滕元姬 陳志鴻

【關(guān)鍵詞】 CRISPR-Cas系統(tǒng);基因編輯技術(shù);宮頸癌

中圖分類號：R737.3?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?? DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2021.10.009

CRISPR是細(xì)菌和古生菌經(jīng)過億萬年的長期進(jìn)化而產(chǎn)生出的一種適應(yīng)性免疫防御系統(tǒng)，它能夠通過crRNAs直接降解外源入侵DNA，從而保護(hù)自身結(jié)構(gòu)的完整性和連續(xù)性。CRISPR-Cas基因編輯是一種由RNA引導(dǎo)的基因編輯技術(shù)，與鋅指核酶、轉(zhuǎn)錄因子核酶等傳統(tǒng)基因編輯技術(shù)相比，具有成本低、效益高、靈活性強(qiáng)、易于操作等優(yōu)點(diǎn)[1]。宮頸癌是全球第四大常見女性惡性腫瘤，每年有超過50萬女性被確診。宮頸癌在我國發(fā)病率僅次于乳腺癌。近年來，其發(fā)病年齡呈年輕化的發(fā)展趨勢，有研究建議將宮頸癌的篩查年齡提前到35歲以前[2～3]?，F(xiàn)通過CRISPR-Cas基因編輯技術(shù)圍繞宮頸癌的建模、早期篩查、耐藥性靶點(diǎn)治療等相關(guān)研究進(jìn)展做一綜述。

1 CRISPR-Cas系統(tǒng)概況

1.1 CRISPR-Cas系統(tǒng)的發(fā)展

CRISPR-Cas最早是在1987年由日本研究人員在測定Escherichia coli堿性磷酸酶同工酶轉(zhuǎn)化基因IAP核苷酸序列時(shí)，在IAP 3端發(fā)現(xiàn)的以32個(gè)核苷酸為間隔，5組29個(gè)高度同源核苷酸序列排列而成的直接重復(fù)序列[4]。2002年Jansen等人通過silico分析技術(shù)進(jìn)一步證實(shí)了這類重復(fù)DNA序列家族只存在于古生菌和細(xì)菌中。為了更好地定義這類直接重復(fù)的DNA序列，將它們正式命名為成簇規(guī)則間隔的短回文重復(fù)序列CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）[5]。2012年，研究人員通過引入RNA成功介導(dǎo)CRISPR-Cas9對目標(biāo)基因組進(jìn)行編輯，使CRISPR-Cas系統(tǒng)揭開了第三代基因編輯技術(shù)的序幕，并被Science評為十項(xiàng)重大科技成果之一[6]。近年來，CRISPR-Cas基因編輯技術(shù)越來越多地被用于醫(yī)藥生物科技、工業(yè)微生物領(lǐng)域等各個(gè)領(lǐng)域[7]。

1.2 CRISPR-Cas系統(tǒng)的作用機(jī)制

CRISPR系統(tǒng)根據(jù)其Cas蛋白基因含量不同分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三種類型。其中CRISPR-Cas9系統(tǒng)是研究得相對成熟且使用最為廣泛的[8]。CRISPR-Cas9系統(tǒng)的免疫防御過程可分為適應(yīng)、表達(dá)、干擾三個(gè)階段[9]。在適應(yīng)階段，當(dāng)細(xì)菌和古生菌識別到有噬菌體、病毒或外源性質(zhì)粒入侵時(shí)，Cas1和Cas2通過原間隔區(qū)相鄰基因序列（PAM）的識別將入侵體的同源DNA短片段整合到CRISPR前導(dǎo)序列與第一個(gè)重復(fù)序列之間，完成對入侵體的適應(yīng)過程[10]。在表達(dá)階段，含有入侵體DNA片段和PAM間隔區(qū)的CRISPR位點(diǎn)被轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生一個(gè)新的CRISPR RNA前體（pre-crRNA），在CRISPR內(nèi)切酶的作用下將pre-crRNA加工為成熟crRNA[11]。進(jìn)而對入侵體的核酸進(jìn)行切割。在I型系統(tǒng)中，crRNA將Cas蛋白復(fù)合物引導(dǎo)至與間隔區(qū)的入侵體互補(bǔ)的DNA靶點(diǎn)基因序列上，由CRISPR-Cas3負(fù)責(zé)對入侵的DNA進(jìn)行切割[12]。在Ⅱ型系統(tǒng)中，攜帶crRNA的CRISPR-Cas9 在PAM26的識別下能直接針對入侵的DNA進(jìn)行切割。細(xì)菌和古生菌便是通過此系統(tǒng)破壞入侵體DNA結(jié)構(gòu)從而保存自身結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)的完整性。

