胡紅巖，張職顯，盧珍華，任相亮，馬小艷，馬亞杰，宋賢鵬，馬 艷

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 棉花研究所，棉花生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 安陽 455000)

草蛉為昆蟲綱(Insecta)脈翅目(Neuroptera)草蛉科(Chrysopidae)昆蟲，能捕食蚜蟲、葉螨和粉虱以及鱗翅目卵和幼蟲等多種農(nóng)林害蟲，是生物防治上重要的天敵類群。草蛉資源豐富，種類繁多，在世界范圍內(nèi)廣泛分布，據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前全世界已知草蛉種類約1 415種[1]。草蛉科分為網(wǎng)蛉亞科(Apochrysinae)、幻草蛉亞科(Nothochrysinae)和草蛉亞科(Chrysopinae)，其中草蛉亞科是最大的亞科，大部分的草蛉隸屬于該亞科。由于存在地理亞種和生態(tài)型復(fù)雜等問題，部分草蛉在形態(tài)學(xué)上極為相似，難以鑒定，分類位置變動頻繁，使得草蛉科的分類及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系變得較為復(fù)雜[2]。目前，草蛉科部分屬種的命名及分類地位仍存在分歧，僅依賴外部形態(tài)特征進(jìn)行草蛉物種鑒定存在一定的困難[3]。傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類能在較高級的分類階元內(nèi)確定物種的分類地位，但在較低級的分類階元中，有時則難以確定物種的分類。分子生物學(xué)在昆蟲分類中的應(yīng)用和發(fā)展，為解決草蛉屬種的鑒定問題提供了新思路。細(xì)胞色素氧化酶亞基I基因(COI)是動物線粒體DNA(mtDNA)中最保守的編碼蛋白基因，其結(jié)構(gòu)相對保守，同屬物種的COI基因序列片段又存在足夠的變異，可用于區(qū)分親緣關(guān)系很近的物種[4]。因此，基于COI基因片段的DNA條形碼技術(shù)被廣泛應(yīng)用于物種鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化研究[5-8]。

國內(nèi)外已有關(guān)于草蛉線粒體基因序列的研究。如WINTERTON等[9]利用16S rRNA和COI基因序列片段分析了33種草蛉的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。HARUYAMA等[10]通過COI基因片段序列分析和系統(tǒng)發(fā)育構(gòu)建，探討日本通草蛉(Chrysoperla nipponensis) A型和B型隱種與德國普通草蛉(C.carnea)的分子標(biāo)記方法，并對日本通草蛉A型隱種的起源進(jìn)行分析。PALOMARES-PéREZ等[11]利用COI、COII、ND2和ND5分子標(biāo)記方法，對墨西哥普通草蛉(C.carnea)的9個地理種群進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。目前，國內(nèi)對草蛉科的研究主要集中在形態(tài)學(xué)的分類鑒定及生物防治等方面，而對草蛉的分子生物學(xué)及重要基因序列研究較少。聶瑞娥等[12]構(gòu)建了日本通草蛉的cDNA文庫，并基于16S rRNA序列對草蛉科7種昆蟲的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行分析。部分研究者對草蛉線粒體基因組進(jìn)行測序和注釋，并依據(jù)基因組數(shù)據(jù)對草蛉亞科不同種進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析[13-14]。YI等[3]利用線粒體COI基因片段對北京地區(qū)49種草蛉進(jìn)行條形碼分析，對草蛉科的18個種進(jìn)行分子鑒定，發(fā)現(xiàn)其中的2個隱存種，認(rèn)為基于COI基因的DNA條形碼技術(shù)在草蛉分子鑒定方面具有很好的應(yīng)用前景。

本研究以中國華北棉區(qū)3種常見草蛉的4個不同地理種群為研究對象，對其線粒體COI基因片段進(jìn)行測序，統(tǒng)計(jì)分析不同序列的堿基組成及變異位點(diǎn)信息，并從GeneBank中下載其余9種草蛉昆蟲的11條COI基因序列片段，構(gòu)建草蛉的系統(tǒng)發(fā)育樹，分析不同草蛉的親緣關(guān)系，探討DNA條形碼技術(shù)在草蛉物種鑒定中應(yīng)用的可能性，為草蛉分類、資源保護(hù)及應(yīng)用研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試草蛉于2019年6—7月分別在山西運(yùn)城、河北邱縣、河南鹿邑和河南安陽等地棉田采集，標(biāo)本采集信息見表1。室內(nèi)采用形態(tài)學(xué)分類方法鑒定為中華通草蛉(Chrysoperla sinica)、麗草蛉(Chrysopa formosa)和大草蛉(Chrysopa pal-

