江曉晗 ， 胡 宜 ， 程 佳 ， 朱春燕 ， 劉 鋼 ， 韓 博 ， 高 健

(1. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 北京 海淀 100193 ； 2. 上海市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心 ， 上海 青浦 201708)

前期的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，克雷伯菌是引起我國大型奶牛場(chǎng)中臨床乳房炎的最常見致病菌之一，分離率為13.0%，僅次于大腸桿菌(14.4%)[1]?？死撞匀榉垦着R床癥狀一般較為嚴(yán)重，和大腸桿菌相比，產(chǎn)奶量損失的發(fā)生時(shí)間較早,持續(xù)時(shí)間較長，嚴(yán)重程度更高[2-3]。最近的研究結(jié)果顯示，引起奶牛臨床乳房炎的克雷伯菌主要是肺炎克雷伯菌(51.0%)和產(chǎn)酸克雷伯菌(49.0%)，兩者分離率相當(dāng)[4]。兩種乳房炎源性克雷伯菌對(duì)關(guān)鍵毒力基因的攜帶率存在差異，但克雷伯菌對(duì)乳房炎的致病力不僅僅與毒力基因的攜帶情況有關(guān)，生長狀況等也會(huì)影響炎癥反應(yīng)程度[5]。此外，細(xì)菌對(duì)乳腺上皮細(xì)胞的黏附和侵襲能力在乳房炎的發(fā)病機(jī)理中起著重要作用[6]。克雷伯菌的黏附和侵襲能力促進(jìn)了急性乳房炎的發(fā)病，并可能導(dǎo)致急性乳腺炎向慢性感染轉(zhuǎn)歸[7]； 克雷伯菌的細(xì)胞毒性作用[乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase,LDH)釋放量]也反映了致使組織損傷的程度[8]。因此，在前期的流行病學(xué)調(diào)查基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)選擇了臨床乳房炎源性肺炎克雷伯菌和產(chǎn)酸克雷伯菌各5株，旨在通過對(duì)比2種細(xì)菌體外生長狀況、對(duì)乳腺上皮細(xì)胞的黏附、侵襲能力及致細(xì)胞損傷能力，初步探索兩者的體外毒力差異。

1 材料與方法

1.1 菌株與細(xì)胞 本試驗(yàn)所用的肺炎克雷伯菌和產(chǎn)酸克雷伯菌均來源于奶牛臨床乳房炎奶樣，患病奶牛均出現(xiàn)了較為明顯的乳汁和乳房異常變化(乳汁呈水狀、絮狀、結(jié)塊、黏稠等；乳房呈紅、熱、腫、痛等)。牛乳腺上皮細(xì)胞(Bovine mammary epithelial cells,bMECs)，購自上海金馬生物制品有限公司，于液氮罐中冷凍保存。

1.2 試劑 MHB肉湯和LB營養(yǎng)瓊脂平板，均購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；內(nèi)毒素(Lipopolysaccharides,LPS)ELISA檢測(cè)試劑盒，購自北京華佰泰生物科技有限公司；乳酸脫氫酶(LDH)細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒，購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.3 克雷伯菌生長曲線測(cè)定 分別挑取5株肺炎克雷伯菌、5株產(chǎn)酸克雷伯菌的單菌落于含有1 mL MHB肉湯的離心管中，37 ℃恒溫?fù)u床上220 r/min振蕩培養(yǎng)8 h。吸取50 μL菌液，與50 mL MHB培養(yǎng)液混合于50 mL離心管，于37 ℃恒溫?fù)u床上220 r/min 振蕩培養(yǎng)，每隔1 h取1 mL培養(yǎng)液，用分光光度計(jì)測(cè)OD600值。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600值為縱坐標(biāo)繪制生長曲線。

1.4 克雷伯菌內(nèi)毒素(LPS)測(cè)定 分別挑取5株肺炎克雷伯菌、5株產(chǎn)酸克雷伯菌的單菌落于含1 mL MHB肉湯的離心管中，37 ℃恒溫?fù)u床上220 r/min 振蕩培養(yǎng)12 h。吸取10 μL菌液，與1 mL MHB培養(yǎng)液混合于離心管中，置37 ℃恒溫?fù)u床上220 r/min振蕩培養(yǎng)2、4、6、8 h和10 h，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置3次重復(fù)。按固定的培養(yǎng)時(shí)間取出離心管，3 000 r/min 離心10 min，吸取上清液，用內(nèi)毒素ELISA檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 細(xì)菌感染bMECs 將復(fù)蘇的bMECs按照0.5 mL/孔 接種到24孔板上，搖勻，于5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃下培養(yǎng)24 h，吸出細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔用PBS洗滌2次。按照MOI=5∶1，每孔加入由DMEM/HIGH GLUCOSE培養(yǎng)基稀釋的克雷伯菌懸液，每株菌設(shè)置2個(gè)重復(fù)，于5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃ 下培養(yǎng)。分別于感染后2、4 h和8 h取樣。

