李 萱， 劉博文， 高雙紅， 游翔凱， 龍 思， 李尤月， 劉 茜， 張士軍， 許岳飛

(西北農(nóng)林科技大學(xué)草業(yè)與草原學(xué)院， 陜西 楊凌 712100)

近年來，隨著城市現(xiàn)代化進(jìn)程加快，高大密集的建筑物不斷增加，從而限制草坪的生長。同時(shí)，以高大的喬木和灌木為主的城市立體綠化也使得草坪遮蔭尤為嚴(yán)重，這種現(xiàn)象改變草坪生長的壞境小氣候，影響草坪所處的立地條件，對草坪草生長發(fā)育有明顯的抑制作用，影響草坪植物生長[1-2]。雖然遮蔭下的植物會通過改變株型和葉片結(jié)構(gòu)等一系列適應(yīng)機(jī)制進(jìn)行自我調(diào)節(jié)，但長期處于弱光環(huán)境下的草坪植物由于無法獲得充足的光照和能量，對高溫、踐踏等逆境脅迫抵抗性較差，易感染病蟲害或黃化[2-3]。因此，研究草坪草在弱光脅迫下形態(tài)和生理特征的變化，探究其耐蔭機(jī)制，能更好地解決草坪產(chǎn)業(yè)發(fā)展存在的瓶頸問題。

硫化氫(H2S)在常溫常壓下是一種無色有“臭雞蛋”氣味的氣體，是繼CO和NO之后生物體內(nèi)中被發(fā)現(xiàn)的第三種氣體信號分子[4]，除了在調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)等方面發(fā)揮重要作用外，適宜濃度的硫化氫處理還能夠提高植物對非生物脅迫的耐受性，減輕非生物脅迫對植物的有害影響，同時(shí)也能促進(jìn)植物種子萌發(fā)、幼苗生長和根部的發(fā)育[5-7]。如外源H2S在重金屬脅迫下能夠促進(jìn)紫花苜蓿(Medicagosativa)生長，降低重金屬進(jìn)入食物鏈的風(fēng)險(xiǎn)[8]，而且在鹽脅迫下噴施外源H2S能夠促進(jìn)紫花苜蓿種子發(fā)芽，減輕鹽脅迫對紫花苜蓿的損傷[9]，甚至在干旱脅迫下外源H2S能夠同NO形成新供體化合物從而增強(qiáng)紫花苜蓿對干旱的適應(yīng)性[10]。然而關(guān)于H2S是如何影響不同遮蔭下高羊茅(FestucaarundinacesSchreb.)形態(tài)和生理的研究尚未見報(bào)道。

高羊茅是禾本科羊茅屬的一種多年生冷季型優(yōu)質(zhì)牧草或草坪草，其須根發(fā)達(dá)，適應(yīng)性廣，具有較好的耐寒、耐踐踏性，抗病性強(qiáng)，與雜草競爭力強(qiáng)[12]。然而，遮蔭限制了高羊茅優(yōu)良品種的推廣和應(yīng)用?；诖耍狙芯恳圆煌豕饷{迫下的高羊茅作為研究對象，通過施加外源H2S，研究H2S對弱光脅迫下高羊茅植株的形態(tài)指標(biāo)、光合色素含量、細(xì)胞膜穩(wěn)定性和內(nèi)源激素與內(nèi)源H2S含量的影響，探究H2S對高羊茅細(xì)胞膜穩(wěn)定性與生長的調(diào)控，為優(yōu)質(zhì)耐蔭草坪草分子育種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)計(jì)

高羊茅‘Arid3’(FestucaarundinaceaSchreb.‘Arid3’)，由北京克勞沃草業(yè)技術(shù)開發(fā)中心提供。種子用1.0%次氯酸鈉溶液對種子進(jìn)行消毒5 min，再用蒸餾水反復(fù)沖洗干凈后置于裝有石英砂的黑色塑料盆中萌發(fā)，每盆6株，前期培養(yǎng)條件為：16 h光期/8 h暗期；光照強(qiáng)度100 μmol·m-2·s-1；相對濕度75%；溫度25℃。培養(yǎng)35 d后對植株進(jìn)行弱光和外源H2S供體硫氫化鈉(NaHS：500 μM)處理，詳細(xì)處理如表1，其余培養(yǎng)條件均不變。每處理3個(gè)重復(fù)，7 d后測定高羊茅植株的形態(tài)和生理指標(biāo)。