1.3 CRISPR-Cas系統(tǒng)的廣泛應(yīng)用

CRISPR近年來已經(jīng)成為基因組編輯革命的代名詞。特別是RNA引導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶CRISPR-Cas9系統(tǒng)，其在基礎(chǔ)研究和基因編輯治療方法中的應(yīng)用前景備受關(guān)注[13]。CRISPR-Cas系統(tǒng)是高效且易于編程、成本較低的核酸靶向工具，用途不僅局限于醫(yī)學(xué)科學(xué)研究和疾病診斷治療、藥物開發(fā)，也可用于細(xì)菌菌種分型、細(xì)菌耐藥性、自身免疫、自身靶向細(xì)胞調(diào)控等研究[14]，還可用于動植物的精確育種和工業(yè)微生物工程體系[15]?？梢哉f，CRISPR-Cas系統(tǒng)已經(jīng)被運(yùn)用到人類生活的方方面面。

2 CRISPR-Cas系統(tǒng)在宮頸癌早期篩查診斷中的應(yīng)用前景

目前，國內(nèi)使用最廣泛的宮頸癌早期篩查主要手段包括宮頸液基細(xì)胞學(xué)檢查（TCT）和HPV-DNA檢測。但兩種方法都有其技術(shù)上的局限性，如TCT對樣本質(zhì)量要求較高，取樣質(zhì)量對檢測結(jié)果有較大影響，容易導(dǎo)致漏診發(fā)生[16]。HPV-DNA成品化試劑不能全面覆蓋所有HR-HPV檢測類型，而且檢測技術(shù)要求高，檢測成本高，不適于做全面推廣篩查[17]。CRISPR-Cas9/sgRNA系統(tǒng)在DNA檢測和分型方面具有巨大潛力，該系統(tǒng)對靶點(diǎn)識別的特異性高，對同源DNA的檢測和分型有很大幫助，因此，Cas9/sgRNA系統(tǒng)在DNA檢測中的應(yīng)用日益受到廣泛關(guān)注[18]。例如，該系統(tǒng)已被用于美國和非洲的寨卡病毒檢測和分型[19]。另外，Cas9/sgRNA還被用來標(biāo)記血液游離DNA中與疾病相關(guān)的突變基因，以便通過PCR技術(shù)更容易地檢測到它們[20]。同樣，若將CRISPR-Cas9/sgRNA系統(tǒng)引入宮頸癌早期篩查，設(shè)計(jì)E6/E7+CRISPR-Cas9引物探針對女性血液樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增技術(shù)檢測篩查，隨著PCR技術(shù)的日趨成熟，相信CRISPR-Cas基因編輯技術(shù)一定能成為宮頸癌早期篩查的一個(gè)新的、適宜推廣的、高效精準(zhǔn)的檢測手段[21]。ZHANG等人在研究中開發(fā)了Cas9/sgRNA分型PCR檢測技術(shù)（ctPCR3.0），通過在qPCR反應(yīng)中直接用Cas9/sgRNA對目標(biāo)DNA進(jìn)行切割，可以一步完成對目標(biāo)基因的檢測和分型。他們通過檢測HPV各種基因類型，特別是臨床標(biāo)本中的HPV類型，充分驗(yàn)證了這項(xiàng)新技術(shù)的高可靠、特異性和靈敏性[22]。

3 CRISPR-Cas系統(tǒng)在構(gòu)建宮頸癌模型中的應(yīng)用

E6和E7病毒癌蛋白是HPV的早期啟動子。E6、E7在病毒復(fù)制過程中起著非常重要的作用，負(fù)責(zé)復(fù)制早期蛋白的表達(dá)，它可整合人宿主基底上皮細(xì)胞DNA中引起P53和PRB功能失調(diào)導(dǎo)致鱗狀上皮細(xì)胞分化周期紊亂[23]。E6和E7活性增加可以刺激細(xì)胞生長，抑制分化，導(dǎo)致染色體結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[24]。因此，選擇性地剔除宿主細(xì)胞中的入侵性外源基因，特別是E6、E7基因，對預(yù)防和治療宮頸癌有重大意義。CHENG等人[25]成功構(gòu)建hCas9-EGFP和E6-gRNA-RFP質(zhì)粒，制備了攜帶有E6-gRNA和Cas9質(zhì)粒的HPV16假型病毒，通過含有E6-gRNA和Cas9質(zhì)粒的HPV-16假型病毒轉(zhuǎn)染SiHa細(xì)胞并成功表達(dá)E6-gRNA，E6-gRNA+CRISPR-Cas9轉(zhuǎn)染的SiHa細(xì)胞，其E6 mRNA和蛋白水平均明顯下調(diào)，增殖和遷移能力受到抑制，CRISPR-Cas9能夠有效地完成對靶基因E6的切割。結(jié)果表明利用HPV假型病毒介導(dǎo)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除E6基因具有消除HPV感染、抑制HPV相關(guān)腫瘤生長的潛在作用[26]。這些發(fā)現(xiàn)為預(yù)防和治療HPV感染的疾病，特別是與HPV相關(guān)的腫瘤提供了新的治療策略。