1.6 克雷伯菌對(duì)bMECs的黏附力測(cè)定 取出上述感染細(xì)胞，吸出細(xì)胞培養(yǎng)液(即非黏附細(xì)菌)，每孔用500 μL PBS洗3次，然后每孔加入100 μL胰蛋白酶(含 EDTA)，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中消化1.5 min后，每孔加入100 μL DMEM和血清混合液，將細(xì)胞完全吹打下來。將2個(gè)孔中的細(xì)胞懸液加入1.5 mL離心管。用PBS進(jìn)行連續(xù)10倍倍比稀釋，取10 μL稀釋液接種于LB瓊脂板上，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.7 克雷伯菌對(duì)bMECs的侵襲力測(cè)定 取出感染細(xì)胞后，每孔用500 μL PBS洗滌3次，加250 μL濃度為50 μg/mL的卡那霉素溶液，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，殺死位于細(xì)胞外的細(xì)菌。取出細(xì)胞，吸出上清液，每孔用500 μL PBS洗滌3次后，加入250 μL PBS和250 μL 1% Triton X-100(v/v)裂解細(xì)胞，室溫靜置10 min，釋放侵襲細(xì)菌，再次反復(fù)吹打混勻。取出細(xì)胞裂解懸液，用 PBS 進(jìn)行連續(xù)10倍倍比稀釋，取10 μL稀釋液接種于LB瓊脂板，37 ℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.8 LDH測(cè)定 細(xì)菌感染步驟同1.5。分別于2、4 h 和8 h取出細(xì)胞板，吸出上層細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔用PBS洗2次，后向每孔中加入500 μL DMEM，再放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h取樣，以減少DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液的pH對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。取上層細(xì)胞培養(yǎng)液8 000 r/min離心10 min，取上清液，用LDH試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。于每個(gè)時(shí)間段分別設(shè)置2個(gè)空白對(duì)照孔。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0的獨(dú)立樣本t檢 驗(yàn)和單因素方差分析(One-way, ANOVA)進(jìn)行顯著性分析。當(dāng)P<0.05時(shí)，判定為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 肺炎克雷伯菌和產(chǎn)酸克雷伯菌的體外生長曲線 結(jié)果見圖1。肺炎克雷伯菌和產(chǎn)酸克雷伯菌在MHB肉湯中2 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，對(duì)數(shù)生長期可持續(xù)6 h。在對(duì)數(shù)生長階段，肺炎克雷伯菌的生長速度大于產(chǎn)酸克雷伯菌。

圖1 肺炎克雷伯菌和產(chǎn)酸克雷伯菌體外生長曲線Fig.1 Growth curve of Klebsiella pneumoniae and Klebsiella oxytoca

2.2 LPS釋放量 如圖2所示，在4、8 h和10 h肺炎克雷伯菌和產(chǎn)酸克雷伯菌的LPS釋放量均無顯著差異(P>0.05)。但肺炎克雷伯菌和產(chǎn)酸克雷伯菌于10 h的LPS釋放量極顯著高于8 h的釋放量(P<0.01)。

圖2 肺炎克雷伯菌和產(chǎn)酸克雷伯菌LPS釋放量Fig.2 LPS release by Klebsiella pneumoniae and Klebsiella oxytoca同上一時(shí)間點(diǎn)相比， **:P<0.01;下圖同Compared with the previous time point, **:P<0.01. The same as below

2.3 克雷伯菌對(duì)bMECs的黏附力和侵襲力 如圖3所示，在2、4 h和8 h肺炎克雷伯菌和產(chǎn)酸克雷伯菌對(duì)bMECs的黏附數(shù)和侵襲數(shù)無顯著差異(P>0.05)，而在8 h時(shí)，2種克雷伯菌的黏附數(shù)和侵襲數(shù)均顯著高于4 h(P<0.01)。

圖3 肺炎克雷伯菌和產(chǎn)酸克雷伯菌對(duì)bMECs黏附力(A)和侵襲力(B)對(duì)比Fig.3 Comparison of adhesion(A) and invasion(B) of Klebsiella pneumoniae and Klebsiella oxytoca to bMECs

2.4 克雷伯菌對(duì)bMECs的毒性作用 如圖4所示，在肺炎克雷伯菌組和產(chǎn)酸克雷伯菌感染組，bMECs在4 h和8 h時(shí)的LDH釋放量均極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。隨感染時(shí)間的延長，LDH釋放量逐漸升高，在2種細(xì)菌感染后4 h和8 h，bMECs的LDH釋放量較前一檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)均有極明顯升高(P<0.01)。然而，在肺炎克雷伯組和產(chǎn)酸克雷伯菌感染組，2、4 h和8 h時(shí)引起的bMECs的LDH釋放量未見差異(P>0.05)。

圖4 肺炎克雷伯菌和產(chǎn)酸克雷伯菌感染bMECs后LDH釋放量Fig.4 LDH release quantity of bMECs induced by Klebsiella pneumoniae and Klebsiella oxytoca與對(duì)照組相比， **：P<0.01Compared with the control group, **:P<0.01

