陳 杰，張星宇，張福彥，白 冬，宋佳靜，宋全昊，金 艷，趙立尚，朱統(tǒng)泉，王 勇，梁寶萍，李 艷，宋曉朋

(1.河南省駐馬店市農業(yè)科學院，河南駐馬店 463000； 2.河南農業(yè)大學農學院，河南鄭州 450002；3.河南省科學院同位素研究所有限責任公司/河南省核農學重點實驗室，河南鄭州 450015)

面粉色澤是評價小麥加工品質的重要指標之一，隨著過氧化苯甲酰等面粉增白劑的禁用，選育自然白的小麥品種成為當務之急。面粉色澤不僅受到類胡蘿卜素、黃色素等色素類物質的影響，同時還受到多酚氧化酶、過氧化物酶等酶類物質的影響。Loiseau等[1]和Dong等[2]研究表明，小麥籽粒中脂肪氧化酶(lipoxygenase，Lox)可氧化降解類胡蘿卜素進而使面粉增白，因此，研究小麥籽粒中的Lox對改良小麥面粉色澤具有重要意義。

環(huán)境和基因型都能夠影響Lox的活性，但基因型對Lox活性的影響較大[3-4]。小麥籽粒Lox活性是受多基因調控的數(shù)量性狀。前人通過定位發(fā)現(xiàn)，小麥1A、4B、5D和7B 染色體上均存在影響Lox活性的基因位點，并發(fā)現(xiàn)了與其緊密連鎖的SSR標記(Xwmc312、Xbcd1262、Xgwm251和Xksud2a)[5-7]。研究表明，小麥4B染色體上的基因位點對小麥籽粒Lox活性的影響較大[5-9]。近年來，隨著小麥生物信息學的發(fā)展和同源克隆技術的應用，普通小麥Lox活性基因的克隆以及功能標記的開發(fā)也取得了快速的發(fā)展。Geng等[8]利用同源克隆的方法克隆了4B染色體上的TaLox-B1基因， 并根據(jù)等位變異序列之間的差異，開發(fā)設計了兩對共顯性互補功能標記Lox16和Lox18，用來檢測TaLox-B1位點上的等位基因TaLox-B1a和TaLox-B1b。標記Lox16和Lox18已經(jīng)在新疆、陜西、黑龍江和寧夏小麥材料檢測中得到了應用[10-13]。隨后，Zhang等[9]利用同源克隆的方法克隆了4B染色體上的TaLox-B2和TaLox-B3基因， 并根據(jù)等位變異序列之間的差異，開發(fā)設計了一對共顯性功能標記Lox-B23，用來檢測TaLox-B2和TaLox-B3位點上的等位基因TaLox-B2a、TaLox-B2b和TaLox-B3a、TaLox-B3b。標記Lox-B23已經(jīng)在河南和新疆小麥材料檢測中得到了應用[14-15]。

黃淮麥區(qū)(南片)小麥生產在保障我國糧食安全中發(fā)揮著重要作用，該區(qū)小麥產量、抗性、面筋品質等相關性狀的遺傳改良已經(jīng)有了很大進步，但有關小麥籽粒Lox活性的改良尚顯不足。本研究以94份黃淮麥區(qū)(南片)小麥新品系為材料，利用功能標記Lox16、Lox18和Lox-B23對其TaLox-B1、TaLox-B2和TaLox-B3位點上的等位基因進行檢測，同時利用分光光度計對供試材料的Lox活性進行測定，分析TaLox-B1、TaLox-B2和TaLox-B3位點上等位基因的分布情況以及不同等位基因和Lox活性之間的關系，以期為小麥Lox活性分子標記的輔助育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗材料為2020-2021年度黃淮冬麥區(qū)南片水地組區(qū)域試驗的小麥新品系，剔除組別間重復的對照品種，合計94份(表1)。其中來源于河南、安徽、陜西、江蘇和北京的材料分別有52、16、12、10和4份。這些材料都是在黃淮麥區(qū)(南片)23個試驗點經(jīng)過兩年品種比較試驗晉級上來的材料，可以很客觀地反映本麥區(qū)當前的小麥育種水平。

(續(xù)表1 Continued table 1)