表1 外源H2S對不同弱光脅迫下高羊茅幼苗處理情況Table 1 Effects of exogenous H2S on tall fescue under different low light stress

1.2 測定項(xiàng)目及方法

每個(gè)處理選取高度和長勢適中的植株，測量株高、葉寬和分蘗數(shù)[13]；每個(gè)處理選取完整的植株，分別取每株植物的地上和地下部分，于105℃殺青30 min，70℃下烘干至恒重后測定其干重，其對應(yīng)比值為根莖比[11]；葉綠素含量的測定采用乙醇提取法[14]；丙二醛含量的測定采用硫代巴比妥酸法[14]；膜透性采用電導(dǎo)法測定[15]；內(nèi)源激素脫落酸(Abscisic acid，ABA)和赤霉素(Gibberellin，GA)含量測定采用酶聯(lián)免疫法[16]，內(nèi)源硫化氫含量采用亞甲基藍(lán)法測定[17]。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過Excel 2016對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，采用One-way ANOVA進(jìn)行單因素方差分析，在P值為0.05的差異顯著水平下進(jìn)行檢測，如果差異顯著，用Duncan’s新復(fù)極差法對平均值進(jìn)行多重比較，采用SigmaPlot 12.5繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源H2S對不同弱光脅迫下高羊茅形態(tài)的影響

弱光處理能夠減少高羊茅分蘗，降低植株高度和葉片寬度，且僅對株高作用達(dá)到顯著差異水平(P<0.05)。外源H2S處理能夠增加LS和MS脅迫下高羊茅的株高、分蘗和葉寬，降低CK處理下高羊茅的分蘗和HS處理下的葉寬和株高。由表2可知，與LS，MS和HS相比，高羊茅的株高在LS+和MS+處理下增加12.02%和37.00%，而在HS+處理中下降16.72%；分蘗數(shù)在LS+，MS+和HS+處理下分別增加了71.43%，14.29%和16.67%；葉寬在LS+，MS+處理下增加了9.51%和3.85%，而在HS+處理中下降15.87%。由此可知，外源H2S能夠緩解LS和MS處理下弱光脅迫對高羊茅株高、分蘗和葉寬的影響，而對HS無明顯作用。

表2 外源H2S對不同弱光脅迫下高羊茅幼苗形態(tài)和生物量的影響Table 2 Effects of exogenous H2S on morphological characteristics and biomass of tall fescue under different low light stress

2.2 外源H2S對不同弱光脅迫下高羊茅生物量的影響

隨著光照強(qiáng)度的減小，高羊茅幼苗地上生物量和地下生物量也隨之減少(表2)。與LS，MS和HS相比，施加外源H2S能夠提高LS+，MS+和HS+處理下的地上生物量，分別提高33.04%，99.51%和45.94%；同時(shí)，外源H2S也能夠提高CK，LS和MS處理下的地下生物量，分別提高3.62%，8.70%和11.42%，而對HS處理下無明顯作用；高羊茅的根莖比隨著光照強(qiáng)度的降低呈現(xiàn)升高趨勢，而噴施外源H2S的會減小LS，MS和HS處理下的根莖比。由此看出，外源H2S的施加使高羊茅幼苗的生物量在LS和MS處理下均有增加，在HS處理下效果不明顯。

2.3 外源H2S對不同弱光脅迫下高羊茅光合色素的影響

隨著光照強(qiáng)度的減弱，高羊茅光合色素含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，與不加外源H2S處理相比，葉綠素a，b和葉綠素總含量在CK+，LS+和HS+處理下均增加，而在MS+處理下含量下降。相反，類胡蘿卜素含量在LS和MS處理下施加外源H2S時(shí)下降，分別降低了1.78%和8.19%。隨著遮蔭程度的增強(qiáng)，高羊茅對弱光逆境表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗性(圖1)。

