于軍偉，王斯文，姚廣平，趙繼新，陳春環(huán),吉萬全，王長有

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100； 2.農(nóng)業(yè)部作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)新陜西科學(xué)觀測試驗(yàn)站，陜西楊凌 712100； 3.三原縣農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)中心，陜西三原 713800)

小麥野生近緣植物攜帶有大量的優(yōu)異基因，是栽培小麥遺傳改良的重要基因資源庫[1]。利用遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)向栽培小麥品種轉(zhuǎn)移近緣種屬的優(yōu)異基因是創(chuàng)造小麥新的變異類型、擴(kuò)寬小麥遺傳基礎(chǔ)、豐富親本遺傳多樣性、創(chuàng)新小麥育種資源的重要手段[2]。

中間偃麥草(Thinopyrumintermedium,2n=6x=42,JJJSJSStSt)屬于小麥族(Triticeae)偃麥草屬(Elytrigia)，為多年生異花授粉植物，主要分布于高加索、中亞的東南部[3]。其抗旱性、耐鹽性和抗寒性都極強(qiáng)，許多農(nóng)藝性狀表現(xiàn)良好，且?guī)缀醪皇苄←滀P病和白粉病的侵害，對黑穗病、根腐病、莖腐病、葉枯病等病害也表現(xiàn)為高抗。中間偃麥草是偃麥草屬中最早與小麥成功雜交的遠(yuǎn)緣材料，為小麥種質(zhì)創(chuàng)新和品種改良提供了大量的優(yōu)異基因，是小麥遺傳改良的重要資源庫[4]。

目前關(guān)于中間偃麥草的基因組組成爭議較大，普遍認(rèn)為中間偃麥草的基因組組成是JJJSJSStSt[5]，為部分同源異源六倍體。Kruppa等[6]利用多色GISH(multi-color GISH, mc-GISH)技術(shù)，以百薩偃麥草(Thinopyrumbessarabicum)和擬鵝觀草(Pseudorogneriastrigosa)的基因組DNA為探針，證明中間偃麥草是由19條J染色體、9條Js染色體和14條St染色體組成。前人研究表明，中間偃麥草J染色體組可能來源于原始的二倍體長穗偃麥草或百薩偃麥草，St染色體組可能起源于擬鵝觀草[7]。關(guān)于JS基因組的來源，Wang等[8]研究認(rèn)為，Js基因組供體先與J基因組經(jīng)過了一次雜交加倍，然后與原始的St基因組供體雜交加倍，形成Js基因組，最后形成了當(dāng)今的中間偃麥草。崔 雨等[5]提出中間偃麥草的Js染色體組可能與簇毛麥有較近的親緣關(guān)系，并將其表示為Jvs，這為中間偃麥草的起源又帶來了新的觀點(diǎn)。

小麥條銹病是由條銹菌(Pucciniastriiformisf.sp.tritici(Pst))引起的影響小麥生產(chǎn)的真菌類病害，可使小麥年產(chǎn)量減少20%～30%，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)甚至顆粒無收[9]。小麥條銹病在我國曾數(shù)次流行，最近一次于2019年發(fā)生在西北地區(qū)，并迅速蔓延至全國[10-11]。研究表明，種植抗病品種是最經(jīng)濟(jì)、最有效的控制小麥條銹病的策略[12]。前人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多個(gè)小麥條銹病抗性基因，并廣泛用于小麥的抗病育種[13]。然而，由于條銹病病原菌毒性小種的變異迅速，大多數(shù)品種的抗病性逐漸降低或最終喪失抗病性[14]。因此，培育新的抗病品種對于小麥育種研究是非常迫 切的。

ES-24是普通小麥品種阿勃缺體系與普通小麥-中間偃麥草部分雙二倍體遠(yuǎn)中4雜交和連續(xù)自交產(chǎn)生的后代，田間對條銹病表現(xiàn)為高抗。本研究利用細(xì)胞學(xué)、原位雜交、分子標(biāo)記等技術(shù)，結(jié)合形態(tài)學(xué)和條銹病抗性調(diào)查，對ES-24進(jìn)行綜合鑒定，以期為ES-24在小麥遺傳改良中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料包括中間偃麥草(2n=6x=42, JJJSJSStSt)、中國春(2n=6x=42，AABBDD)、百薩偃麥草(2n=14，JJ 或EbEb)、擬鵝觀草(2n=14，StSt)、小麥-中間偃麥草二體異附加系ES-24、八倍體親本遠(yuǎn)中4和阿勃缺體系，以及條銹病感病對照品種輝縣紅，均由西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院小麥遠(yuǎn)緣雜交及染色體工程實(shí)驗(yàn)室提供。供試條銹菌生理小種CYR-32和CYR-33混合小種由西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞學(xué)鑒定

