呂 利 ， 謝 穎,2 ， 林柏良 ， 鄧招游 ， 鄧銳涵 ， 彭健波 ， 吳文健 ， 陶 卿 ， 何家康,

(1. 廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 ， 廣西 南寧 530005 ； 2. 廣西壯族自治區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心， 廣西 南寧 530001 ; 3. 廣西獸藥制劑工程技術(shù)研究中心 ， 廣西 南寧 530003)

動(dòng)物膽汁具有抗菌、抗炎、解熱鎮(zhèn)痛、抗氧化等多種藥理活性，膽汁酸為膽汁的主要成分[1-2]。黃芩是中醫(yī)臨床的常用藥之一，具有清熱燥濕、解毒等功效[3]，在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中，黃芩具有抗菌[4]、抗病毒[5]、抗炎[6]、抗過敏[7]、抗氧化[8]等藥理作用。連翹味苦、性微寒，有清熱止吐、除濕退黃、清肝利膽等作用[9]，現(xiàn)代藥理研究表明，連翹具有廣譜抗菌、抗炎、解熱、利尿的作用[10-12]。中藥注射劑是從藥材中提取有效成分并純化后，制成的可注入機(jī)體的溶液、乳狀液及臨用前配制為溶液的粉末或濃溶液的無菌制劑[13]。中藥注射劑是現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)與傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論相結(jié)合的產(chǎn)物，可直接注入體內(nèi)，吸收快，定位準(zhǔn)確，療效高，可以治療許多急、慢性病例或危重病例，可充分發(fā)揮中藥的優(yōu)點(diǎn)[14]。

膽翹注射液是由膽膏、黃芩提取物和連翹提取物經(jīng)加工制成的中藥注射劑，具有清肺止咳、消炎利膽等多種功效。本試驗(yàn)旨在建立膽翹注射液中膽膏、黃芩提取物和連翹提取物的薄層鑒別方法，以及膽膏、黃芩提取物含量測(cè)定的高效液相色譜(HPLC)分析方法，為膽翹注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供方法學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備 ZF-20D暗箱式紫外分析儀，購自上海寶山顧村電光儀器廠；939型全自動(dòng)薄層制板器，購自重慶南岸貝爾德儀器技術(shù)廠；ZDX-35BI自動(dòng)座式壓力蒸汽滅菌鍋，購自山東新華醫(yī)療器械股份有限公司；BP211D 電子分析天平，購自德國賽多利斯集團(tuán)；LC-20A高效液相色譜儀，購自日本島津制作所，配備有SPD-M20A檢測(cè)器和DAD、SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器和柱溫箱；TU-1901紫外可見分光光度計(jì)，購自北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；B3200S-T超聲儀，購自必能信超聲(上海)有限公司；CD-UPT-П-20L超純水儀，購自成都越純科技有限公司。

1.2 藥品與試劑 甲醇、乙腈為色譜級(jí)，其他試劑為分析純，水為超純水；膽膏，其藥材基原膽汁為豬科動(dòng)物Sus scrofa domesticus Briss.，經(jīng)乙醇處理獲得稠膏狀物，膽膏的標(biāo)準(zhǔn)符合《獸藥國家標(biāo)準(zhǔn)》化學(xué)藥品、中藥卷第一冊(cè)“膽膏”項(xiàng)下規(guī)定，產(chǎn)地廣西；黃芩提取物(含黃芩苷86.9%)、連翹提取物(含連翹苷1.98%)，均購自四川恒瑞通達(dá)生物科技有限公司；三批膽翹注射液中試樣品(批號(hào)：20150601、20150602和20150603)、缺膽膏的膽翹注射液陰性樣品、缺黃芩提取物的膽翹注射液陰性樣品、缺連翹提取物的膽翹注射液陰性樣品，由廣西北斗星動(dòng)物保健品有限公司提供；豬去氧膽酸對(duì)照品(中國食品藥品檢定所研究院，純度：TLC時(shí)99.5%，HPLC時(shí)97.5%，批號(hào)：100087～200610)；鵝去氧膽酸對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院，純度：98.3%，批號(hào)：110806～201708)；黃芩苷對(duì)照品(中國食品藥品檢定所研究院，批號(hào)：110715～201714)。