1.2 脂肪氧化酶(Lox)活性的測定

利用UV-2601型分光光度計(北京瑞利分析儀器有限公司生產)測定供試材料的Lox活性，具體步驟參照吳培培等[4]的方法。

1.3 等位基因的分子檢測

參照陳 杰等[16]的方法提取參試材料的基因組DNA。用Lox16和Lox18標記檢測參試材料TaLox-B2位點的等位基因，擴增出489 bp 條帶的材料記為TaLox-B1a類型，擴增出791 bp條帶的材料記為TaLox-B1b類型；用 Lox-B23標記檢測參試材料TaLox-B2和TaLox-B3位點的等位基因，擴增出788 bp 條帶的材料記為TaLox-B2a類型，擴增出660 bp條帶的材料記為TaLox-B2b類型，擴增出677 bp 條帶的材料記為TaLox-B3a類型， 未擴增出任何帶型的記為TaLox-B3b類型。所用標記的引物序列及退火溫度等信息見表2。

表2 Lox不同位點等位基因檢測引物信息Table 2 Primers for identification of different Lox alleles

PCR反應體系和擴增程序參照陳 杰等[16]的方法。標記Lox16和Lox18的PCR擴增產物用2%的瓊脂糖凝膠電泳分離，標記Lox-B23的PCR擴增產物用3%的瓊脂糖凝膠電泳分離，電泳緩沖體系為1×TBE Buffer溶液，電壓設置為160 V，電泳時間為40 min，電泳結束后用0.5%的溴化乙錠(EB)染色，用凝膠成像系統(tǒng) (Protein Simple，美國)查看PCR擴增帶型，并拍照保存。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用Microsoft Excel 2003進行數(shù)據(jù)分析，用SPSS 18.0進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 供試材料籽粒Lox活性的分布

對94份供試材料的Lox活性進行測定，結果(表1)表明，供試材料Lox活性的總體平均值為71.47 AU·min-1·g-1，標準差為5.49，變幅為59.8～83.1 AU·min-1·g-1。Lox活性低于70 AU·min-1·g-1的材料有38 份，占比40.4%；Lox活性在70～75 AU·min-1·g-1的材料有29份，占比30.9%；Lox活性值高于75 AU·min-1·g-1的材料有27份，占比 28.7%。其中，有6份材料(冠麥12、漯麥66、淮麥40、泉麥39、周麥36號和周麥49號)的Lox活性高于80 AU·min-1·g-1。有12份材料(西農172、渦麥179、許科10號、鄭麥20、徐麥15019、新農9799、科麥1609、安科1704、豐工40、豐工38、淮麥701和平安918)的Lox活性低于65 AU·min-1·g-1。說明黃淮麥區(qū)(南片)大部分新育成小麥材料均以中等Lox活性為主。

2.2 TaLox-B1、TaLox-B2和TaLox-B3位點等位基因的分布及其與Lox活性的關系

用標記Lox-16和Lox-18對供試材料的TaLox-B1位點進行等位基因檢測，部分材料的檢測結果如圖1所示。94份供試材料中，淮核16174、瑞華麥519、漯麥68等17份材料可以擴增出489 bp的條帶，說明這些材料含有TaLox-B1a等位基因，分布頻率為18.1%；淮核16132、華麥15080、保豐1707等77份材料可以擴增出791 bp的條帶，說明這些材料含有TaLox-B1b等位基因，分布頻率為 81.9%。從以上檢測結果分析可知，94份供試材料的TaLox-B1位點以TaLox-B1b等位基因類型分布為主。

a：Lox-16標記的擴增結果；b：Lox-18標記的擴增結果；M：Marker；1：淮核16132；2：華麥15080；3：保豐1707；4：淮麥701；5：瑞華556；6：保麥1633；7：淮核16174；8：徐麥15019；9：瑞華麥519；10：淮麥40；11：漯麥68；12：駐麥586。圖2同。a:Amplification result by Lox-16; b:Amplification result by Lox-18; M:Marker; 1:Huaihe 16132; 2:Huamai 15080:3:Baofeng 1707; 4:Huaimai 701; 5:Ruihua 556; 6:Baomai 1633; 7:Huaihe 16174; 8:Xumai 15019; 9:Ruihuamai 519; 10:Huaimai 40; 11:Luomai 68; 12:Zhumai 586. The same in figure 2.圖1 Lox-16和Lox-18標記對部分供試小麥品種TaLox-B1位點的擴增結果Fig.1 Amplification results of TaLox-B1 by markers Lox 16 and Lox 18 in some wheat cultivars