分別于3月下旬和4月中旬，在適宜的溫度條件下，在田間取材料的根尖和幼穗進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定。根尖和幼穗的固定參照Yang等[15]的方法完成。利用Olympus BX-43顯微鏡(日本)進(jìn)行鏡檢并采集照片，觀察并統(tǒng)計(jì)其體細(xì)胞有絲分裂中期Ⅰ染色體的數(shù)目、花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂中期Ⅰ染色體的數(shù)目及配對情況、減數(shù)分裂后期Ⅰ同源染色體的分離情況。

1.2.2 原位雜交分析

根尖處理：將種子在室溫下置于濕潤濾紙上，腹溝朝下均勻擺放，置于23℃培養(yǎng)箱萌發(fā)2～3 d，待幼根長至2～3 cm時(shí)，將根尖分生區(qū)切下，采用Wang等[16]的方法處理。選取分裂相良好的染色體采用滴片法制片。

原位雜交分析：用CTAB法提取試驗(yàn)材料幼嫩葉片全基因組DNA。參照Yang等[15]的方法，以中國春的全基因組DNA為封阻，中間偃麥草的全基因組DNA為探針，對ES-24進(jìn)行基因組原位雜交(genomic in situ hybridization, GISH)鑒定。參照Han等[17]的方法，用中間偃麥草的全基因組DNA以及寡核苷酸探針Oligo-pSc119.2(綠色)和Oligo-pTa535(紅色)進(jìn)行熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)鑒定。參照Kruppa等[6]的方法，用Fluorescein-12-dUTP標(biāo)記百薩偃麥草全基因組DNA，用Texas red-5-dUTP標(biāo)記擬鵝觀草全基因組DNA，以百薩偃麥草全基因組(J)DNA(綠)和擬鵝觀草的全基因組(St)DNA(紅)為探針，進(jìn)行mc-GISH鑒定，用Olympus BX-53熒光顯微鏡觀察并用Adobe Photoshop CC2018處理圖像。

1.2.3 分子標(biāo)記分析

利用分布于小麥1～7部分同源群上的90個(gè)EST標(biāo)記和135個(gè)PLUG標(biāo)記，鑒定ES-24所攜帶的中間偃麥草染色體片段的同源群歸屬，追蹤普通小麥背景中中間偃麥草的遺傳物質(zhì)。EST引物信息參照網(wǎng)站Http://wheat.pw.usda.gov/SNP/new/pcr_primers.shtml，PLUG引物信息參照Ishikawa等[18]發(fā)表的引物。引物均由北京奧科鼎盛生物技術(shù)有限公司合成。PCR和電泳分析按照Zhu等[19]的方法進(jìn)行。

1.2.4 條銹病抗性鑒定和農(nóng)藝性狀調(diào)查

成株期條銹病抗性鑒定在小麥育種圃進(jìn)行。鑒定材料于2019年10月中上旬播種，每個(gè)材料播種2行，行長1 m，行距0.25 m，株距10 cm，同時(shí)種植感病對照輝縣紅。在2020年3月中旬傍晚，用清水給感病對照輝縣紅輕噴細(xì)霧后，采用撒粉接種法接種條銹病菌生理小種CYR-32和CYR-33的混合小種，然后用薄膜覆蓋，翌日清晨去掉薄膜。待輝縣紅充分發(fā)病后，調(diào)查發(fā)病情況，按照參考文獻(xiàn)[20]報(bào)道的方法記載反應(yīng)型，2～3 d后再復(fù)查1次。

于2020年6月收獲植株后,調(diào)查并記錄ES-24及親本的株高、穗長、分蘗數(shù)、小穗數(shù)、小穗粒數(shù)、芒性等性狀。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞學(xué)鑒定結(jié)果

