姜玉梅,姜如云,李俊暢,楊進(jìn)威,牛吉山,李 磊

(1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南鄭州 450046； 2. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家小麥工程技術(shù)研究中心，河南鄭州 450046)

BES1基因家族是植物特有的調(diào)節(jié)油菜素內(nèi)酯(brassinosteroids,BRs)信號(hào)通路的重要轉(zhuǎn)錄因子，可通過(guò)調(diào)節(jié)BRs信號(hào)傳導(dǎo)的代謝通路發(fā)揮作用[1-3]。研究表明，BRs是一種重要的植物內(nèi)源激素，影響多種生物學(xué)進(jìn)程，比如植物莖的伸長(zhǎng)、葉片發(fā)育、花粉管生長(zhǎng)、木質(zhì)部分化、衰老、光形態(tài)發(fā)生、脅迫響應(yīng)等[4]，其在生長(zhǎng)發(fā)育以及脅迫應(yīng)答過(guò)程中的生理活性遠(yuǎn)高于其他植物激素[5]。Sahni等[6]研究發(fā)現(xiàn)，BES1主要通過(guò)激活下游基因的轉(zhuǎn)錄，調(diào)控BRs靶基因的表達(dá)，最終調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆能力。Yang等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中，BES1通過(guò)調(diào)節(jié)BRs的生物合成，抑制防御素和硫苷生物合成基因的表達(dá)，對(duì)植物防御反應(yīng)起促進(jìn)作用。BES1在BRs信號(hào)通路中上調(diào)表達(dá)，不僅可以調(diào)控靶基因的表達(dá)并促進(jìn)莖的伸長(zhǎng)[1]，還可以抑制黃酮類化合物的生物合成，使植物能夠及時(shí)從生長(zhǎng)狀態(tài)轉(zhuǎn)換為響應(yīng)紫外線脅迫的狀態(tài)[8]。小麥(TriticumaestivumL.)是一種重要的糧食作物，其生長(zhǎng)由于BRs的保護(hù)，可免受各種逆境脅迫的沖擊，包括低溫、高溫、鹽度、干旱、組織損傷、病原體入侵、昆蟲(chóng)攻擊等[9-12]。截止目前，BES1基因家族已經(jīng)在擬南芥[13]、油菜[14]、棉花[15]、玉米[16]、番茄[17]、茶樹(shù)[18]等作物中得到鑒定，但對(duì)禾本科作物中BES1基因家族的鑒定還相對(duì)較少。因此，研究BES1基因家族成員在小麥中的功能就顯得更為重要。

近年來(lái)，小麥以及其他禾本科作物的基因組序列陸續(xù)發(fā)布，為進(jìn)一步研究BES1基因在小麥以及其他禾本科作物中的功能和進(jìn)化關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。本研究對(duì)小麥等6種禾本科作物和十字花科模式植物擬南芥在系統(tǒng)發(fā)育、基因結(jié)構(gòu)和共線性關(guān)系等方面進(jìn)行了全基因組比較分析，同時(shí)進(jìn)一步探討了小麥BES1基因家族成員在小麥不同組織(器官)的表達(dá)模式，以期為進(jìn)一步探索BES1基因家族成員的功能及其進(jìn)化情況奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 BES1基因家族的鑒定

從植物參考基因組數(shù)據(jù)庫(kù)Ensembl Plants(http://plants.ensembl.org/)下載小麥、大麥、水稻、玉米、高粱、谷子(6種常見(jiàn)的禾本科作物)以及擬南芥(十字花科模式植物)的基因組數(shù)據(jù)，包括基因組序列文件和蛋白序列文件。通過(guò)Pfam網(wǎng)站(http://pfam.xfam.org/)下載BES1蛋白保守結(jié)構(gòu)域(PF05687)的隱馬爾可夫模型，利用HMMER網(wǎng)站(https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/)進(jìn)行序列比對(duì)，閾值設(shè)置為1×10-5，每條序列保留其對(duì)應(yīng)的最長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本序列作為最終結(jié)果，刪除冗余蛋白序列，獲得各個(gè)物種的BES1家族成員。對(duì)得到的BES1家族成員用SMART網(wǎng)站(http://smart.embl.de/index2.cgi)進(jìn)行蛋白保守結(jié)構(gòu)域的鑒定確認(rèn)，對(duì)驗(yàn)證通過(guò)的小麥BES1家族成員利用Expasy網(wǎng)站(https://web.expasy.org/compute_pi/)對(duì)其氨基酸序列的分子質(zhì)量、等電點(diǎn)等理化性質(zhì)進(jìn)行分析。

1.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

利用MEGA 7.0軟件[19]內(nèi)置的CluatalW工具對(duì)小麥、大麥、水稻、玉米、高粱和谷子BES1基因家族成員的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析。使用鄰近法(neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，bootstrap參數(shù)為1 000。得到的進(jìn)化樹(shù)利用iTOL網(wǎng)站(https://itol.embl.de/)進(jìn)行美化。