2.4 外源H2S對不同弱光脅迫下高羊茅細(xì)胞膜透性的影響

植物細(xì)胞的相對電導(dǎo)率的大小和丙二醛含量可以反映植物細(xì)胞膜受傷害的程度。高羊茅葉片中的電解質(zhì)滲透率和丙二醛含量隨著光強(qiáng)減弱顯著增大(圖2)，且外源H2S處理降低了高羊茅細(xì)胞膜相對電導(dǎo)率和丙二醛含量(P<0.05)，與不加外源H2S處理相比，相對電導(dǎo)率在CK+，LS+，MS+和HS+分別降低了16.47%，28.42%，0.91%和15.52%，丙二醛含量分別降低了8.01%，11.40%，11.24%和8.99%。說明弱光導(dǎo)致高羊茅葉片細(xì)胞膜過氧化，生物膜結(jié)構(gòu)遭到破壞，而外源H2S能夠降低由弱光脅迫引起的細(xì)胞膜過氧化傷害。

2.5 外源H2S對不同弱光脅迫下高羊茅激素含量的影響

弱光脅迫能夠顯著增加高羊茅內(nèi)源ABA和H2S含量，降低GA含量。同時(shí)，外源性H2S與弱光脅迫的交互作用對高羊茅體內(nèi)內(nèi)源激素含量的變化具有極顯著作用(P<0.01)。與不加外源H2S處理相比，高羊茅體內(nèi)ABA含量在LS+和MS+處理下增加64.71%和3.48%，而內(nèi)源H2S含量則在CK+，LS+和MS+光照脅迫下分別增加了35.31%，0.24%和22.27%，GA含量在CK+，MS+和HS+處理下增加7.20%，12.90%和11.05%。結(jié)果表明弱光脅迫下，施加外源H2S能夠促進(jìn)GA和內(nèi)源H2S的合成，對ABA的合成呈現(xiàn)先促進(jìn)后抑制的現(xiàn)象(圖3)。

圖1 外源H2S對不同弱光脅迫下高羊茅光合色素的影響Fig.1 Effects of exogenous H2S on chlorophyll concentration of tall fescue under different low light stress

圖2 外源H2S對不同弱光脅迫下高羊茅細(xì)胞膜透性的影響Fig.2 Effects of exogenous H2S on cell membrane permeability of tall fescue under different low light stress

圖3 外源H2S對弱光脅迫下高羊茅內(nèi)源激素的影響Fig.3 Effect of exogenous H2S on the endogenous hormone content of tall fescue under different low light stress

3 討論

光作為環(huán)境因素影響著植物的各個(gè)方面，前期研究結(jié)果表明光照強(qiáng)度下降會導(dǎo)致草坪草的形態(tài)特征、生物量和生理生化發(fā)生明顯改變[18-21]。隨著遮蔭強(qiáng)度不斷增加，一些草坪草不能正常生長，甚至死亡[20]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，遮蔭條件下高羊茅的分蘗減少，株高、葉寬、地上生物量和地下生物量均下降，這與前期的研究結(jié)果一致[22]。外源H2S作為一種氣體信號分子，可以減小弱光脅迫對植株造成的傷害，施加外源H2S能夠減少LS和MS遮蔭強(qiáng)度下的高羊茅幼苗分蘗、株高和葉寬的降低，但對HS處理無明顯緩解作用，可能是重度遮蔭已經(jīng)超過外源H2S的調(diào)節(jié)范圍。

葉綠素在光合作用中負(fù)責(zé)吸收和傳遞光量子，而類胡蘿卜素起保護(hù)葉綠素、延緩葉綠素快速分解等作用，是大多數(shù)植物的重要光合色素[23]。本試驗(yàn)表明，適度弱光脅迫能夠增加高羊茅葉綠素a和葉綠素b的含量，同時(shí)噴施外源硫化氫能夠提高對LS和HS遮蔭脅迫下高羊茅葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素的含量，而在MS遮蔭強(qiáng)度下高羊茅幼苗葉綠素含量合成受到抑制，這與前人研究結(jié)果一致[35-36]，噴施外源硫化氫能夠減少弱光脅迫對高羊茅植株光合系統(tǒng)的傷害，促進(jìn)高羊茅葉片對光能的吸收和利用。以上研究結(jié)果表明，在一定遮蔭強(qiáng)度下，高羊茅對弱光脅迫表現(xiàn)出抗性，這與前人研究結(jié)果相似[24]?？赡茉蚴鞘┘油庠碒2S能夠保護(hù)葉綠體結(jié)構(gòu)的完整性，有助于維持高羊茅葉片較高的葉綠素含量，促進(jìn)遮蔭脅迫下高羊茅葉片保持較高的光合速率[25]，且葉綠素b含量提高有利于高羊茅葉片捕光能力的增強(qiáng)，吸收更多光能[26]。