根尖分生區(qū)體細(xì)胞染色體數(shù)目觀察結(jié)果(圖1A)顯示，ES-24體細(xì)胞在有絲分裂中期含有44條染色體?；ǚ勰讣?xì)胞鏡檢結(jié)果(圖1B)顯示，減數(shù)分裂中期Ⅰ染色體有22對二價(jià)體，未觀察到多價(jià)體的形成，配對情況良好，其構(gòu)型為2n=44=22Ⅱ。在減數(shù)分裂后期Ⅰ，同源染色體均等分離，未檢測到滯后染色體(圖1C)。以上結(jié)果說明，ES-24具有穩(wěn)定的細(xì)胞遺傳學(xué)機(jī)制。初步推測，ES-24攜帶了一對中間偃麥草的染色體。

A：有絲分裂中期；B：減數(shù)分裂中期I；C：減數(shù)分裂后期I。A:Mitotic metaphase; B:Meiotic metaphase I; C:Meiotic anaphase I.圖1 ES-24的細(xì)胞學(xué)觀察結(jié)果Fig.1 Cytological observation of ES-24

2.2 原位雜交鑒定結(jié)果

以中間偃麥草的全基因組DNA作為探針,以中國春的全基因組DNA作為封阻，對ES-24根尖染色體進(jìn)行GISH鑒定，DAPI(藍(lán)色)復(fù)染。結(jié)果(圖2A)顯示，ES-24有兩條染色體被雜交上綠色信號(hào)，而其余42條染色體均呈現(xiàn)為藍(lán)色，表明ES-24是攜帶42條普通小麥染色體和2條中間偃麥草染色體的二體附加系。

用百薩偃麥草的全基因組DNA和擬鵝觀草的全基因組DNA為探針，中國春的全基因組DNA為封阻，進(jìn)行mc-GISH分析，結(jié)果(圖2B)顯示，ES-24的一對染色體產(chǎn)生了明亮的紅色信號(hào)。說明ES-24攜帶了一對中間偃麥草的St染色體。

A:以中間偃麥草全基因組DNA(綠色)為探針與ES-24根尖染色體進(jìn)行的基因組原位雜交；B:以百薩偃麥草基因組DNA(綠)與擬鵝觀草基因組DNA(紅)為探針進(jìn)行的多色GISH；C:以O(shè)ligo-pTa535(紅)、Oligo-pSc119.2(綠)為探針與ES-24根尖染色體進(jìn)行的熒光原位雜交。白色箭頭所指為中間偃麥草染色體。A:GISH of ES-24 root tip chromosomes using whole genome DNA (green) of Th.intermedium as probe; B:mc-GISH with genomic DNA of Th.bessarabicum(green) and Ps.strigosa(red) as probes; C:FISH of ES-24 root tip chromosomes using Oligo-pTa535 (red) and oligo-pSc119.2 (green) probes.White arrows indicate the chromosomes from Th.intermedium.圖2 ES-24的GISH、FISH和mc-GISH原位雜交鑒定Fig.2 GISH，F(xiàn)ISH and mc-GISH identifications of ES-24

通過以O(shè)ligo-pTa535(紅)、Oligo-pSc119.2(綠)為探針對ES-24進(jìn)行FISH鑒定，ES-24含有42條與中國春FISH核型一致的染色體，一對染色體在其長臂和短臂末端產(chǎn)生Oligo-pTa535紅色信號(hào)，其信號(hào)不同于其他小麥的FISH核型(圖2C)。綜合來看，ES-24附加了一對中間偃麥草的St染色體。

2.3 分子標(biāo)記分析結(jié)果

利用分布在小麥1～7同源群上的90個(gè)EST標(biāo)記和135個(gè)PLUG標(biāo)記，對ES-24及其親本(阿勃、遠(yuǎn)中4和中間偃麥草)進(jìn)行分子標(biāo)記分析，最終篩選出3個(gè)EST特異標(biāo)記(BE591737、BG274576和BE637663)和2個(gè)PLUG特異標(biāo)記(TNAC1826和TNAC1821)(表1)。以上標(biāo)記在ES-24、遠(yuǎn)中4和中間偃麥草中均擴(kuò)增出明顯的特異性條帶(圖3)，且都位于小麥的第七部分同源群染色體上。結(jié)合上述原位雜交結(jié)果，表明ES-24攜帶了一對中間偃麥草的7St染色體。

