董建國 ， 饒 丹 ， 劉 濤 ， 胡 靜 ， 何書海 ， 焦鳳超 ， 陳 斌 ， 黃 立 ， 趙攀登

(1. 信陽農林學院牧醫(yī)工程學院 ， 河南 信陽 464000 ； 2. 河南牧業(yè)經濟學院動物醫(yī)學院 ， 河南 鄭州 450046)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是一種對養(yǎng)豬業(yè)危害嚴重的傳染病，該病的病原是豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)。PRRSV的基因型分為兩類(I型、II型),在歐洲流行的以Lelystad virus (LV)為代表的毒株歸為I型 ； 在北美流行的以VR-2332為代表的毒株歸為II型，這2種毒株之間全基因組同源性僅為60%，抗原性也有很大差異[1-2]。我國首先分離到的PRRSV毒株為CH-1a[3]，2006年高致病性毒株在我國暴發(fā)，造成了嚴重的經濟損失[4]。近年來又流行了NADC30-like毒株。由于PRRSV的毒株較多、變異性強等特性，給該病的防控帶來嚴峻的挑戰(zhàn)，因此掌握PRRSV的遺傳演化規(guī)律對防控PRRS十分關鍵。為了進一步了解廣東地區(qū)PRRSV流行毒株的遺傳特性，本試驗在該地區(qū)分離到了PRRSV毒株，并對其全基因組進行了測序分析，掌握了該毒株的遺傳演化特性，為廣東地區(qū)PRRSV的防控提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 病料與主要試劑 樣品采自廣東省某疑似暴發(fā)PRRS的豬場，采集發(fā)病豬的肺部病變組織，置于-80 ℃ 備用。Marc-145 細胞為本試驗室保存；病毒DNA/RNA 提取試劑盒、Trans-5α感受態(tài)細胞、RT-PCR 相關試劑盒、膠回收試劑盒和DL2 000 DNA marker，均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 引物設計與合成 根據GenBank中收錄的PRRSV代表毒株全基因組序列，設計出1對擴增GP5基因的鑒定引物(GP5F：5′-GTGTCAGGCATTGTGGCTGTG-3′;GP5R:5′-CATTATTGGCATGTAGGTGATAGAAAA-3′)和13對特異性引物用于擴增全基因組序列，引物由金維智有限公司合成。引物信息見表1。

表1 PRRSV全基因組擴增引物Table 1 Amplification primers of PRRSV whole genome

1.3 病料處理 將采集的病變組織剪碎，混合1 mL 的PBS在4 ℃環(huán)境下充分研磨，組織研磨液，10 000 r/min 離心10 min，收集上清液，用0.22 μm微孔濾器過濾除菌，得到的濾液置于-20 ℃保存。

1.4 病毒分離及間接免疫熒光試驗 Marc-145傳至6孔板培養(yǎng)，每個樣品1個重復，待細胞長滿后棄去培養(yǎng)液，用PBS清洗3次，隨后接種100 μL含病毒的濾液，加入100 μL 不含血清含2%雙抗的DMEM培養(yǎng)液，37 ℃培養(yǎng)1 h，棄去上清，加入含5%血清的DMEM維持液2 mL，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，觀察細胞是否出現明顯細胞病變效應(CPE)，如果有80%細胞出現CPE，就將該細胞液收集置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。為了進一步鑒定出現CPE的細胞感染了PRRSV，同時將做的重復孔細胞用無水乙醇固定20 min，PBS洗滌3次，每次3 min； 加入抗PRRSV N蛋白單克隆抗體，室溫孵育1 h；PBS洗滌3次，每次3 min；加入FITC標記的二抗，避光，室溫孵育1 h；PBS洗滌3次，每次3 min；加入熒光猝滅劑，制作片子并在熒光顯微鏡下觀察。

1.5 全基因組擴增及測序 收取培養(yǎng)至第3代的病毒，根據核酸提取試劑盒說明書操作提取病毒核酸，然后運用反轉錄試劑對病毒核酸進行反轉錄。將反轉錄得到的cDNA作為模板進行基因擴增，反應條件:94 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，62 ℃ 30 s，68 ℃ 2 min， 擴增30個循環(huán)；72 ℃ 7 min。取5 μL 的PCR 產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，選取目的片段按照膠回收試劑盒說明書進行回收，得到的樣品連接到pEASY-Blunt Simple Cloning Vector 上，轉化至感受態(tài)細胞，挑菌鑒定后送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

