger擴增產(chǎn)物濃度低且測序信號差、低峰高，因而轉用時間飛行質(zhì)譜分析技術（Mass ARRAY）對胎兒基因組DNA進行有針對性的基因突變位點分析，最后通過MassARRAY延伸產(chǎn)物峰數(shù)據(jù)判斷相應基因突變位點基因型。

2 結果

2.1 基因檢測結果 高通量測序結果顯示先證者EDA基因第二外顯子編碼區(qū)（EX2/CDS2區(qū)）存在一半合子突變c.467G＞A（p.Arg156His，Hemi；參考轉錄本NM_001399），該突變位點位于X染色體，為錯義突變，并由于鳥嘌呤（G）被腺嘌呤（A）替換而導致EDA基因的第156位氨基酸密碼子CGC突變?yōu)镃AC，造成正常的精氨酸（Arg）被組氨酸（His）替代。先證者Sanger測序結果與高通量測序結果一致。經(jīng)查，先證者c.467G＞A（p.Arg156His）在1000 Genomes Project數(shù)據(jù)庫中的頻率為0，在HGMD為已知致病性變異并已被報道[7]。先證者確診為XL-HED，先證者姐姐及外甥女均經(jīng)Sanger測序發(fā)現(xiàn)c.467G＞A雜合突變，為雜合攜帶者（見圖3）。

2.2 產(chǎn)前診斷 羊水經(jīng)母源污染鑒定確定無母體細胞。胎兒羊水染色體核型分析未見明顯異常。Mass ARRAY結果顯示先證者只出現(xiàn)A型突變峰；胎兒（Ⅲ2）G型峰明顯、無A型突變峰，即不存在EDA基因突變位點（見圖4）。

2.3 遺傳咨詢 遺傳咨詢門診告知先證者姐姐胎兒不存在EDA基因突變，可繼續(xù)妊娠，同時告知其XL-HED遺傳異質(zhì)性，不排除臨床表現(xiàn)典型卻無法找出相關基因突變位點的可能。

3 討論

圖3 XL-HED家系成員EDA基因測序結果Figure 3 EDA gene sequencing results of the XL-HED family members

圖4 XL-HED家系成員Mass ARRAY結果Figure 4 Mass ARRAY results of the XL-HED family members

XL-HED約占全部HED的90%[8]，其致病基因EDA基因位于Xq13.1，全長423 kb，包含有12個外顯子，編碼含有391個氨基酸的ectodysplasin A蛋白[9]。截至目前，已有多種EDA基因突變類型被報道，而HAN等[2]通過總結2015—2019年報道的62例漢族HED患者EDA基因類型發(fā)現(xiàn)其突變類型涉及錯義突變、無義突變、插入突變、移碼突變、剪接突變、缺失、重復等，其中40%為錯義突變，且第1～10外顯子均存在突變位點。有研究表明，EDA基因無義突變所致HED患者易出現(xiàn)先天性牙齒缺如，而EDA基因錯義突變所致HED患者則易出現(xiàn)少汗、無汗癥狀[2]，且很少出現(xiàn)牙齒缺如[10]，提示HED患者雖有相似的臨床表型，但不同EDA基因突變類型所致HED患者臨床表型仍存在一定差異。本研究中先證者嚴重少汗，常伴有高熱但牙齒缺如并不明顯，與上述文獻報道相符。

EDA基因屬于腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）配體基因家族[11]，其所編碼的ectodysplasin A蛋白屬于Ⅱ型跨膜蛋白，而ectodysplasin A蛋白的結構域包括細胞內(nèi)結構域、跨膜結構域、酶裂解結構域、膠原樣結構域、TNF同源結構域等[2，12]。核因子（NF）-κB或Wnt/β-catenin細胞轉導信號通路是參與正常外胚層器官發(fā)育的重要信號通路[13]，而約50%的EDA基因突變患者存在ectodysplasin A蛋白功能改變，進而影響NF-κB或Wnt/β-catenin細胞轉導信號通路[8]。本研究中先證者及其姐姐、外甥女EDA基因第二外顯子467位點G被A替換，造成EDA基因第156位氨基酸密碼子CGC突變?yōu)镃AC、Arg被His替代，同時該突變位于酶裂解結構域，打破了酶裂解位點并影響了EDA基因編碼的ectodysplasin A蛋白，從而導致正常外胚層上皮細胞信號通路中斷并影響皮膚及其附屬物的正常發(fā)育[7，12]。

XL-HED患者因汗腺發(fā)育不全而常伴有少汗、高熱、皮膚干燥，對于＜1歲的XL-HED患兒，出現(xiàn)高熱伴肺部感染時常會危及其生命。此外，XL-HED患者還會終身存在相關并發(fā)癥，如復發(fā)性鼻竇感染、濕疹等，不僅會嚴重影響患者身心健康，還會給患者家庭及社會造成沉重的精神和經(jīng)濟負擔。目前，臨床尚無有效治療XL-HED的方法，因此有效的產(chǎn)前診斷對避免XL-HED患兒的出生具有重要意義。通常情況下，可通過出汗減少、頭發(fā)稀疏、牙齒發(fā)育異常三聯(lián)癥診斷XLHED，但女性患者受X染色體隨機失活影響可能會出現(xiàn)牙齒缺陷和出汗不均相關表型，本研究中女性患者均表現(xiàn)出牙齒異常，提示應重視女性患者的產(chǎn)前診斷以降低男性新生兒死亡風險等。

本研究對疑似存在XL-HED家族史的孕婦進行了遺傳咨詢，并對先證者、可能的致病基因攜帶者及孕婦本人進行了家系分析及EDA基因檢測，明確該家系成員EDA基因突變位點后對胎兒進行了產(chǎn)前診斷，后明確該胎兒不存在EDA基因突變并告知相關家系成員XL-HED遺傳異質(zhì)性，后期仍需進行出生后隨訪。需要指出的是，如該胎兒產(chǎn)前診斷為XLHED，則應在充分告知孕婦及家屬真實信息并在知情同意情況下尊重其選擇權，并進行遺傳咨詢。提示遺傳咨詢及有效的產(chǎn)前診斷是減少及避免XL-HED患兒出生的有效路徑。

作者貢獻：金玉霞進行文章的構思與設計，文獻/資料收集、整理，撰寫論文，對文章整體負責；金玉霞、李素萍進行論文的修訂；李晶進行英文的修訂；唐萍負責文章的質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。