3 討論

在前期的流行病學(xué)調(diào)查中，我們從奶牛臨床乳房炎的奶樣中共收集到了124株肺炎克雷伯菌和117株產(chǎn)酸克雷伯菌。在本試驗(yàn)中，分別選擇了5株 肺炎克雷伯菌和5株產(chǎn)酸克雷伯菌，在一定程度上能夠降低對(duì)比試驗(yàn)的偶然性，提升準(zhǔn)確性。

肺炎克雷伯菌的對(duì)數(shù)生長期速度快于產(chǎn)酸克雷伯菌，提示在早期感染階段肺炎克雷伯菌在乳房內(nèi)的繁殖速度可能強(qiáng)于產(chǎn)酸克雷伯菌。LPS 是革蘭陰性菌外膜的主要成分，在細(xì)菌死亡后釋放到環(huán)境中。已有試驗(yàn)表明，細(xì)菌生長迅速時(shí)，細(xì)菌自然死亡能使內(nèi)毒素釋放增加[9]。在體外培養(yǎng)條件下，肺炎克雷伯菌和產(chǎn)酸克雷伯菌在相同時(shí)間內(nèi)，細(xì)菌自然死亡釋放的LPS量無顯著差異；但隨著體外培養(yǎng)時(shí)間的增長，自然死亡細(xì)菌增加，LPS釋放會(huì)隨之增多，故LPS的釋放量可用于評(píng)估細(xì)菌的生長狀況。并且少量的 LPS 可以通過刺激免疫系統(tǒng)而作為一種保護(hù)性的化合物[10-11]；大量的LPS會(huì)引起高燒、增加心率,并導(dǎo)致肺部和腎功能衰竭、血管內(nèi)凝血和系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)[12]。因此，可進(jìn)一步研究細(xì)菌在體內(nèi)作用時(shí)LPS增多引起炎癥反應(yīng)加重的具體情況。

乳腺上皮細(xì)胞是乳腺組織中重要的泌乳細(xì)胞，是病原菌穿過乳頭管機(jī)械屏障后進(jìn)入機(jī)體內(nèi)部之前最先接觸的細(xì)胞[13]。克雷伯菌具有黏附和侵襲乳腺細(xì)胞的能力[14]。肺炎克雷伯菌和產(chǎn)酸克雷伯菌在感染奶牛乳腺細(xì)胞后的2、4 h和8 h，對(duì)于細(xì)胞的黏附數(shù)并無顯著差異。兩種克雷伯菌對(duì)細(xì)胞的黏附數(shù)在感染8 h后均有大幅度的上升?？梢缘贸觯死撞鷮?duì)細(xì)胞的黏附有一定的時(shí)間依賴性。在感染2、4 h和8 h，肺炎克雷伯菌和產(chǎn)酸克雷伯菌侵襲進(jìn)入細(xì)胞的數(shù)量無顯著差異，且侵襲數(shù)量極低。但在感染8 h后，細(xì)菌的侵襲數(shù)量顯著增加?？梢缘贸觯瑑煞N克雷伯菌對(duì)乳腺上皮細(xì)胞的侵襲也有一定的時(shí)間依賴性，這與以往試驗(yàn)結(jié)果相符[15-16]。

LDH 是存在于細(xì)胞漿中，由活細(xì)胞合成的一種酶類，其活性隨著乳房炎嚴(yán)重程度的增加而呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)[15]，可作為評(píng)估乳房健康狀況的指標(biāo)之一[16]。因此，本試驗(yàn)根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)液中 LDH 釋放量的變化判斷乳腺細(xì)胞的損傷程度。感染4 h后，兩種克雷伯菌侵染的細(xì)胞LDH釋放量顯著高于空白組，說明開始引起嚴(yán)重的細(xì)胞損傷；結(jié)合感染后8 h才出現(xiàn)了黏附力和侵襲力的增強(qiáng)，推測(cè)在克雷伯菌乳房炎出現(xiàn)臨床癥狀后，通過抗生素治療及時(shí)清除胞外細(xì)菌控制慢性感染，在時(shí)間上具有可行性。盡管在感染后8 h肺炎克雷伯菌感染組的乳腺上皮細(xì)胞LDH釋放量與產(chǎn)酸克雷伯菌組無顯著差異(P=0.089)，但較低的P值提示，在未來的研究中仍需對(duì)比兩種細(xì)菌在乳腺組織內(nèi)引發(fā)的炎性反應(yīng)強(qiáng)度。本試驗(yàn)中，體外細(xì)胞感染模型中肺炎克雷伯菌和產(chǎn)酸克雷伯菌對(duì)乳房上皮細(xì)胞的侵襲率較低。此外，黏附率和LDH的釋放具有同步性，而侵襲率與LDH的釋放無明顯相關(guān)性。以上結(jié)果提示，克雷伯菌的侵襲作用可能不是影響其引起嚴(yán)重急性炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因素，與Anaya等的研究結(jié)果相似[17]。但最新研究顯示，在小鼠體內(nèi)乳腺模型中，細(xì)菌乳腺上皮細(xì)胞的黏附和侵襲有助于乳房炎發(fā)病[7]，提示后續(xù)研究應(yīng)從體內(nèi)模型進(jìn)一步探索克雷伯菌性乳房炎的致病機(jī)理。