MDA是植物細(xì)胞發(fā)生膜脂過氧化的主要產(chǎn)物，通常利用MDA含量來衡量細(xì)胞膜發(fā)生膜脂過氧化的程度和植物對外界脅迫應(yīng)答的強(qiáng)弱[27]。弱光脅迫導(dǎo)致抗氧化系統(tǒng)酶的活性降低，活性氧大量積累，導(dǎo)致細(xì)胞膜完整性受到破壞，細(xì)胞膜透性增加。本試驗(yàn)中，弱光脅迫導(dǎo)致高羊茅葉片的相對電導(dǎo)率和MDA含量顯著增加，而外源H2S處理能夠顯著緩解弱光處理所導(dǎo)致的這種變化，降低相對電導(dǎo)率，抑制MDA的合成，這與前人研究結(jié)果相似[37]。由此說明，外源H2S對弱光脅迫下的高羊茅細(xì)胞膜具有一定的保護(hù)作用。

植物內(nèi)源激素對植物的生長發(fā)育起著重要作用，植物生理生化活動(dòng)受多種植物激素綜合作用[28]，且不同種類的植物激素有相互促進(jìn)或者拮抗的效果。在非生物脅迫反應(yīng)中，H2S與脫落酸、乙烯、赤霉素等不同植物激素的相互作用起著重要的作用[29]。前期研究報(bào)道，遮蔭環(huán)境能夠降低植物體內(nèi)GA的含量，提高ABA的含量[30]。本試驗(yàn)表明，不同弱光脅迫處理抑制了GA的合成，而促進(jìn)了ABA和內(nèi)源性H2S的合成，這與遮蔭脅迫下油用牡丹(PaeoniaSect.MoutanDC.)研究結(jié)果一致[31]。施加外源H2S后，隨著光照強(qiáng)度的減弱，外源H2S對ABA的作用由促進(jìn)轉(zhuǎn)為抑制，可能同響應(yīng)干旱脅迫效應(yīng)一樣，ABA受體編碼基因的表達(dá)受外源H2S的調(diào)節(jié)而變化[32]，顯著提高ABA含量，從而增強(qiáng)高羊茅耐蔭性。同時(shí)，在一定程度弱光脅迫下施加外源H2S促進(jìn)了GA的合成，這可能與硼脅迫下番茄(SolanumlycopersicumL.)在GA和H2S兩種激素共同調(diào)節(jié)下提高其抗性的研究相似[33]；本研究中噴施外源H2S后高羊茅內(nèi)源H2S含量增加，這與在玉米(ZeamaysL.)幼苗的研究中施加外源H2S后內(nèi)源H2S含量增加的結(jié)果相符合[34]，這可能與植物體內(nèi)激素系統(tǒng)平衡調(diào)節(jié)和響應(yīng)機(jī)制有關(guān)。近些年，關(guān)于外源性H2S在冷脅迫、熱脅迫、重金屬脅迫等的研究較多，但關(guān)于遮蔭脅迫下，H2S與ABA等激素在植物中的信號作用關(guān)系鮮有報(bào)道，深入探究H2S在調(diào)節(jié)激素相關(guān)信號通路中的作用，對進(jìn)一步深入了解植物代謝的激素調(diào)節(jié)意義深遠(yuǎn)。

4 結(jié)論

外源H2S在光照強(qiáng)度為50 μmol·m-2·s-1和75 μmol·m-2·s-1條件下能提高高羊茅株高、分蘗和葉寬，增加生物量，降低細(xì)胞膜透性，減少膜質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的積累，提高ABA含量，從而緩解由弱光脅迫引起的傷害，提高了高羊茅的耐蔭性。因此，H2S可能作為一個(gè)信號分子在適度的弱光脅迫下能提高高羊茅的耐蔭性，研究結(jié)果對耐蔭高羊茅新品種選育提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)也對遮蔭下高羊茅草坪管理提供指導(dǎo)意義。