單金雪，李增平，張宇，王曉宇，胡真臻，朱清亮，陳獻(xiàn)鐳

摘? 要：2018年12月在海南省儋州市的枸樹(shù)活立木上發(fā)現(xiàn)一種由靈芝屬真菌引起的干基腐朽病，從病樹(shù)上采集新鮮的擔(dān)子果，組織分離法分離病原菌，對(duì)其進(jìn)行科赫氏法則驗(yàn)證，明確該菌為致病菌。采用ITS-SSU-LSU多基因聯(lián)合構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，通過(guò)形態(tài)學(xué)特征及分子生物學(xué)鑒定為南方靈芝[Ganoderma australe （Fr.） Pat.]，生物學(xué)特性測(cè)定結(jié)果表明該病原菌在溫度條件為25～32 ℃范圍內(nèi)生長(zhǎng)較好，最適溫度為28 ℃，適宜生長(zhǎng)pH為4～7，最適pH為6，在CA、PDA、PSA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)狀態(tài)較好，最適培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，光照對(duì)病原菌菌絲的生長(zhǎng)有抑制作用。

關(guān)鍵詞：枸樹(shù);莖腐病;南方靈芝;生物學(xué)特性

中圖分類(lèi)號(hào)：S763.7? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Identification and Biological Characteristics of Pathogen of Stem Rot of Broussonetia papyrifera

SHAN Jinxue， LI Zengping*， ZHANG Yu， WANG Xiaoyu， HU Zhenzhen， ZHU Qingliang， CHEN Xianlei

College of Plant Protection， Hainan University / Key Laboratory of Green Prevention and Control of Tropical Plant Diseases and Pests， Ministry of Education， Haikou， Hainan 570228， China

Abstract： In December 2018， a stem rot disease was found on Broussonetia papyrifera in Danzhou City， Hainan Province. Basidiocarps related to the disease were collected. The pathogenic pathogen was isolated by the conventional tissue separation method， and the pathogenicity was determined. The phylogenetic tree was constructed by ITS-SSU-LSU multi-gene combination. It was identified as Ganoderma australe by morphology and molecular biology. The results of biological characteristics showed that the pathogen grew well in 25-32 ℃， the optimal temperature was 28 ℃， the optimal growth pH was 4-7， and the optimal growth pH was 6. It grew well on CA， PDA and PSA medium， the optimal medium was PDA medium; light had inhibitory effect on the growth of mycelia of the pathogen.

Keywords： Broussonetia papyrifera; stem rot; Ganoderma australe （Fr.） Pat.; biological characteristics

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.10.027

枸樹(shù)（Broussonetia papyrifera）也稱(chēng)為構(gòu)樹(shù)，是桑科、枸樹(shù)屬的一種落葉喬木，高10～20 m，適應(yīng)性強(qiáng)，具有喜光、速生、抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)。枸樹(shù)在我國(guó)大部分地區(qū)都有分布。由于其對(duì)灰塵、煙塵和高溫的高度耐受性，果實(shí)及根可入藥，嫩葉可作豬飼料等，枸樹(shù)被認(rèn)為是生物群落多樣性中很重要的組成部分，并廣泛用于醫(yī)學(xué)、畜牧業(yè)、造紙等多個(gè)領(lǐng)域，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1-3]。

目前關(guān)于枸樹(shù)病害的相關(guān)報(bào)道主要集中在葉部病害，主要有枸樹(shù)細(xì)菌性葉斑病[4]，由病毒引起的枸樹(shù)葉片卷曲病[5]，真菌病害有枸樹(shù)褐斑病[6]、枸樹(shù)葉片黑斑病[7]。尚未發(fā)現(xiàn)由靈芝屬真菌引起枸樹(shù)干基腐朽病的有關(guān)報(bào)道。筆者從海南儋州軍屯的枸樹(shù)活立木上發(fā)現(xiàn)一種由靈芝屬真菌引起枸樹(shù)干基腐朽病，從病樹(shù)莖干上采集新鮮的擔(dān)子果并進(jìn)行分離培養(yǎng)，對(duì)分離得到的菌株進(jìn)行鑒定，并完成致病性測(cè)定和生物學(xué)特性研究，為研究枸樹(shù)莖腐病的發(fā)病規(guī)律及防治技術(shù)等提供理論基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