1.3 基因結(jié)構(gòu)分析

從SMART網(wǎng)站獲得小麥BES1基因家族成員的蛋白保守結(jié)構(gòu)域的位置信息。從基因組注釋文件中提取小麥BES1基因家族成員的內(nèi)含子、外顯子、染色體位置等信息。利用TBtools軟件[20]進(jìn)行氨基酸序列保守結(jié)構(gòu)域和對(duì)應(yīng)核酸序列基因結(jié)構(gòu)的可視化。

1.4 染色體定位和共線性分析

根據(jù)下載的小麥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中的物理位置信息，利用R語(yǔ)言包Circos將所有BES1家族成員的基因定位到小麥染色體上。采用多重共線性掃描工具M(jìn)CScan X對(duì)基因重復(fù)事件進(jìn)行分析，用TBtools軟件內(nèi)置的Multiple Systeny Plot繪圖工具進(jìn)行物種間共線性分析。

1.5 小麥BES1基因家族的表達(dá)分析

從小麥基因表達(dá)譜網(wǎng)站W(wǎng)heat Expression Browser (http://www.wheat-expression.com/)獲取BES1家族成員在小麥不同組織(器官)中的表達(dá)量數(shù)據(jù)，基因表達(dá)水平以TPM(transcripts per million)為單位，利用TBtools軟件繪制表達(dá)量熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥和6個(gè)代表性植物BES1基因家族成員的鑒定結(jié)果

利用從Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)中下載得到的隱馬爾可夫模型，對(duì)小麥基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行序列比對(duì)，以e-value<1×10-5作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，在小麥中共鑒定到20個(gè)BES1基因家族成員，按照小麥BES1基因家族成員在染色體上的位置信息對(duì)其進(jìn)行命名(表1)。除TaBES1-U位于未知染色體外，其他家族成員分布在14條染色體上。小麥BES1基因家族成員編碼蛋白氨基酸長(zhǎng)度為178～686 aa，分子量為19.27～75.48 kDa，等電點(diǎn)為5.4～9.4。

表1 小麥BES1基因家族成員Table 1 BES1 gene family in wheat

在水稻、玉米、高粱、谷子、大麥和擬南芥中分別鑒定到6、11、10、11、9和8個(gè)BES1基因家族成員?？梢钥闯?，水稻的BES1基因家族成員數(shù)最少，小麥的最多。

2.2 小麥和6個(gè)代表性植物BES1基因家族的系統(tǒng)發(fā)育分析

為了研究小麥、水稻、玉米、高粱、谷子、大麥和擬南芥中BES1基因的進(jìn)化關(guān)系，利用這7個(gè)物種BES1家族基因的蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。根據(jù)ClustalW比對(duì)結(jié)果，去掉進(jìn)化距離較遠(yuǎn)的一個(gè)谷子基因KQL10972，對(duì)其他74個(gè)BES1基因家族成員利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖1)，根據(jù)擬南芥BES1家族成員的分類，同時(shí)結(jié)合不同禾本科作物的進(jìn)化關(guān)系，將74個(gè)BES1基因家族成員劃分為Group A、Group B、Group C、Group D四大類，分別包含31、11、26和6個(gè)家族成員。小麥和6個(gè)代表性植物BES1基因家族成員在四個(gè)大類中的分布見(jiàn)表2。

表2 BES1基因家族成員在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的分布情況Table 2 Distribution of BES1 gene family members in phylogenetic tree

圖1 小麥和6個(gè)代表性植物BES1的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of BES1 in wheat and the six representative plants

2.3 BES1基因家族的基因結(jié)構(gòu)

對(duì)小麥和6個(gè)代表性植物的BES1家族成員進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果(圖2)表明，在小麥中，BES1基因家族成員外顯子數(shù)目差異較大，大部分有2個(gè)外顯子，最多有10個(gè)。整體來(lái)說(shuō)，不同物種的外顯子和內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)與進(jìn)化樹(shù)分組有較好的對(duì)應(yīng)關(guān)系，如Group A、Group B和Group D中的BES1基因一般含有2個(gè)外顯子，而Group C中除兩個(gè)大麥BES1基因外，其他BES1基因家族成員均含有較多的外顯子。

圖2 小麥和6個(gè)代表性植物 BES1基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)分析Fig.2 Gene structure analysis of BES1 gene family members in wheat and the six representative plants

2.4 小麥和其他6個(gè)代表性植物的共線性分析

對(duì)小麥和其他6個(gè)代表性植物進(jìn)行共線性分析，結(jié)果(圖3)表明，小麥和擬南芥基因組中僅有3個(gè)TaBES1基因存在共線性關(guān)系，小麥和水稻、玉米、高粱、谷子、大麥的共線性基因?qū)?shù)目分別為25、16、15、10、11，說(shuō)明小麥和水稻基因組擁有的共線性基因?qū)?shù)目最多。TaBES1-3A-1、TaBES1-3B-1和TaBES1-3D-1同時(shí)存在于小麥與擬南芥、水稻、玉米、高梁、谷子和大麥這6個(gè)物種的共線性基因?qū)χ校砻鬟@3個(gè)基因可能在單子葉植物和雙子葉植物中普遍存在，形成于物種分化之前，擁有更長(zhǎng)的進(jìn)化時(shí)間。

