杜孟澤 ， 趙 穎 ， 賈永根 ， 黃亞東 ， 劉賢勇

(1. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 ， 北京 海淀 100193 ； 2. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院 熱帶病防治北京市重點實驗室 ， 北京 西城 100050 ； 3. 北京龜?shù)郎锟萍加邢薰?， 北京 昌平 102208)

黃緣閉殼龜是中國境內(nèi)的八大閉殼龜之一，被列入《人工繁育國家重點保護(hù)水生野生動物名錄》，也是世界上被廣泛飼養(yǎng)的一種觀賞龜，具有很高的觀賞價值[1]。我國龜類疾病研究相對缺乏，針對黃緣閉殼龜在人工養(yǎng)殖環(huán)境或天然野生環(huán)境中的疾病研究更是罕見。由于該品種人工養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，產(chǎn)生的疾病診療問題隨之而來。我國境內(nèi)眾多人工繁育的龜鱉品種中僅中華鱉(Trionyxsinensis)有相關(guān)病例報道。深圳地區(qū)出現(xiàn)過由虹彩病毒引起的以嚴(yán)重貧血為典型特征的鱉類疫情[2]； 后完成了該病毒的全基因組測序，證明其屬于虹彩病毒科的蛙病毒屬[3]。

2015年8月，北京某人工養(yǎng)殖場引入一批凈重均約為12 g的黃緣閉殼龜。同年10—11月，飼養(yǎng)的黃緣閉殼龜曾發(fā)生一起群發(fā)性疾病，同等環(huán)境下養(yǎng)殖的12只龜中有6只幼年龜陸續(xù)出現(xiàn)過相同的癥狀(虛弱、消瘦、反應(yīng)遲鈍)，其中1只于2015年11月9日死亡。發(fā)病期間患龜曾口服磺胺甲噁唑進(jìn)行治療。治療后，多數(shù)龜?shù)陌Y狀有所減輕。為了探究幼龜?shù)乃劳鲈颍驹囼灢捎昧薖CR擴(kuò)增與二代測序相結(jié)合的方法，初步確定口龜桿菌(Chelonobacteroris)存在于感染的黃緣閉殼龜臟器內(nèi)，并推測其與感染動物的死亡有密切關(guān)系。口龜桿菌是近年來新發(fā)現(xiàn)的龜類致病菌,其為巴氏桿菌科、龜桿菌屬(Chelonobacter)的唯一種[4]，與其親緣較近的龜巴氏桿菌(Pasteurellatestudinis)均可以引起龜?shù)南嚓P(guān)疾病[5]。

1 材料與方法

1.1 主要材料 DNA提取試劑盒EasyPure Genomic DNA Kit、DNA聚合酶FastPfu Fly DNA Polymerase、凝膠提取試劑盒EasyPure Quick Gel Extraction Kit、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)品Trans2K Plus DNA marker，均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。試驗涉及的所有引物均由北京天一輝遠(yuǎn)有限公司合成。

1.2 死亡幼龜?shù)牟±韺W(xué)剖檢與組織病理學(xué)觀察 病理剖檢順序：移除腹甲暴露體腔，摘除心臟，清理胃和其他組織相連的網(wǎng)膜，并分離出肝臟；剪斷食道、直腸及周圍連接的組織，摘取游離的消化道與脾臟，再分離肺臟與腎臟；開顱獲取腦部與部分脊髓。獲得的臟器經(jīng)觀察記錄后取疑似存在病變的部位浸于10%福爾馬林中固定，組織樣本經(jīng)脫水透明后包埋于石蠟，切成3～5 μm的切片，按H.E.染色的常規(guī)步驟染色封片并于顯微鏡下觀察。同時無菌操作下切取肝臟、脾臟、十二指腸的組織塊，存于-80 ℃保存。