1.3 薄層色譜(TLC)鑒別

1.3.1 膽膏的鑒別 精密量取膽翹注射液10 mL，置50 mL錐形瓶中，加10%氫氧化鈉溶液10 mL，用牛皮紙將瓶口蓋上，置立式滅菌鍋中，于120 ℃、壓力103 kPa加熱4 h，放冷，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至6～7，移至100 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液50 mL，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液；取缺膽膏的膽翹注射液陰性樣品，按上述方法制得陰性樣品液；另取豬去氧膽酸對(duì)照品、鵝去氧膽酸對(duì)照品，分別加無水乙醇制成每1 mL各含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取上述藥液各5 μL，于同一硅膠G薄層板上點(diǎn)樣，以異辛烷-乙醚-正丁醇-冰乙酸-水(10∶5∶3∶5∶1,v/v/v/v/v)的上層溶液(臨用配置)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)清晰顯色視檢。

1.3.2 黃芩提取物的鑒別 取膽翹注射液1 mL，加甲醇9 mL，搖勻，作為供試品溶液；取缺黃芩提取物的膽翹注射液陰性樣品，按上述方法制得陰性樣品液；另取黃芩苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg 的溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取上述藥液各2 μL， 于同一聚酰胺薄膜點(diǎn)樣，以醋酸為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%三氯化鐵乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)清晰顯色視檢。

1.3.3 連翹提取物的鑒別 取膽翹注射液60 mL，加乙酸乙酯振搖(輕搖)提取3次(60 mL、50 mL、40 mL)，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，蒸至近干，加中性氧化鋁0.5 g，拌勻，加置中性氧化鋁柱(100～200目，1 g，內(nèi)徑1～1.5 cm)上，用70%乙醇80 mL洗脫，收集洗脫液，濃縮至干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液；取缺連翹提取物的膽翹注射液陰性樣品，按上述方法制得陰性樣品液；另取連翹苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取上述藥液各2～5 μL，于同一硅膠G薄層板上點(diǎn)樣，以三氯甲烷-甲醇-冰乙酸(17∶2∶1,v/v/v)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)清晰顯色視檢。

1.4 膽膏含量測(cè)定

1.4.1 色譜條件 Inertsil ODS-3 C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相：乙腈-0.1%冰乙酸(50∶50)；流速：1 mL/min；檢測(cè)器：蒸發(fā)光散射檢測(cè)器；進(jìn)樣量：對(duì)照品溶液5 μL和10 μL，供試品溶液10 μL；理論板數(shù)按豬去氧膽酸峰計(jì)算應(yīng)不低于7 000。

1.4.2 對(duì)照品溶液的制備 分別取豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸對(duì)照品適量，精密稱定，各加入甲醇，分別制得0.625 mg/mL的對(duì)照品貯備液，備用。

1.4.3 供試品溶液的制備 精密量取本品10 mL，置50 mL錐形瓶中，加10%氫氧化鈉溶液10 mL，用牛皮紙將瓶口蓋上，置立式滅菌鍋中，于120 ℃、壓力103 kPa加熱4 h，放冷，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至6～7，移至100 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

1.4.4 專屬性試驗(yàn) 取豬去氧膽酸對(duì)照品、鵝去氧膽酸對(duì)照品、供試品、陰性樣品，在“1.4.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣檢測(cè)。

1.4.5 線性關(guān)系考察 分別配制濃度為0.125、0.250、0.375、0.500 mg/mL和0.625 mg/mL的豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸對(duì)照品溶液，在“1.4.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣檢測(cè)。取“1.4.2”項(xiàng)下濃度均為0.625 mg/mL的豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸對(duì)照品溶液，加甲醇稀釋，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。

1.4.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密量取同一批次注射液樣品6份，按“1.4.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，在“1.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)。