用標記Lox-B23對供試材料的TaLox-B2和TaLox-B3位點進行等位基因檢測，部分材料的檢測結果如圖2所示。在TaLox-B2位點，淮核16132、華麥15080、保豐1707等83份材料可以擴增出788 bp的條帶，說明這些材料含有TaLox-B2a等位基因，分布頻率為88.3%；徐麥15019、渦麥179、許科10號等11份材料可以擴增出660 bp的條帶，說明這些材料含有TaLox-B2b等位基因，分布頻率為11.7%；在TaLox-B3位點，華麥15080、保豐1707、瑞華556等63份材料可以擴增出677 bp的條帶，說明這些材料含有TaLox-B3a等位基因，分布頻率為67.0%；淮核16132、淮麥701、淮核16174等31份材料未擴增出任何條帶，說明這些材料含有TaLox-B3b等位基因，分布頻率為33.0%。從以上檢測結果分析可知，94份供試材料的TaLox-B2和TaLox-B3位點分別以TaLox-B2a和TaLox-B3a等位基因類型分布為主。

圖2 Lox-B23標記對部分供試小麥品種TaLox-B2和TaLox-B3位點的擴增結果Fig.2 Amplification results of TaLox-B2 and TaLox-B3 by marker Lox-B23 in some wheat cultivars

從表3可以看出，在TaLox-B1、TaLox-B2和TaLox-B3位點，分別檢測到兩種等位基因，且兩種等位基因之間的Lox活性差異均達到顯著水平，TaLox-B1a、TaLox-B2a和TaLox-B3a等位基因與高Lox活性相關，TaLox-B1b、TaLox-B2b和TaLox-B3b等位基因與低Lox活性相關。

表3 不同位點等位基因對Lox活性的影響Table 3 The effect of different alleles on Lox activity

2.3 不同等位基因組合的分布及其與Lox活性的關系

94份供試材料中，TaLox-B1、TaLox-B2和TaLox-B3位點共檢測到六種類型的等位基因組合(表4)。其中含有TaLox-B1b/TaLox-B2a/TaLox-B3a等位基因組合的材料最多，有53份，分布頻率為56.4%；含有TaLox-B1a/TaLox-B2b/TaLox-B3b等位基因組合的材料最少，僅有2份，分布頻率為2.1%；其余四種類型等位基因組合的分布頻率由高到低依次為TaLox-B1b/TaLox-B2a/TaLox-B3b、TaLox-B1a/TaLox-B2a/TaLox-B3a、TaLox-B1b/TaLox-B2b/TaLox-B3b和TaLox-B1a/TaLox-B2a/TaLox-B3b，分布頻率分別為16.0%、10.6%、9.6%和 5.3%。從以上檢測結果分析可知，94份供試材料以TaLox-B1b/TaLox-B2a/TaLox-B3a等位基因組合類型分布為主。

進一步分析不同等位基因組合對小麥籽粒Lox活性的影響，結果(表4)可以看出，含有TaLox-B1a/TaLox-B2a/TaLox-B3a等位基因組合類型材料的Lox活性最高，與其余五種類型差異顯著。含有TaLox-B1b/TaLox-B2b/TaLox-B3b等位基因組合類型材料的Lox活性最低，與其余五種類型也差異顯著。其余四種等位基因組合類型中，含有TaLox-B1b/TaLox-B2a/TaLox-B3b等位基因組合類型材料的Lox活性最低，與其余三種類型差異顯著。這表明TaLox-B1a/TaLox-B2a/TaLox-B3a等位基因組合與高Lox活性相關，TaLox-B1b/TaLox-B2b/TaLox-B3b等位基因組合與低Lox活性相關，TaLox-B1b/TaLox-B2a/TaLox-B3b等位基因組合與中低Lox活性相關，其余三種等位基因組合與中等Lox活性相關。

表4 不同等位基因組合對Lox活性的影響Table 4 Effect of different allele combinations on Lox activity

2.4 Lox活性基因等位變異在不同省份(直轄市)供試材料中的分布頻率

從表5可知，與高Lox活性相關的TaLox-B1a等位基因在來源于安徽、河南、江蘇、陜西和北京小麥新品系中的分布頻率分別為18.7%、 17.3%、20.0%、16.7%和25.0%，均低于與低Lox活性相關的TaLox-B1b等位基因；與高Lox活性相關的TaLox-B2a等位基因在來源于安徽、河南、江蘇、陜西和北京小麥新品系中的分布頻率分別為75.0%、 92.3%、90.0%、91.7%和 75.0%，均高于與低Lox活性相關的TaLox-B2b等位基因；與高Lox活性相關的TaLox-B3a等位基因在來源于安徽、河南、江蘇、陜西和北京小麥新品系中的分布頻率分別為 62.5%、67.3%、 60.0%、75.0%和75.0%，均高于與低Lox活性相關的TaLox-B3b等位基因。說明來源于安徽、河南、江蘇、陜西和北京小麥新品種均以TaLox-B1b、TaLox-B2a和TaLox-B3a分布為主。