1.3 組織樣品中潛在病原菌的PCR診斷與Illumina測序分析 16S rRNA和18S rRNA基因序列分別是細(xì)菌和真菌用來編碼rRNA的基因序列，常用于鑒定病原微生物種類。使用DNA提取試劑盒在無菌操作下對肝臟、脾臟與十二指腸的DNA進(jìn)行提取。來源肝臟與十二指腸的DNA經(jīng)PCR檢測其中可能所含的細(xì)菌16S rRNA基因序列。同時檢測肝臟與脾臟的DNA提取物中的真菌18S rRNA基因序列。檢測細(xì)菌與真菌所用的引物見表1。采用50 μL反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增：ddH2O 22 μL，Primers (F/R，10 μmol/L)各1 μL， 2 ×TaqMix 25 μL，DNA模板1 μL。PCR程序：94 ℃預(yù)變形5 min；94 ℃變形1 min，56 ℃退火1 min， 72 ℃延伸2 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。 1 μL 無菌ddH2O作為陰性對照。PCR產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。肝臟與腸道的總DNA樣本通過16S rRNA基因擴(kuò)增后，使用Illumina Miseq PE300 測序平臺進(jìn)行二代測序。測序后得到的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過QIIME[8]與MOTHUR[9]軟件處理后得到了高質(zhì)量的序列。這些序列經(jīng)過NCBI數(shù)據(jù)庫比對后進(jìn)行聚類分析，默認(rèn)相似度大于97%的序列劃歸在同一個分類操作單元(Operational taxonomy units,OTUs)。

表1 PCR擴(kuò)增引物Table 1 Primers used in amplification

2 結(jié)果

2.1 大體剖檢與組織病理學(xué)切片觀察 死亡病例剖檢與病理學(xué)切片觀察結(jié)果見圖1。死亡動物小腸漿膜層可見大量出血點，十二指腸上有一貫穿孔，體腔內(nèi)充滿由此溢出的小腸內(nèi)容物；肝臟上可見棕黃色斑點；腎臟體積增大。組織切片顯示，十二指腸在低倍鏡下可見較為清晰的黏膜層、黏膜下層、肌層與漿膜層等結(jié)構(gòu)。腸腔中有較多粉染的纖維素樣滲出并伴有多量的藍(lán)染細(xì)胞滲出；黏膜層局部出現(xiàn)損傷，存在明顯的腸上皮細(xì)胞脫落；黏膜下層中腸腺少，間質(zhì)水腫，結(jié)締組織疏松，血管充血明顯，大量藍(lán)染細(xì)胞浸潤；粉染肌層肌纖維排列緊密有序；漿膜層完整。高倍鏡下：黏膜下層尚存少量腺體，多層圓形藍(lán)染透亮胞核，紅染胞質(zhì)的腺上皮細(xì)胞圍成圓形至橢圓形的腺管，外有極薄的基底層包裹；結(jié)締組織疏松水腫，間隙中可見多量粉染纖維樣物質(zhì)；充血出血明顯，伴有大量淋巴樣細(xì)胞浸潤。肌層中肌纖維斷面清晰，肌細(xì)胞胞核圓形至多邊形，呈藍(lán)色淡染。漿膜層完整，與肌層間距未見異常。腎臟切片在低倍鏡下可見部分腎小管有水腫、小管上皮脫落的情況，腎間質(zhì)中有明顯的淤血。高倍鏡下腎小囊與腎小管中均可見粉染的刷狀物，腎間質(zhì)中還可見大量的紅細(xì)胞與異嗜性粒細(xì)胞。大腦實質(zhì)中廣泛分布大量淋巴樣細(xì)胞，并在血管周圍形成血管套結(jié)構(gòu)，提示存在腦炎。

圖1 死亡龜大體、組織病理學(xué)檢測Fig. 1 Gross and histopathological detection of dead turtlesA:小腸漿膜層面； B：小腸穿孔； C：小腸(H.E.染色,40×)； D：腎臟(H.E.染色,100×)； E：大腦實質(zhì)(H.E.染色,100×)； F：肝臟中的細(xì)菌菌落(H.E.染色,1 000×)A:Serosal layer of small intestine; B:Small intestinal perforation; C:Small intestine (H.E.staining,40×); D:Kidney (H.E.staining,100×); E:Brain parenchyma (H.E. staining,100×); F:Bacterial colonies in liver (H.E.staining,1 000×)