1.6 基因組序列對比分析 利用Lasergene 及Mega 5.0 軟件對分離的GDhd毒株進行全基因組序列拼接，將得到的GDhd全基因組與國內外分離毒株進行序列比對并構建進化樹，同時構建Nsp2基因和GP5基因的進化樹，PRRSV代表毒株的基因序列均下載自GenBank。

2 結果

2.1 病料樣品的RT-PCR檢測 將病料提取的核酸作為模板，進行擴增，然后用1%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，結果顯示，擴增片段大小符合預期結果(833 bp)，同時陰性對照的RT-PCR檢測結果顯示為陰性(圖1)。

圖1 PRRSV GDhd ORF5片段擴增Fig.1 Amplification of PRRSV GDhd ORF5 geneM：DNA分子質量標準 DL2 000； 1：樣品； 2：陰性對照M:DNA marker DL2 000; 1：Sample; 2:Negative control

2.2 病毒分離培養(yǎng)及鑒定 病料處理液接種Marc-145細胞后連續(xù)培養(yǎng)觀察3～5 d，待細胞出現聚集、皺縮并脫落等明顯CPE時，進行間接免疫熒光鑒定，結果顯示，接種病料組出現特異性的綠色熒光，證明病毒分離成功(圖2)。

圖2 PRRSV GDhd在Marc-145細胞上的病變結果(100×)Fig.2 Cytopathic effect of PRRSV GDhd on Marc-145 cell (100×)A：正常細胞(熒光)； B：正常細胞(白光)； C:病變細胞(熒光)； D：病變細胞(白光)A:Normal cells (Fluorescence); B:Normal cells (White light); C:Pathological cells (Fluorescence); D:Pathological cells (White light)

2.3 全基因組擴增及測定 運用設計的特異性引物，對GDhd基因組不同片段進行特異性擴增，然后用瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結果顯示，成功擴增出13個片段，片段大小符合預期。將擴增出的片段膠回收連接載體測序，結果顯示，每個片段均測通，且均是PRRSV序列。對13個序列進行拼接得到全長為15 377 bp 的PRRSV全基因組序列，毒株命名為GDhd(圖3)。

圖3 PRRSV GDhd 13個基因片段的RT-PCR擴增結果Fig.3 RT-PCR amplification result of 13 gene fragments from PRRSV GDhd M：DNA marker DL2 000； 1～13：PRRSV GDhd 13個片段的擴增M:DNA marker DL2 000; 1-13:13 fragments amplified from PRRSV GDhd

2.4 GDhd全基因組遺傳演化分析 用Mega 5.0 軟件將GDhd毒株與GenBank上收錄的其他具有代表性的PRRSV毒株構建進化樹。結果顯示，PRRSV主要分為2個大分支，即以Lelystad virus 為代表的歐洲型和以VR2332 為代表的美洲型，美洲型毒株又可細分出以美國NADC30毒株為代表的分支、以CH-1a為代表的我國低致病毒株分支以及以JXA1、HN4為代表的高致病毒株分支(圖4)。結果表明，GDhd株與我國高致病毒株同屬一個分支，與JXA1、HuN4、JXwn06等同源性較高。

圖4 PRRSV GDhd全基因組的進化樹分析Fig.4 Phylogenetic tree analysis of PRRSV GDhd whole genome●：本試驗分離的毒株●:The strains isolated in this test

2.5 GDhd全基因組同源性分析 用DNASTAR軟件將GDhd與其參考毒株的序列對比，結果顯示，GDhd與HuN4同源性最高，為95.6%，與其高致病毒株JXA1、JXwn06同源性為95.4%和95.5%，與NADC30 和NADC30-like毒株 JL580、CHsx1401 同源性分別為86.5%、88.9% 和85.4%，與美洲型代表株VR-2332 同源性為88.2%，與歐洲型代表株Lelystad virus 同源性僅為60.1%(圖5)。

圖5 PRRSV GDhd全基因序列比對Fig.5 Sequence alignment of PRRSV GDhd whole genome

2.6 編碼Nsp2和GP5蛋白的基因序列的進化分析 分別用GDhd編碼Nsp2和GP5蛋白的基因序列與參考毒株的對應基因序列對比分析構建進化樹。結果如圖6顯示，GDhd和JL580在Nsp2編碼區(qū)同屬一個分支，GDhd和JXA1在GP5編碼區(qū)處于同一分支。結果表明，GDhd毒株可能是1株重組毒株。