1.4.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取同一批次注射液樣品適量，按“1.4.3 ”項(xiàng)下制備供試品溶液，于室溫下放置0、4、8、12、16、20 h和24 h后在“1.4.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣檢測(cè)。

1.4.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已知含量的供試品1.0 mL，平行6份，每份各精密加入豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸對(duì)照品貯備液4.0 mL，按“1.4.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“1.4.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣檢測(cè)。

1.4.9 樣品含量測(cè)定 取三批樣品，按“1.4.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“1.4.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣檢測(cè)；另取對(duì)照品適量，同法測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算膽翹注射液中豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸的含量。

1.5 黃芩提取物含量測(cè)定

1.5.1 色譜條件 Inertsil ODS-3 C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相：甲醇-水-冰乙酸(50/50/1)；體積流量：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為274 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

1.5.2 對(duì)照品溶液的制備 取黃芩苷對(duì)照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成濃度為0.750 mg/mL的對(duì)照品溶液，即得。

1.5.3 供試品溶液的制備 精密吸取供試品1 mL， 置100 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

1.5.4 專屬性試驗(yàn) 取黃芩苷對(duì)照品、供試品、陰性樣品，在“1.5.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣檢測(cè)。

1.5.5 線性關(guān)系考察 分別配制濃度為0.075、0.150、0.225、0.300 mg/mL和0.375 mg/mL的黃芩苷對(duì)照品溶液，在“1.5.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣檢測(cè)，以峰面積為縱坐標(biāo)(y)，以黃芩苷對(duì)照品濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)(x)進(jìn)行回歸分析。

1.5.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密量取同一批次注射液樣品6份，按“1.5.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，在“1.5.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣檢測(cè)。

1.5.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取同一批次注射液樣品適量，按“1.5.3 ”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于室溫下放置0、4、8、12、16、20 h和24 h后在“1.5.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣檢測(cè)。

1.5.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已知含量的膽翹注射液1.0 mL，平行6份，每份精密加入黃芩苷對(duì)照品溶液20 mL，按“1.5.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“1.5.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣檢測(cè)。

1.5.9 樣品含量測(cè)定 取3批樣品，按“1.5.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“1.5.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣檢測(cè)；另取對(duì)照品適量，同法測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算膽翹注射液中黃芩苷的含量。

2 結(jié)果

2.1 膽膏、黃芩提取物、連翹提取物的鑒別 由圖1、2、3可知，供試品色譜在與對(duì)照品相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，背景清晰，分離效果好，無干擾，結(jié)果易判斷，符合薄層色譜系統(tǒng)適用性檢驗(yàn)。

圖1 膽翹注射液中膽膏鑒別的薄層色譜分析Fig.1 TLC analysis of bile ointment in Danqiao injection1：缺膽膏的陰性樣品； 2：豬去氧膽酸對(duì)照品； 3：鵝去氧膽酸對(duì)照品； 4：批號(hào)20150601供試品； 5：批號(hào)20150602供試品；6：批號(hào)20150603供試品1:Negative sample without bile ointment; 2:Control substance of hyodeoxycholic acid; 3:Control substance of chenodeoxycholic acid; 4:Batch 20150601 of trial products; 5:Batch 20150602 of trial products; 6:Batch 20150603 of trial products

圖2 膽翹注射液中黃芩提取物鑒別的薄層色譜分析Fig.2 TLC analysis of scutellariae extract in Danqiao injection1：黃芩苷對(duì)照品； 2：缺黃芩提取物的陰性樣品； 3：批號(hào)20150601供試品； 4：批號(hào)20150602供試品； 5：批號(hào)20150603供試品1:Control substance of baicalin; 2:Negative sample without scutellaria extract; 3:Batch 20150601 of trial products; 4:Batch 20150602 of trial products; 5:Batch 20150603 of trial products