4 CRISPR-Cas系統(tǒng)于宮頸癌治療耐藥性的研究

腫瘤細(xì)胞對治療藥物產(chǎn)生耐藥性是癌癥治療面臨的主要問題，具有多重耐藥性是腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥的主要機(jī)制[27]。如何剔除腫瘤細(xì)胞的耐藥基因，使腫瘤細(xì)胞重新獲得對藥物的敏感性，可成為治療方案的一個(gè)突破口。CRISPR-Cas9系統(tǒng)在細(xì)菌耐藥性方面的研究應(yīng)用已經(jīng)是近年的研究熱點(diǎn)[14]。例如，李培思[28]研究團(tuán)隊(duì)建立了一種單質(zhì)粒介導(dǎo)靶向mcr-1基因的 CRISPR-Cas9系統(tǒng)，能有效并特異性消除黏菌素耐藥Escherichia coli中的mcr-1基因，恢復(fù)其對黏菌素的敏感性?？梢?，構(gòu)建靶向耐藥基因的CRISPR-Cas9系統(tǒng)能從根源上解除耐藥基因，阻斷耐藥基因的復(fù)制傳代，重新恢復(fù)細(xì)胞對藥物的敏感性[29]。2015年，有學(xué)者運(yùn)用 CRISPR-dCas9系統(tǒng)針對人體2萬多個(gè)基因設(shè)計(jì)70 290個(gè)sgRNA，構(gòu)成人全基因組CRISPR-dCas9激活細(xì)胞文庫[30]。KARIMIAN運(yùn)用CRISPR-Cas9系統(tǒng)特性切割肺癌患者的表皮生長因子受體（EGFR）突變基因，糾正其治療耐藥性[31]。類似的策略也運(yùn)用在卵巢癌患者的ER或HER2突變中，SgRNA+CRISPR-Cas9系統(tǒng)被設(shè)計(jì)為針對ER或HER2突變外顯子中的特定序列來修復(fù)突變，破壞其耐藥功能結(jié)構(gòu)域，使腫瘤細(xì)胞失去獲得性耐藥[32]。有研究者將CRISPR激活系統(tǒng)引入黑色素瘤細(xì)胞中，與促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞抵抗BRAF抑制劑PLX-4720耐藥激活基因BCAR3共同作用于ERK信號通路下游和上游調(diào)控靶點(diǎn)參與耐藥機(jī)制調(diào)控[33]。同樣，宮頸癌主要是由HR-PHV病毒引起的，PHV癌蛋白E6、E7高度表達(dá)誘導(dǎo)正常細(xì)胞發(fā)生惡性病變[25]。CDDP是目前臨床上治療宮頸癌最有效的抗癌藥物，但其耐藥性的出現(xiàn)嚴(yán)重阻礙了宮頸癌的給藥治療[23]。有研究表明，E6/E7+CRISPR-Cas9與CDDP共同作用于腫瘤細(xì)胞，顯著抑制了細(xì)胞的體外生長和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，這提示了HPVE6/E7+CRISPR-Cas9可以作為CDDP的增敏劑而發(fā)揮作用，兩者聯(lián)合治療可以明顯改善宮頸癌患者的預(yù)后，鼓勵進(jìn)一步研究HPVE6/E7+CRISPR-Cas9與其他臨床化療藥物的相關(guān)性和協(xié)同作用，為宮頸癌的治療提供新的選擇[34]。

5 CRISPR-Cas系統(tǒng)面臨的挑戰(zhàn)與希望

CRISPR-Cas系統(tǒng)極大地促進(jìn)了精準(zhǔn)的基因組靶向編輯操作技術(shù)，并以各種方式廣泛應(yīng)用于臨床癌癥治療，為癌癥治療開辟了新的途徑[35]。但不可否認(rèn)的是CRISPR-Cas系統(tǒng)作為一種新型的基因編輯工具，其自身也存在一定的問題，如編輯細(xì)胞的適應(yīng)性、編輯效率、傳遞方法和潛在的非靶向效應(yīng)等[36]。如何降低操作過程中的脫靶率，成了更好利用該系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯的關(guān)鍵因素[37]。有研究提出，降低CRISPR-Cas9介導(dǎo)的脫靶風(fēng)險(xiǎn)可能的方法包括使用配對的Cas-nickaes（Cas尼克酶）、更短的Protspace互補(bǔ)區(qū)短鏈gRNA和高保真Cas核酸內(nèi)切酶，以及修飾Cas9蛋白以改變PAM特性或增標(biāo)靶DNA識別也可以用來減少脫靶效應(yīng)，從而增強(qiáng)靶向特異性[38～39]。另外，科研工作者在醫(yī)學(xué)研究中必須謹(jǐn)慎使用CRISPR系統(tǒng)，避免類似“基因編輯嬰兒事件”再次發(fā)生[40]。但是，盡管存在一些挑戰(zhàn)，但CRISPR-Cas9技術(shù)作為一種強(qiáng)大的基因編輯技術(shù)，具有巨大的自身潛力和廣闊的運(yùn)用前景[36]。相信隨著CRISPR-Cas9技術(shù)的不斷進(jìn)步和創(chuàng)新，有望提高臨床疾病治療的安全性和有效性，給患者帶來希望。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2021-02-15 修回日期：2021-03-16）

（編輯：梁明佩）