于2018年12月31日從海南省儋州市軍屯的枸樹(shù)活立木莖基部采集到與病害相關(guān)的靈芝擔(dān)子果，分離病原菌，并對(duì)標(biāo)本進(jìn)行風(fēng)干保存。供試植株為海南大學(xué)教學(xué)實(shí)習(xí)基地內(nèi)種植的1年生枸樹(shù)苗。

木屑培養(yǎng)基、PDA、PSA、CA、OMA、CMA、Richards、枸樹(shù)枝條浸汁培養(yǎng)基的配制方法參照文獻(xiàn)[8-10]。

1.2? 方法

1.2.1? 菌株分離? 在擔(dān)子果表面用浸濕無(wú)菌水的濕棉花輕輕擦拭，用滅菌手術(shù)刀切去表層，從新鮮露出的部分切取小塊組織移到PDA平板上培養(yǎng)，對(duì)生長(zhǎng)出來(lái)的菌落進(jìn)行純化，從多個(gè)生長(zhǎng)形態(tài)相同的菌株中選取其中長(zhǎng)勢(shì)較好的1株編號(hào)為GSJF001，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2? 接種體制備? 從GSJF001菌落上挑取適量菌絲塊放置于袋裝木屑培養(yǎng)基內(nèi)，用報(bào)紙包裹放置于適宜溫度下培養(yǎng)30 d左右，待整個(gè)培養(yǎng)基布滿菌絲，用于致病性測(cè)定。

1.2.3? 致病性測(cè)定? 對(duì)枸樹(shù)幼苗的基部莖干表面噴灑70%酒精進(jìn)行消毒，待表面干燥，用滅菌手術(shù)刀削去莖干表皮引起輕微傷口，將布滿病原菌菌絲的接種體緊貼傷口處，用保鮮膜進(jìn)行捆綁固定，并用無(wú)菌水浸過(guò)的濕棉花進(jìn)行保濕，相同操作接空白的接種體作為對(duì)照，每處理重復(fù)5次。每隔1周觀察枸樹(shù)長(zhǎng)勢(shì)，并拍照。

1.2.4? 擔(dān)子果誘導(dǎo)? 從GSJF001菌落取少量菌絲塊置于瓶裝木屑培養(yǎng)基中，于常溫條件下培養(yǎng)，定期觀察菌絲生長(zhǎng)情況。

1.2.5? 菌株鑒定? 依據(jù)文獻(xiàn)[11]對(duì)病原菌的擔(dān)子果進(jìn)行表觀形態(tài)鑒定，用攝影生物顯微鏡對(duì)擔(dān)子果的顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察、測(cè)量并拍攝圖片。將GSJF001菌株培養(yǎng)5 d后，提取其總DNA。采用通用引物ITS、小亞基（SSU）、大亞基（LSU）擴(kuò)增基因序列（表1）。擴(kuò)增產(chǎn)物純化、回收后，送鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司測(cè)序。將得到的有關(guān)序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)上進(jìn)行比對(duì)，并提交，下載保存相關(guān)序列和登錄號(hào)（表2）。利用Sequence Matrix軟件進(jìn)行序列拼接，使用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.6? GSJF001菌株生物學(xué)特性測(cè)定? 在超凈工作臺(tái)上，用無(wú)菌打孔器（直徑5 mm）在生長(zhǎng)5 d的病原菌菌落邊緣打取菌餅，將菌餅接種到不同處理?xiàng)l件的平板上，培養(yǎng)5 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

（1）不同溫度條件：將菌餅置于PDA平板上，分別置于15、20、25、28、30、32、35、40 ℃共8個(gè)溫度梯度下黑暗條件下培養(yǎng)。

（2）不同光照條件：將菌餅置于PDA平板上，分別置于黑暗、12 h光暗交替、完全光照3種不同光照條件下，28 ℃培養(yǎng)。

（3）不同pH條件：用1 mol/L HCL和1 mol/L NaOH將PDA培養(yǎng)基的pH分別調(diào)至2、3、4、5、6、7、8、9、10共9個(gè)梯度，制成平板后接入菌餅，于28 ℃恒溫黑暗條件下培養(yǎng)。

（4）不同培養(yǎng)基條件：將菌餅分別置于PDA、PSA、CA、OMA、CMA、Richards和枸樹(shù)枝條浸汁培養(yǎng)基下，于28 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2013和SAS 8.1軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和差異顯著性分析。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 田間發(fā)病癥狀