圖3 膽翹注射液中連翹提取物鑒別的薄層色譜分析Fig.3 TLC analysis of weeping forsythia extract in Danqiao injection1：缺連翹提取物的陰性樣品； 2：連翹苷對(duì)照品； 3：批號(hào)20150601供試品； 4：批號(hào)20150602供試品； 5：批號(hào)20150603供試品1:Negative sample without weeping forsythia extract; 2:Control substance of weeping forsythia; 3:Batch 20150601 of trial products; 4: Batch 20150602 of trial products; 5: Batch 20150603 of trial products

2.2 膽膏含量測(cè)定

2.2.1 專屬性試驗(yàn) 如圖4所示，豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸的保留時(shí)間分別為10.749 min和22.655 min，處方中其他藥味對(duì)測(cè)定無干擾，說明該方法的專屬性良好。

圖4 膽翹注射液的高效液相色譜分析Fig.4 HPLC analysis of Danqiao injectionA：豬去氧膽酸對(duì)照品溶液； B：鵝去氧膽酸對(duì)照品溶液； C：供試品溶液； D：缺膽膏的陰性樣A:Control solution of hyodeoxycholic acid; B:Control solution of chenodeoxycholic acid; C:Test solution; D:Negative sample without bile ointment

2.2.2 線性關(guān)系 以峰面積的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)(y)，以豬或鵝去氧膽酸對(duì)照品濃度(mg/mL)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)(x)進(jìn)行回歸分析，得豬去氧膽酸的回歸方程為y=1.63x+5.48，R2=0.999 9，鵝去氧膽酸的回歸方程為y=1.66x+5.17，R2=0.999 2，表明豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸在0.125～0.625 mg/mL范圍內(nèi)時(shí)，與峰面積呈良好的線性關(guān)系。當(dāng)信噪比S/N 為3∶1時(shí)，豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸的檢測(cè)限分別為7.81 μg/mL和31.25 μg/mL；當(dāng)信噪比S/N為10∶1時(shí)，豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸的定量限分別為26.04 μg/mL和104.17 μg/mL。

2.2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 測(cè)得豬去氧膽酸的平均含量為2.83 mg/mL，RSD=0.41%(n=6)；鵝去氧膽酸的平均含量為2.30 mg/mL，RSD=0.30%(n=6)，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 測(cè)得豬去氧膽酸的平均峰面積為1 639 762.43，RSD=0.45%；鵝去氧膽酸的平均峰面積為656 498.71，RSD=0.58%，表明供試品溶液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.5 回收率試驗(yàn) 如表1所示，豬去氧膽酸的平均回收率為100.07%，RSD=0.77%(n=6)；鵝去氧膽酸的平均回收率為100.58%，RSD=0.72%(n=6)，表明該方法的準(zhǔn)確度良好。

表1 膽翹注射液的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸)Table 1 Test results of sample recovery rate of Danqiao injection (Hyodeoxycholic acid and chenodeoxycholic acid) (n=6)

2.2.6 樣品含量測(cè)定 3批樣品中豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸的含量測(cè)定結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果(豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸)Table 2 Determination results of sample contents(Hyodeoxycholic acid and chenodeoxycholic acid) (mg/mL，n=3)

2.3 黃芩提取物含量測(cè)定

2.3.1 方法專屬性 如圖5所示，黃芩苷的保留時(shí)間為7.675 min，處方中其他藥味對(duì)該項(xiàng)定量測(cè)定無干擾，說明該方法的專屬性良好。

圖5 膽翹注射液的高效液相色譜分析Fig.5 HPLC analysis of Danqiao injectionA：黃芩苷對(duì)照品溶液； B：供試品溶液； C：缺黃芩提取物的陰性樣品A:Control solution of baicalin; B:Test solution; C:Negative sample without scuteuaria extract