表1 3種草蛉的采集信息Tab.1 The sampling information of three green lacewing species

lens)，試驗(yàn)用蟲均為成蟲，采集后的昆蟲浸泡于95%酒精中，保存于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所植保室，在-20 ℃冰箱中低溫保存?zhèn)溆?。從Gen-Bank基因庫中下載9種草蛉昆蟲共11條COI基因序列用于序列的對比分析，詳細(xì)信息見表2。

表2 NCBI下載的9種草蛉線粒體COI基因片段信息Tab.2 The information of mitochondrial COI gene sequence of nine green lacewing species downloaded from NCBI

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料預(yù)處理

參考張德華等[15]的方法，將保存的標(biāo)本用0.9%的生理鹽水浸泡24 h，隨后用蒸餾水沖洗干凈，放在干凈的濾紙上待用。

1.2.2 基因組DNA提取

挑取單頭草蛉成蟲置于1.5 mL離心管中，根據(jù)上海生工生物工程股份有限公司Ezup動物組織基因組DNA抽提試劑盒說明書的操作步驟提取草蛉DNA模板，DNA樣品于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 mtDNA-COI基因擴(kuò)增與檢測

對3種草蛉總DNA中的線粒體細(xì)胞色素氧化酶(mtDNA-COI)基因進(jìn)行PCR檢測。所用引物為通用引物COIL1490：5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTG-3′和COIH2198：5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′[16]。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL，包括10×PCR Buffer 2.5 μL、dNTPs混合液2.5 μL、5 U/μL的Taq聚合酶0.2 μL、10 μmol/L的上下游引物各1 μL和DNA模板1 μL和ddH2O 16.8 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL mtDNA-COI基因擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。選取目標(biāo)條帶清晰的樣品委托上海生工生物工程股份有限公司對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙向測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用DNAMAN軟件查看序列質(zhì)量。對所測的3種草蛉COI基因序列分別進(jìn)行比對和拼接。拼接結(jié)果在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST檢索，與GeneBank基因庫中同源序列對比，將獲得的草蛉COI基因序列提交至GeneBank數(shù)據(jù)庫，獲得GeneBank登錄號。在GeneBank數(shù)據(jù)庫中下載11條草蛉的COI基因序列(表2)，采用MEGA 7.0軟件分析23條序列的堿基組成、位點(diǎn)信息、堿基轉(zhuǎn)換與顛換值及其比值(R)等。以褐蛉科的花斑脈褐蛉(Micromus variegatus)和角紋脈褐蛉(M.angulatus)為外群，基于Kimura 2-parameter遺傳距離模型分析不同草蛉的遺傳距離。采用最大似然法(ML)和鄰接法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，采用的模型分別為GTR+I和p-distance模型。自展檢驗(yàn)(bootstrap test)評估所建系統(tǒng)樹的可靠性，重復(fù)1 000次評估各分支的置信值。