枸樹(shù)發(fā)病初期，樹(shù)冠上的部分葉片失綠發(fā)黃，萎垂，脫落，繼而整株葉片失水萎蔫，樹(shù)冠稀疏，后期部分枝條在葉片脫落后枯死，病株生長(zhǎng)不良，重病株整株枯死。病樹(shù)下部莖干和莖基部側(cè)面長(zhǎng)出檐狀的褐色或黑褐色擔(dān)子果，內(nèi)部木質(zhì)部組織出現(xiàn)白色腐朽，有時(shí)可見(jiàn)擔(dān)子果上表面覆蓋有一層黃褐色泥層狀的擔(dān)孢子粉（圖1）。

2.2? 致病性測(cè)定

接種GSJF001菌株50 d后，枸樹(shù)苗葉片失綠發(fā)黃，萎垂，長(zhǎng)勢(shì)減弱，接種部位布滿白色菌絲（圖2A，圖2B），并長(zhǎng)出形態(tài)相同的擔(dān)子果（圖2C，圖2D），對(duì)照株傷口愈合，內(nèi)部組織正常，長(zhǎng)勢(shì)良好（圖2E）。從發(fā)病木質(zhì)部再分離獲得與GSJF001相同的菌株，表明菌株GSJF001為致病菌。將GSJF001接種至瓶裝木屑培養(yǎng)基，5個(gè)月后長(zhǎng)出的擔(dān)子果與從病樹(shù)采集到的擔(dān)子果形態(tài)特征相同（圖2F）。

2.3? 病原菌鑒定

2.3.1? 形態(tài)鑒定? 在PDA培養(yǎng)基上，GSJF001菌株的菌落呈現(xiàn)白色，菌絲為致密的絨毛狀（圖3A）。

擔(dān)子果一年到多年生，（10～12）cm×（22～24）cm，厚約3.5 cm，半圓形或扇形，有明顯的同心環(huán)棱或無(wú)，木栓質(zhì)，無(wú)柄，無(wú)漆樣光澤，正面為褐色，反面灰白色，菌肉呈現(xiàn)肉桂色（圖3B，圖3C）。新鮮孢子為南瓜子形，雙層壁，褐色或淡褐色，大小為（5.3～6.6）?m×（8.5～11.3）?m（平均6.0 ?m× 10.0 ?m），頂端無(wú)色透明，擔(dān)孢子中央有一個(gè)較大的油滴;老熟擔(dān)孢子小端平截，無(wú)色部分消失，大小為（5.2～6.6）?m×（7.3～9.0）?m（平均6.1 ?m×8.3 ?m），雙層壁明顯，顏色略深（圖3D）。纏繞菌絲淺黃褐色，多分枝，大約呈直角，直徑2～3 ?m（圖3F）;生殖菌絲透明，薄壁，直徑3～6 ?m;骨架菌絲淺褐色，具樹(shù)狀分支直徑3～5 ?m（圖3G）。

2.3.2? 分子鑒定? 測(cè)序得到GSJF001菌株的rDNA-ITS序列為629 bp（登錄號(hào)：MW193047），在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，與登錄號(hào)為MN696209.1的G. australe相似性達(dá)99.68%;rDNA-SSU序列為1000 bp（登錄號(hào)：MW227479），與登錄號(hào)為MN747807.1的G. australe相似性達(dá)99%;得到rDNA-LSU序列593 bp（登錄號(hào)：MW227480.1），BLAST比對(duì)結(jié)果與登錄號(hào)為MN689633.1的G. australe相似性達(dá)99.31%。將3種序列進(jìn)行拼接并聯(lián)合構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果表明GSJF001與G. australe聚為一類(lèi)（圖4），結(jié)合形態(tài)學(xué)分析，菌株GSJF001被鑒定為南方靈芝（Ganoderma australe）。

2.4? 不同溫度、pH、光照條件對(duì)GSJF001菌株菌落生長(zhǎng)的影響

溫度對(duì)GSJF001菌株生長(zhǎng)的影響差異明顯，溫度條件在25～32 ℃時(shí)菌株生長(zhǎng)狀態(tài)較好，在溫度28 ℃條件時(shí)生長(zhǎng)最快，40 ℃時(shí)不生長(zhǎng)。菌株GSJF001在pH為2和10時(shí)均不生長(zhǎng)，pH為6.0時(shí)最適宜菌株的生長(zhǎng)。菌株對(duì)光照條件較為敏感，在完全光照的條件下生長(zhǎng)速度最慢，在12小時(shí)光暗交替條件下由于受光照的影響其生長(zhǎng)速度也較黑暗條件下慢，在28 ℃全黑暗、pH為5的條件下最適宜GSJF001菌株生長(zhǎng)。