表1 ES-24所攜帶中間偃麥草7St連鎖的EST及PLUG多態(tài)性標(biāo)記Table 1 EST and PLUG polymorphic markers linked to 7St from Th.intermedium carried by ES-24

M:DL2000；1：阿勃；2：ES-24；3：遠(yuǎn)中4；4：中間偃麥草；a1：BE591737；a2：BG274576；a3：BE637663；b1：TNAC1826-Hae III；b2：TNAC1826-Taq I；b3：TNAC1821-Hae III；b4：TNAC1821-Taq I。箭頭所指為特異性條帶。M:DL2000; 1:Abbondanza; 2:ES-24; 3:Yuanzhong 4; 4:Th.intermedium; a1:BE591737; a2:BG274576; a3:BE637663; b1:TNAC1826-Hae III; b2:TNAC1826-Taq I; b3:TNAC1821-Hae III; b4:TNAC1821-Taq I. Arrows indicate specific bands.圖3 用5個(gè)多態(tài)性標(biāo)記對ES-24及其親本的擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 Amplification results of ES-24 and its parents using five polymorphic markers

2.4 農(nóng)藝性狀調(diào)查和條銹病抗性鑒定結(jié)果

從株高、分蘗數(shù)、穗長、小穗數(shù)、小穗粒數(shù)、芒性等農(nóng)藝性狀對ES-24及親本阿勃和遠(yuǎn)中4進(jìn)行成株期綜合評價(jià)，結(jié)果(圖4)顯示，ES-24的株高、穗長和分蘗數(shù)明顯低于雙親，小穗數(shù)、小穗粒數(shù)和芒性與其母本阿勃相近，且其籽粒較為飽滿。表明ES-24具有矮稈、籽粒飽滿等優(yōu)良農(nóng)藝性狀,可以作為小麥育種的中間材料。

A：植株；B：穗子；C：小穗；D：籽粒；1：遠(yuǎn)中4；2：ES-24；3：阿勃。A:Plant; B:Spike; C:Spikelet; D:Grain; 1:Yuanzhong 4; 2; ES-24; 3:Abbondanza.圖4 ES-24與其親本的農(nóng)藝性狀對比Fig.4 Comparison of agronomic traits among ES-24 and its parents

成株期條銹病鑒定結(jié)果(圖5)顯示，感病對照地方品種輝縣紅表現(xiàn)為高感(IT=4),親本阿勃表現(xiàn)為中感(IT=3)，遠(yuǎn)中4號(hào)和中間偃麥草表現(xiàn)為免疫(IT=0)，ES-24表現(xiàn)為高抗(IT=1)。表明ES-24成株期對于條銹菌生理小種CYR32和CYR33混合小種表現(xiàn)為高抗，根據(jù)其親本的抗病性鑒定以及系譜分析，推測ES-24成株期對條銹病的抗性可能來源于其攜帶的中間偃麥草7St染色體，且中間偃麥草的7St染色體攜帶有抗條銹病基因。

a:中間偃麥草；b：遠(yuǎn)中4；c：ES-24；d：阿勃；e：輝縣紅。a:Th.intermedium ; b:Yuanzhong 4; c:ES-24; d:Abbondanza; e:Huixianhong.圖5 ES-24 及其親本的成株期條銹病抗性表現(xiàn)Fig.5 Stripe rust resistance at adult stage of ES-24 and its parents

3 討 論

GISH和FISH分析是追蹤小麥近緣種屬與普通小麥遠(yuǎn)緣雜交后代外來染色體或片段的準(zhǔn)確而強(qiáng)大的工具[21-22]。本研究利用FISH、GISH和mc-GISH，準(zhǔn)確而高效地鑒定出ES-24附加了一對中間偃麥草7St染色體。用Oligo-pTa535和Oligo-pSc119.2探針，通過比對ES-24與親本及中國春標(biāo)準(zhǔn)FISH核型,明確了中間偃麥草7St染色體的FISH核型，為今后中間偃麥草染色體FISH核型的揭示奠定了基礎(chǔ)。相比于傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)，分子標(biāo)記技術(shù)則可以更加方便而準(zhǔn)確地鑒定出小麥中的外源染色體或片段的同源群歸屬[23]。本研究通過EST和PLUG分子標(biāo)記鑒定，發(fā)現(xiàn)小麥第七同源群上的5個(gè)標(biāo)記能在ES-24和中間偃麥草中擴(kuò)增出明顯的條帶，進(jìn)一步說明了ES-24的外源染色體為中間偃麥草的7St染色體。