2 結(jié)果與分析

2.1 COI基因序列組成與變異

對4個地理種群的3種草蛉COI基因序列測序后去除上下游引物，得到658 bp的COI基因片段。經(jīng)過比對分析發(fā)現(xiàn)：同種草蛉同一地理種群個體間COI基因片段序列沒有差異。因此，將獲得的4個地理種群的3種草蛉的12條草蛉COI基因序列提交至GeneBank數(shù)據(jù)庫，獲得GeneBank登錄號(表1)。12條序列與NCBI上下載的9種草蛉序列進(jìn)行對比分析，去掉前面1個堿基得到657 bp的有效長度。片段中未發(fā)現(xiàn)堿基插入或缺失，其中保守位點(diǎn)469個，變異信息位點(diǎn)188個，簡約信息位點(diǎn)150個，自裔位點(diǎn)38個。序列結(jié)構(gòu)中A、T、G和C的含量分別為28.6%、41.1%、15.4%和14.9%，A+T平均含量為69.7%，G+C平均含量為30.3%，呈現(xiàn)出明顯的A+T堿基偏好。NCBI數(shù)據(jù)庫中擬果蠅(Drosophia simulans) (JF872266.1、JF872338.1和JF-872410.1)線粒體COI基因片段序列的A+T平均含量為67.2%，G+C平均含量為32.8%，黑腹果蠅(D.melanogaster) (JF871600.1、KT117503.1和JF868423.1)線粒體COI基因片段序列的A+T平均含量為69.3%，G+C平均含量為30.7%。3種草蛉與擬果蠅和黑腹果蠅及其他昆蟲的線粒體基因特征[13-14]類似。同種草蛉同一地理種群個體間堿基沒有差異，不同地理種群之間堿基差異很小。其中，中華通草蛉4個地理種群間有3個變異位點(diǎn)，與同屬的普通草蛉間有7個變異位點(diǎn)；麗草蛉4個地理種群間有1個變異位點(diǎn)，與同屬的葉色草蛉間有60個變異位點(diǎn)；大草蛉4個地理種群間有1個變異位點(diǎn)，與同屬的黑腹草蛉間有62個變異位點(diǎn)。表明草蛉COI基因序列比較保守，種內(nèi)變異位點(diǎn)數(shù)小于種間。

2.2 堿基替換

由12種草蛉 COI 基因序列的轉(zhuǎn)換數(shù)和顛換數(shù)以及位點(diǎn)變異速率 (表3) 可知：核苷酸的轉(zhuǎn)換位點(diǎn)為25，顛換位點(diǎn)為40，R為0.6，轉(zhuǎn)換主要發(fā)生在A和T之間，顛換主要發(fā)生在G和C之間。其中，第1位點(diǎn)替換數(shù)為8，R為7.4；第2位點(diǎn)替換數(shù)為1，R為2.7；第3位點(diǎn)替換數(shù)為56，R值為0.4。可見，堿基替換主要發(fā)生在第3位點(diǎn)，其次為第1位點(diǎn)，第2位點(diǎn)的堿基在基因序列中相對比較保守。

表3 12種草蛉COI基因的核苷酸堿基替換值Tab.3 The nucleotide base substitution value of COI gene in 12 lacewing species

2.3 遺傳距離分析

由表4可知：同物種間的遺傳距離介于0～0.005，其中，中華通草蛉4個地理種群的種內(nèi)遺傳距離介于0～0.005，麗草蛉4個地理種群的種內(nèi)遺傳距離介于0～0.002，大草蛉不同地理種群的種內(nèi)遺傳距離也介于0～0.002，黑腹草蛉2個地理種群的種內(nèi)遺傳距離介于0～0.002，普通草蛉2個地理種群的種內(nèi)遺傳距離為0。不同種間的遺傳距離介于0.022～0.184，其中，外群角紋脈褐蛉與草蛉亞科的中華通草蛉和普通草蛉的遺傳距離最大(0.184)，普通草蛉和中華通草蛉的遺傳距離最小(0.022)。遺傳距離分析結(jié)果表明：草蛉COI基因序列相對保守，種內(nèi)遺傳距離小于種間。

表4 基于COI基因的Kimura 2-parameter模型的12種草蛉種群遺傳距離Tab.4 The genetic distance among 12 lacewing species populations based on Kimura 2-parameter model of COI gene

2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

以褐蛉科的花斑脈褐蛉(M.variegatus)和角紋脈褐蛉(M.angulatus)為外群，分別構(gòu)建ML樹和NJ樹，所顯示的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)相同，僅在各分支的置信度上略有差異。由圖1可知：2個外群位于樹的基部位置，與草蛉亞科的其他種類分開，說明花斑脈褐蛉和角紋脈褐蛉親緣關(guān)系較近且較為原始，這與形態(tài)學(xué)分類一致。同一物種以較高的置信度聚為一小支，如大草蛉的4條序列以100%的置信度聚在一起，黑腹草蛉的2條序列聚為一支，麗草蛉的4條序列聚為一支，且分支自展值均為100%。近緣種以較高的置信度聚在一起，如普通草蛉2條序列和中華通草蛉4條序列聚在一起，分支自展值為100%。同屬的不同種類聚在一起，如大草蛉、黑腹草蛉、葉色草蛉和麗草蛉，這與形態(tài)學(xué)分類相一致。