2.5? 不同培養(yǎng)基對(duì)GSJF001菌株菌落生長(zhǎng)的影響

GSJ001菌株在7種不同處理?xiàng)l件的培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)速度和形態(tài)特征差異明顯，在PDA和CA平板培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最快，但在CA培養(yǎng)基上菌落菌絲不如PDA上濃密，故菌株最適生長(zhǎng)培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基（表3）。

3? 討論

有關(guān)枸樹(shù)病害的研究報(bào)道主要包括細(xì)菌、真菌及病毒引起的葉部病害[4-7]，尚無(wú)枸樹(shù)莖腐病的報(bào)道。本研究對(duì)引起海南省儋州軍屯的枸樹(shù)干基腐朽病的病原菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，結(jié)果表明該病原菌為南方靈芝[Ganoderma australe （Fr.） Pat.]，這是南方靈芝引起枸樹(shù)莖腐病的首次發(fā)現(xiàn)。南方靈芝是靈芝科靈芝屬的一種擔(dān)子菌，也是一種病原木腐真菌，它可以侵染許多闊葉樹(shù)的樹(shù)干和莖基部，引起白色腐爛，在嚴(yán)重的情況下，它可以導(dǎo)致樹(shù)木死亡。南方靈芝分布較廣泛，主要分布在華中、華東和華南地區(qū)[15]。國(guó)內(nèi)外關(guān)于南方靈芝的研究較多的是南方靈芝子實(shí)體的次生代謝產(chǎn)物和生物降解方面[16-18]，胡真臻等[19]和王曉宇等[20]研究報(bào)道了由南方靈芝引起的橡膠樹(shù)和油梨莖腐病。陳禮浪等[21]通過(guò)對(duì)海南木麻黃木腐菌調(diào)查，發(fā)現(xiàn)了包括南方靈芝在內(nèi)的6種病原靈芝木腐菌，包括南方靈芝。Ayin等[22]發(fā)現(xiàn)南方靈芝是引起關(guān)島木麻黃長(zhǎng)勢(shì)下降的病原菌，但并未進(jìn)行科赫氏法則驗(yàn)證。Glen等[23]對(duì)馬占相思和其他熱帶樹(shù)木上根腐病相關(guān)的擔(dān)子果進(jìn)行形態(tài)學(xué)特征和DNA序列鑒定，發(fā)現(xiàn)了多種病原靈芝菌，其中包括南方靈芝。

本文對(duì)枸樹(shù)莖腐病病原菌的生物學(xué)特性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，該病原菌在25～32 ℃時(shí)生長(zhǎng)狀態(tài)較好，28 ℃為病原菌最適培養(yǎng)溫度，黑暗條件下最有利于病原菌的生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)的pH為6.0，在7種不同培養(yǎng)基中菌絲生長(zhǎng)狀態(tài)有所不同，在PDA、CA和PSA三種平板上生長(zhǎng)狀態(tài)較好，且在PDA平板上菌絲生長(zhǎng)狀態(tài)最好，生長(zhǎng)速度最快，菌絲最為致密，這與王曉宇等[20]對(duì)南方靈芝生物學(xué)特性的研究基本相同。本研究中南方靈芝病原菌所導(dǎo)致枸樹(shù)發(fā)生莖腐病的癥狀與先前報(bào)道的南方靈芝引起的莖腐病大致相同，發(fā)病時(shí)都表現(xiàn)為樹(shù)冠稀疏，根莖部組織部出現(xiàn)白色腐朽，多雨季節(jié)長(zhǎng)出擔(dān)子果，較為嚴(yán)重時(shí)，樹(shù)木死亡。

該病的防治應(yīng)當(dāng)以預(yù)防為主，并進(jìn)行綜合防治。清除田間雜樹(shù)樁，定期檢查，及時(shí)清溝排除積水，對(duì)風(fēng)害、寒害后受傷的樹(shù)木進(jìn)行防腐處理，防止傷口受靈芝菌的侵染，對(duì)樹(shù)木基部莖干涂刷保護(hù)劑進(jìn)行保護(hù)。一但發(fā)現(xiàn)病死樹(shù)要及時(shí)砍除病樹(shù)及挖除病根并燒毀。

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責(zé)任編輯：謝龍蓮