據(jù)報(bào)道，染色體組之間的交換重組可能與遠(yuǎn)緣雜交后代染色體組的穩(wěn)定性和適應(yīng)性有關(guān)[24]。小麥屬的亞端粒區(qū)域?yàn)槿旧w末端附近的可變區(qū)，它們可能通過基因組的不斷變化和不同染色體末端之間的均質(zhì)化來穩(wěn)定基因組結(jié)構(gòu)。但有關(guān)插入外源染色體以及對染色體組的進(jìn)化機(jī)制尚未被證明[22-25]。本研究通過mc-GISH驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)ES-24攜帶一對St染色體，但在St染色體末端的亞端粒區(qū)，我們也檢測到來自J染色體明亮的綠色信號(hào)，表明在進(jìn)化過程中這對外源染色體與J染色體發(fā)生了小片段的易位。此易位可能發(fā)生在創(chuàng)制其父本遠(yuǎn)中4的遠(yuǎn)緣雜交過程中，也有可能發(fā)生在遠(yuǎn)中4與阿勃雜交的過程中，這需要對其父本的染色體進(jìn)行全面檢測。

條銹病是對小麥最具毀滅性的病害之一。本研究發(fā)現(xiàn)，ES-24成株期對于條銹菌生理小種CYR32和CYR33混合小種表現(xiàn)為高抗，推測中間偃麥草的7St染色體攜帶有抗條銹病基因，但需要進(jìn)一步的研究驗(yàn)證。

普通小麥與其野生近緣種屬遠(yuǎn)緣雜交所得的二體異附加系，不僅可將所需有益基因轉(zhuǎn)移到普通栽培小麥，而且還可用于研究基因的表達(dá)、物種的進(jìn)化、染色體同源關(guān)系、基因定位等，同時(shí)也是創(chuàng)制外源染色體代換系和小片段易位系的重要中間材料[26-27]。中間偃麥草作為小麥抗病育種的理想中間資源，前人對其進(jìn)行了大量研究。Friebe等[28-30]發(fā)現(xiàn)，普通小麥-中間偃麥草7Ai#2(7D)和7Ai#2(7A)代換系7Ai#2染色體長臂的末端攜帶有葉銹病抗性基因Lr38，7Ai#1染色體攜帶有大麥黃矮病毒抗性基因Bdv2；另外還發(fā)現(xiàn)，在7E(J或Js)·7D代換系和7E附加系中攜帶有大麥黃矮病毒抗性基因Bdv3。Liu等[31]在T7BS·7S#3L易位系(KS12WGGRC59)中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的基因wsm3，對小麥條紋花葉病毒具有抗性。本研究發(fā)現(xiàn)，ES-24成株期對條銹菌生理小種CYR32和CYR33混合小種表現(xiàn)為高抗，推測中間偃麥草的7St染色體攜帶有抗條銹病基因。本研究還發(fā)現(xiàn)，ES-24具有矮稈、籽粒飽滿等優(yōu)良性狀，且其小穗數(shù)、穗粒數(shù)和芒性都與其親本阿勃相似。所以ES-24可作為育種中間材料，將中間偃麥草7St染色體上的優(yōu)良基因?qū)氲狡胀ㄐ←湵尘爸校?St染色體上是否具有矮稈基因還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。由于異附加系的局限性，通過60Coγ輻射，能快速、有效地引起染色體之間的變異[32]，進(jìn)而創(chuàng)制染色體的代換系或易位系。因此，利用以上方法對ES-24進(jìn)行處理,可以創(chuàng)制高抗條銹病的代換系或小片段易位系材料,并通過連續(xù)的回交和自交,可獲得高抗條銹病等優(yōu)良性狀的新種質(zhì)。