圖6 PRRSV GDhd Nsp2和GP5基因遺傳進化樹分析Fig.6 Phylogenetic tree analysis of PRRSV GDhd Nsp2 and GP5 genesA：PRRSV Nsp2基因進化樹分析； B：PRRSV GP5基因進化樹分析A:Phylogenetic tree analysis of PRRSV Nsp2 gene; B:Phylogenetic tree analysis of PRRSV GP5 gene●：本試驗分離的毒株●:The strains isolated in this test

2.7 GDhd的重組分析 利用生物信息學軟件對GDhd毒株進行同源性分析。結果顯示，GDhd存在重組現象，重組位點位于全基因組第1 310位點和第3 672位點，2個位點將GDhd分為3個區(qū)域，1區(qū)和3區(qū)與JXA1親緣關系較近，2區(qū)與NADC30親緣關系較近(圖7)。發(fā)生重組的2區(qū)主要位于PRRSVNsp2編碼區(qū)，GDhd毒株在Nsp2編碼區(qū)與NADC30株同源性較高，這些結果表明GDhd是JXA1與NADC30的重組毒株，重組區(qū)域發(fā)生在Nsp2編碼區(qū)。

圖7 PRRSV GDhd重組分析Fig.7 Recombinant analysis of PRRSV GDhd

3 討論

我國流行的PRRSV毒株主要是北美VR-2332的演化毒株，首次分離到的CH-1a毒株與VR-2332的全基因組序列差異較大，目前尚沒有充足的證據證明其來源，隨后分離到的BJ-4毒株與VR-2332同源性較高[5]，可能是通過引進種豬傳入我國。2006年，高致病性PRRS在我國流行，引起豬高發(fā)病率、高死亡率以及妊娠母豬繁殖障礙等，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經濟損失。分離到的毒株主要以JXA1、HuN4為代表，在Nsp2編碼區(qū)存在30個不連續(xù)的氨基酸缺失[6-7]。近年來，我國又流行與美國NADC30相似的毒株，被命名為NADC30-like毒株[8]，主要代表毒株有JL580和CHsx1401，與VR-2332毒株相比Nsp2在aa324～434、aa486和aa505～523存在131個不連續(xù)的氨基酸缺失。

為了解廣東地區(qū)PRRSV流行毒株的遺傳變異特性，本試驗從廣東某疑似PRRS發(fā)病豬場采集病料，并成功分離到PRRSV毒株，命名為GDhd。隨后測定了該毒株的全基因組序列并與其他參考毒株進行比對分析，結果表明，該毒株與HuN4同源性最高，為95.6%，屬于高致病性毒株；GDhdNsp2基因進化分析發(fā)現，GDhdNsp2和JL580Nsp2 在同一分支。重組分析顯示，GDhd毒株在Nsp2編碼區(qū)與NADC30株同源性較高，其他區(qū)域與JXA1同源性較高。這些結果表明，GDhd毒株是一種JXA1與NADC30重組的毒株，重組區(qū)域主要位于Nsp2編碼區(qū)。近些年來，重組的毒株也被越來越多的報道，不同類型之間的毒株存在廣泛重組現象，如lineage 1,3，5和8毒株之間重組[9-10]，NADC30和疫苗毒株 JXA1-P80的重組[11]，并且研究顯示，重組產生的新毒株感染宿主后導致低中和抗體水平，致使豬更容易發(fā)病[12]。通過對2014—2018年的中國和美國毒株基因組分析顯示，PRRSV重組位點主要位于nsp9,GP2和GP3區(qū)域[13]，研究顯示，重組是PRRSV毒株變異的重要原因[14]。本試驗結果表明，Nsp2在基因重組中具有重要作用，是否與毒株的致病性有關需要進一步研究。

重組毒株可表現出不同的毒力及免疫原性，市場上的商品化疫苗對這類毒株常常缺乏保護，這也加劇了PRRS的防控難度。重組毒株的出現增加了PRRSV的多樣性，對流行毒株遺傳特性的研究對于新疫苗的研發(fā)十分重要，本試驗通過對廣東流行毒株GDhd進行分離鑒定及遺傳特性分析，為研究重組毒株的重組特性及疫苗的研發(fā)提供了參考依據。