根據(jù)同源共線性分析結(jié)果，灰色線條代表兩個(gè)物種間所有存在共線性的基因?qū)?，藍(lán)色高亮線條代表小麥TaBES1基因與對(duì)應(yīng)物種間的共線性基因?qū)?。According to the results of homologous synteny analysis,gray lines represent all synteny gene pairs between the two species,and blue lines represent synteny gene pairs between wheatTaBES1 genes and other species.圖3 BES1基因在小麥和6個(gè)代表性植物間的共線性分析Fig.3 Collinearity analysis of BES1 genes between wheat and the six representative plants

2.5 TaBES1基因在不同組織中的表達(dá)模式

對(duì)20個(gè)TaBES1基因家族成員的表達(dá)模式進(jìn)行分析，結(jié)果(圖4)表明，TaBES1基因在不同組織中的表達(dá)模式差異明顯。TaBES1-2A、TaBES1-2B、TaBES1-2D、TaBES1-3A-2、TaBES1-3B-2和TaBES1-3D-2這6個(gè)基因在穗部(特別是雄蕊中)表達(dá)量明顯較高。TaBES1-7A、TaBES1-7B和TaBES1-7D這3個(gè)基因在根部表達(dá)量較高。有8個(gè)TaBES1基因(TaBES1-3A-1、TaBES1-3B-1、TaBES1-3D-1、TaBES1-6A-1、TaBES1-6A-2、TaBES1-6B-1、TaBES1-6B-2和TaBES1-6D)在各個(gè)組織(器官)表達(dá)量均很低或不表達(dá)。綜上，小麥BES1基因在不同組織(器官)中發(fā)揮的功能可能存在差異，部分基因的表達(dá)呈現(xiàn)出組織特異性。

圖4 小麥TaBES1基因在不同組織器官中的表達(dá)譜分析Fig.4 Expression patterns analysis of TaBES1 genes in different tissues of wheat

3 討 論

小麥?zhǔn)堑湫偷漠愒戳扼w，其基因組在所有禾本科作物中最為龐大，約為水稻基因組的40倍[21]。本研究共鑒定到20個(gè)小麥BES1基因家族成員，在數(shù)量上超過(guò)了水稻、玉米、高粱、谷子、大麥等其他禾本科作物。普通小麥?zhǔn)蔷哂蠥ABBDD基因組的異源六倍體，這可能是小麥中BES1基因大量存在的一個(gè)關(guān)鍵原因，相比其他禾本科作物，小麥BES1基因經(jīng)歷了更長(zhǎng)的進(jìn)化時(shí)間。

在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中，相同亞家族中大部分BES1基因有著相似的基因結(jié)構(gòu)，表明結(jié)構(gòu)相似的BES1基因有著相似的進(jìn)化歷史和基因功能[22-23]。共線性分析顯示，小麥BES1基因與擬南芥的共線性最低，但是與其他禾本科作物的共線性關(guān)系相對(duì)較高，說(shuō)明禾本科作物之間親緣關(guān)系更近，尤其是小麥與水稻之間的共線性關(guān)系最高。此外，在小麥和大麥的基因組共線性分析中，小麥第三、第六、第七染色體群中的基因分別對(duì)應(yīng)大麥3H、6H、7H染色體中的基因，也有著良好的共線性關(guān)系，說(shuō)明小麥和大麥基因組高度同源，這對(duì)研究小麥和大麥之間的進(jìn)化關(guān)系有很大幫助。

BES1轉(zhuǎn)錄因子家族是植物體內(nèi)一類重要的基因家族，也是BRs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的核心成員，可以協(xié)同調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆性[24]。在小麥中， 抑制BRs合成的代謝途徑，會(huì)降低小麥的光合作用、籽粒產(chǎn)量以及對(duì)高光、高溫的耐受性[25]。此外，BRs在對(duì)小麥抗旱性、磷酸鹽穩(wěn)態(tài)和谷物質(zhì)量的調(diào)節(jié)中，也扮演著重要的角色[26]。在擬南芥中，BES1基因可以被EMS1-TPD1-SERK1/2介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激活，從而控制擬南芥的絨氈層發(fā)育[13,27]，影響植株育性。表達(dá)模式分析顯示，TaBES1基因在小麥穗和根中的表達(dá)量較高，特別是TaBES1-3A-2、TaBES1-3B-2和TaBES1-3D-2在小麥雄蕊和雌蕊中的表達(dá)量較高，說(shuō)明這三個(gè)基因在小麥穗發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。