表5 LOX活性等位基因在不同省份材料中的分布頻率Table 5 Frequency of LOX allelesin different provinces

與高Lox活性相關的TaLox-B1a/TaLox-B2a/TaLox-B3a等位基因組合在來源于安徽、河南、江蘇、陜西和北京小麥新品系中的分布頻率分別為6.3%、11.5%、10.0%、8.3%和25.0%；與低Lox活性相關的TaLox-B1b/TaLox-B2b/TaLox-B3b等位基因組合在來源于安徽、河南、江蘇、陜西和北京小麥新品系中的分布頻率分別為18.8%、5.8%、10.0%、8.3%和25.0%。說明來源于安徽、河南、江蘇、陜西和北京小麥新品系均以中等Lox活性相關的等位基因組合分布為主。

3 討 論

了解Lox活性基因位點不同等位基因的分布情況，可為Lox活性的分子遺傳改良提供參考。前人研究表明，TaLox-B1b等位基因在新疆、陜西、黑龍江和寧夏小麥中的分布頻率分別為75.90%、77.46%、88.98%和84.44%[10-13]。本研究結果表明，TaLox-B1b等位基因在黃淮麥區(qū)(南片)及其組成省份安徽、河南、江蘇、陜西小麥新品系中的分布頻率分別為81.9%、 81.3%、 82.7%、80.0%和83.3%。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是TaLox-B1b等位基因與低Lox活性相關，而低Lox活性的小麥較耐儲藏[17]，而高Lox活性可以使面粉增白，各地育種家在耐儲藏和面粉增白兩個性狀上有目的地選擇了前者。張福彥等[14]利用標記Lox-B23對122份河南小麥TaLox-B2和TaLox-B3位點進行等位基因檢測，結果表明，TaLox-B2a和TaLox-B3a等位基因的分布頻率分別為57.4%和41.8%。白 璐等[15]利用標記Lox-B23對123份新疆小麥TaLox-B2和TaLox-B3位點進行等位基因檢測，結果表明，TaLox-B2a和TaLox-B3a等位基因的分布頻率分別為26.8%和77.2%。本研究檢測結果表明，TaLox-B2a和TaLox-B3a等位基因在94份黃淮麥區(qū)(南片)小麥新品系的分布頻率分別為 88.3%和67.0%。綜合以上數(shù)據(jù)可知，TaLox-B2a和TaLox-B3a等位基因在新疆麥區(qū)和黃淮南片麥區(qū)的分布頻率存在很大的差異，這可能是材料來源不同所致。

本研究通過對94份供試小麥材料Lox活性和基因型關聯(lián)分析可知，含有TaLox-B1a、TaLox-B2a和TaLox-B3a等位基因材料的Lox活性均顯著高于其對應位點上含有TaLox-B1b、TaLox-B2b和TaLox-B3b等位基因的材料。這與Geng等[8]和Zhang等[9]的研究結果一致，驗證了TaLox-B1a、TaLox-B2a和TaLox-B3a等位基因與高Lox活性相關，TaLox-B1b、TaLox-B2b和TaLox-B3b等位基因與低Lox活性相關，這也驗證了標記Lox16、Lox18和Lox-B23可以作為Lox活性分子標記輔助育種的有效工具。但本研究也發(fā)現(xiàn)，部分攜帶與高Lox活性相關的TaLox-B1a/TaLox-B2a/TaLox-B3a等位基因組合小麥材料的表型值低于其他等位基因組合類型，造成這種情況的原因可能有兩個，一是生態(tài)環(huán)境的影響，王 慧等[3]和吳培培等[4]研究表明，不同生態(tài)環(huán)境對小麥Lox活性存在影響，但生態(tài)環(huán)境的影響效應低于基因型的影響效應；二是小麥其他染色體上也存在影響籽粒Lox活性的基因位點，F(xiàn)eng等[6]和Garbus等[7]研究表明，普通小麥1A、5D和7B染色體也存在影響Lox活性的基因位點。另外，本研究中冠麥12、漯麥66和周麥49號不僅Lox活性高于80 AU·min-1·g-1，而且均攜帶與高Lox活性相關的TaLox-B1a/TaLox-B2a/TaLox-B3a等位基因組合，可作為選育高Lox活性和亮白面粉品種的親本資源加以應用，Lox16、Lox18和Lox-B23三個標記可作為小麥Lox品種改良輔助選擇的有效工具進一步利用。