圖1 基于COI基因序列的最大似然法(ML)/鄰接法(NJ)系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Maximum likelihood (ML)/neighbor-joining (NJ) tree based on the analysis of COI gene sequence

3 討論

中國草蛉資源豐富，草蛉的分類及鑒定對天敵資源保護(hù)及優(yōu)勢草蛉天敵物種的開發(fā)和利用具有重要意義[17]。長期以來草蛉主要依賴傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)的方法進(jìn)行鑒定，分類方法的局限性使一些形態(tài)特征相似或相近的種鑒定比較困難，關(guān)于草蛉科的區(qū)系研究及分類目前仍存在很多爭議[2,18-19]。本研究運(yùn)用DNA條形碼技術(shù)，對草蛉亞科部分昆蟲進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，進(jìn)而從分子水平上明確不同草蛉的分類地位。運(yùn)用無脊椎動物線粒體COI基因序列通用引物，對棉田常見的3種草蛉COI基因進(jìn)行擴(kuò)增和測序，序列拼接后在基因庫中進(jìn)行BLAST搜索。結(jié)果顯示：中華通草蛉、大草蛉和麗草蛉COI基因序列與NCBI上登錄的草蛉類線粒體COI基因序列同源性在95%以上，說明所測序列準(zhǔn)確性強(qiáng)、可信度高。COI基因序列相對保守，同種草蛉不同地理種群之間序列差異很小。與NCBI下載的其他草蛉序列比較分析發(fā)現(xiàn)：核苷酸在第3位點(diǎn)替換數(shù)為56，遠(yuǎn)大于第1位點(diǎn)和第2位點(diǎn)的替換數(shù)。轉(zhuǎn)換和顛換的比值R可以用于評估序列的飽和度，R值越低物種的分歧時間越長，進(jìn)化速率越快[20]。密碼子位點(diǎn)分析表明：第3位點(diǎn)的R值僅為0.4，低于第1位點(diǎn)和第2位點(diǎn)?？梢?，第3位點(diǎn)的進(jìn)化速率最快。COI基因結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，很少有插入和缺失基因，密碼子第3位點(diǎn)堿基能夠自由變異，用以區(qū)分近緣物種，因此，線粒體COI基因被廣泛應(yīng)用于物種區(qū)分[21-23]。

在DNA條形碼分析中，種內(nèi)、種間遺傳距離間的差異程度是物種鑒定的判斷標(biāo)準(zhǔn)之一。HEBERT等[24]對動物線粒體COI基因條形碼進(jìn)行了大量研究，認(rèn)為98%的物種種內(nèi)遺傳距離小于0.02，種間平均遺傳距離差異為11.3%。本研究結(jié)果表明：地理來源對同種草蛉COI基因片段序列的影響不大，草蛉種內(nèi)平均遺傳距離為0.001，明顯低于遺傳距離為0.02的閾值，種間的平均遺傳距離為0.116，種間遺傳距離是種內(nèi)遺傳距離的116倍，種內(nèi)遺傳距離明顯小于種間，符合DNA條形碼鑒定物種的標(biāo)準(zhǔn)，表明COI基因序列適用于草蛉的分類鑒定。

基于COI基因的草蛉ML/NJ系統(tǒng)發(fā)育樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)：來自不同地理來源的同種草蛉物種聚為同一小支，如大草蛉和麗草蛉等，且分支自展值均為100%；草蛉物種間的近緣種聚集在一起，如普通草蛉、中華通草蛉和紅通草蛉(分支自展值≥82%)；親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的物種間差異表現(xiàn)較為明顯，如白線草蛉和黃瑪草蛉等。遺傳距離和系統(tǒng)進(jìn)化樹綜合分析結(jié)果表明：同一屬內(nèi)不同種間的遺傳距離較小，親緣關(guān)系較近；不同屬間的遺傳距離較大，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；外群褐蛉科與草蛉科的10個種之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，遺傳距離也較大，與草蛉形態(tài)學(xué)分類結(jié)果基本一致。

4 結(jié)論

草蛉線粒體COI基因序列能夠區(qū)分不同物種，證實(shí)基于COI基因的DNA條形碼技術(shù)可以作為草蛉物種鑒定的輔助工具。研究結(jié)果為草蛉科昆蟲DNA條形碼數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建提供了理論依據(jù)。