2.3.2 線性關(guān)系 以峰面積為縱坐標(biāo)(y)，以黃芩苷對(duì)照品濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)(x)進(jìn)行回歸分析，得回歸方程為y=3 120 496.6x+45 046，R2=0.999 9。結(jié)果表明黃芩苷在0.075～0.375 mg/mL范圍內(nèi)時(shí)，與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 測(cè)得黃芩苷的平均含量為15.70 mg/mL，RSD=0.27%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 測(cè)得黃芩苷的平均峰面積為5 434 367.14，RSD=1.28%，表明供試品溶液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 回收率試驗(yàn) 如表3所示，加樣回收率試驗(yàn)測(cè)得黃芩苷的平均回收率為101.71%，RSD=1.00%(n=6)，表明該方法用于膽翹注射液中黃芩苷含量測(cè)定的準(zhǔn)確度良好。

表3 膽翹注射液的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(黃芩苷)Table 3 Test results of sample recovery rate of Danqao injection (Baicalin) (n=6)

2.3.6 樣品含量檢測(cè) 3批樣品中黃芩苷的含量測(cè)定結(jié)果見表4。

表4 樣品含量測(cè)定結(jié)果(黃芩苷)Table 4 Determination results of sample contents (Baicalin) (mg/mL，n=3)

3 討論

3.1 關(guān)于膽膏、黃芩提取物和連翹提取物的薄層鑒別 TLC在中藥質(zhì)量控制中具有直觀、顯著的優(yōu)勢(shì)，可同時(shí)分離多種樣品，固定相和流動(dòng)相的選擇與變換靈活大，操作簡(jiǎn)單，分離速度快[16-17]。本試驗(yàn)參照《中國藥典》(2015年版一部)[18]收載的藥材豬膽粉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的薄層鑒別方法、《中國獸藥典》(2015年版二部)[15]收載的黃芩提取物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的薄層鑒別方法、《中國獸藥典》(2015年版二部)[15]收載的連翹提取物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的薄層鑒別方法，進(jìn)行三批中試生產(chǎn)膽翹注射液中膽膏、黃芩提取物、連翹提取物的薄層鑒別，結(jié)果各個(gè)TLC色譜圖背景清晰，分離效果好，陰性樣品無干擾，易判斷，具備專屬性，符合薄層色譜系統(tǒng)適用性檢驗(yàn)。結(jié)果表明該項(xiàng)定性鑒別方法對(duì)供試品的處理及展開系統(tǒng)的選擇是合理的，可作為膽翹注射液中膽膏、黃芩提取物和連翹提取物的鑒別方法。

3.2 關(guān)于膽膏與黃芩提取物的高效液相色譜條件的確定 HPLC具有壓力高、速度快、效率高、靈敏度高等特征，特別是在對(duì)高沸點(diǎn)、受熱后性能不穩(wěn)定或是分子量較大的中藥樣品進(jìn)行測(cè)定和分析時(shí)有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[18-19]。由于豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸屬甾體類化合物，僅在紫外末端有弱的吸收，不適合用紫外檢測(cè)器檢測(cè)，因此本試驗(yàn)選用蒸發(fā)光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)[20]。本文參照《中國藥典》(2015年版一部)[21]

收載的藿膽片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中膽酸及相關(guān)文獻(xiàn)[20]的含量測(cè)定方法，并經(jīng)過多次重復(fù)試驗(yàn)，篩選、優(yōu)化、驗(yàn)證，最終確定膽翹注射液中膽膏含量測(cè)定的色譜條件。對(duì)黃芩苷對(duì)照品溶液進(jìn)行紫外掃描(掃描范圍190～400 nm)，結(jié)果表明，黃芩苷在274 nm處有明顯的強(qiáng)吸收，因此本試驗(yàn)選用274 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，其他色譜條件參照《中國獸藥典》(2015年版二部)[15]收載的銀黃提取物注射液黃芩提取物含量測(cè)定方法，進(jìn)行多次篩選、驗(yàn)證，最終確定膽翹注射液中黃芩提取物含量測(cè)定的色譜條件。試驗(yàn)結(jié)果顯示，所建立的定量分析方法簡(jiǎn)便、快速、專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度好，可作為膽翹注射液中指標(biāo)成分豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸及黃芩苷的含量測(cè)定方法。