2.2 PCR與二代測序 PCR結(jié)果見圖2。在肝臟和十二指腸中可以經(jīng)PCR成功獲得細(xì)菌的序列，且不能在肝臟與脾臟中擴(kuò)增出真菌的序列。

圖2 病原基因PCR擴(kuò)增Fig.2 PCR amplification of pathogenic genes1：陽性對照； 2、3：死亡動物肝臟和十二指腸組織中16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果； 4：陰性對照； 5：陽性對照； 6、7：死亡動物肝臟和脾臟組織中18S rRNA基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果8:陰性對照1：Positive control； 2,3：PCR amplification of 16S rRNA gene from liver and duodenum of dead animals; 4: Negative control; 5:Positive control; 6,7: PCR amplification of 18S rRNA gene from liver and spleen tissues of dead animals; 8: Negative control

經(jīng)細(xì)菌16S rRNA二代測序分析，肝臟與十二指腸中一共找到了55個分類單元(OTUs)的細(xì)菌。在肝臟中找到的OUTs均出現(xiàn)在十二指腸中。出現(xiàn)頻率排在前10位的OUTs見表2。其中在肝臟組織中口龜桿菌最多，占全微生物數(shù)量的66.3%。而在腸道中口龜桿菌占全微生物數(shù)量的5.8%，居第3位。

表2 死亡病例肝臟與十二指腸中排名前10位的微生物Table 2 The top 10 OUTs in the liver and duodenum of dead turtles

3 討論

通過病理剖檢初步確定了十二指腸穿孔是引起本例黃緣閉殼龜幼龜死亡的直接原因。進(jìn)一步的病理切片診斷表明，小腸尤其是穿孔部位出現(xiàn)了明顯的水腫、血管充血、炎性細(xì)胞浸潤等典型的由細(xì)菌感染引起的炎癥反應(yīng)。大腦實質(zhì)彌散性分布炎性細(xì)胞，有顯著的血管套形成，提示了繼發(fā)性腦炎的可能。在肝臟和腎臟組織切片中，發(fā)現(xiàn)了黑色的菌團(tuán)樣結(jié)構(gòu)。綜上推測可能是細(xì)菌感染引起的腸道穿孔，并繼發(fā)引起了其他器官的炎癥反應(yīng)。

為了進(jìn)一步證實現(xiàn)有推測，本試驗對肝臟DNA樣品進(jìn)行16S rRNA基因擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)了陽性擴(kuò)增條帶。同時對18S rRNA基因也進(jìn)行了擴(kuò)增，結(jié)果為陰性。本試驗也對現(xiàn)有龜鱉上最常見的2種病毒(虹彩病毒與皰疹病毒)進(jìn)行了PCR鑒定，其結(jié)果均為陰性(數(shù)據(jù)未展示)。

為了進(jìn)一步明確致病菌可能的種類以及其在發(fā)病器官的分布情況，本試驗對十二指腸和肝臟樣品的DNA進(jìn)行了二代高通量測序。結(jié)果顯示，肝臟中所含有的疑似致病菌數(shù)量最多的為口龜桿菌。其在十二指腸的含量僅次于腸道常見的大腸桿菌以及棒桿菌屬[10-11]。據(jù)相關(guān)研究，口龜桿菌被認(rèn)為可以導(dǎo)致陸龜?shù)哪c道疾病[4]，并且本菌所在的巴氏桿菌科的細(xì)菌大多數(shù)對家畜也都具有致病能力[12]。因此推測相比于大腸桿菌這類常見共生菌，口龜桿菌更有可能是引起本例黃緣閉殼龜死亡的致病菌。進(jìn)一步研究口龜桿菌對黃緣閉殼龜甚至其他龜類的致病性則需要進(jìn)一步建立合適的回歸感染模型，確定其致病能力。