謝佳偉，彭小祠，陳小巧，譚明華，劉彥中，郝 冰

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙草學(xué)院，云南 昆明 650201)

植物內(nèi)生菌是影響植物生長的重要生物因素之一，內(nèi)生菌通過自身的生命活動(dòng)，依靠自身功能及產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)植物體產(chǎn)生直接或間接的影響，包括促進(jìn)共生植物的生長發(fā)育、直接干預(yù)植物防御系統(tǒng)和激素調(diào)控等作用[1-2]。目前對(duì)于煙草內(nèi)生菌促生作用的研究主要集中于內(nèi)生細(xì)菌，如梭狀芽孢桿菌(Clostridiumsp.)含有大量固氮酶，可為煙草提供無機(jī)氮源，進(jìn)而提高煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)[3]；煙草內(nèi)生促生細(xì)菌wy2和解淀粉芽孢桿菌 YN201448能夠促進(jìn)煙草種子萌發(fā)、幼苗莖粗和根系生長[4-5]，但對(duì)于煙草內(nèi)生真菌促生效果的研究較少。

有關(guān)植物內(nèi)生真菌促生作用的研究主要集中于糧食作物。已有研究表明：從野生大豆分離的內(nèi)生真菌Y6R15可抗大豆疫霉病和玉米大斑病，且對(duì)玉米和大豆均有促生作用[6]；從禾草根部分離的內(nèi)生真菌LC-R-311能顯著提高玉米幼苗的多項(xiàng)生理指標(biāo)、葉綠素含量和SOD酶活性，顯著降低ABA含量[7]；稻鐮狀瓶霉可顯著提高水稻的多項(xiàng)農(nóng)藝性狀指標(biāo)，提高光合強(qiáng)度[8]；深色有隔內(nèi)生真菌對(duì)甘蔗的生物量和株高等有促進(jìn)作用[9]。本研究對(duì)云南烤煙主栽品種云煙87的內(nèi)生真菌進(jìn)行分離鑒定，篩選具有顯著促進(jìn)云煙87、云煙97、K326和紅花大金元煙苗生長功能的菌株，將促進(jìn)煙草不同部位生長的菌株根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)需要運(yùn)用于煙草生長的不同時(shí)期，為功能內(nèi)生真菌的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

內(nèi)生真菌分離所用3株長勢一致的成熟健康云煙87煙株于2019年7月21日采自昆明尋甸(N25.518°，E103.278°，海拔1 865 m)；內(nèi)生真菌發(fā)酵液促煙苗生長試驗(yàn)所用煙苗培養(yǎng)于云南昆明西南生物多樣性實(shí)驗(yàn)室。

1.2 培養(yǎng)基

內(nèi)生真菌分離培養(yǎng)基采用含10 mg/L硫酸鏈霉素的PDA固體培養(yǎng)基；內(nèi)生真菌發(fā)酵液促煙苗生長試驗(yàn)采用含10 mg/L硫酸鏈霉素的PDA液體培養(yǎng)基。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 云煙87內(nèi)生真菌的分離純化

參考王利娟等[10]植物內(nèi)生真菌的分離培養(yǎng)方法，將采回的云煙87植株截取上部葉、中部葉、下部葉、莖、主根和須根等6個(gè)部位的健康組織，分別用無菌水沖洗，除去表面泥土，并用濾紙吸干表面水分。組織表面消毒步驟為：(1) 葉部：75%酒精浸泡30 s→0.1%升汞浸泡15 s→無菌水沖洗3次；(2) 莖部：75%酒精浸泡30 s→除去表皮保留皮層及中柱；(3) 根部：75%酒精浸泡60 s→0.1%升汞浸泡20 s→無菌水沖洗3次，將最后1次沖洗后的無菌水劃線于PDA平板之上，作為對(duì)照，以檢驗(yàn)樣品的消毒是否徹底。接種分離步驟為：將煙葉部分置于研缽中加入無菌水研磨，將研磨液和殘?jiān)鶆虻劁伔旁谂囵B(yǎng)基表面；將煙莖部分用接種刀切成5～8 mm小塊，鋪放在培養(yǎng)基表面；將粗根部分用接種刀切成3～5 mm小段，切面朝下鋪放在培養(yǎng)基表面；將須根部分于研缽中加入無菌水研磨，將研磨液和殘?jiān)鶆虻劁伔旁谂囵B(yǎng)基表面。

全部材料置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d，觀察菌落生長狀況。將培養(yǎng)分離出的不同種類的內(nèi)生真菌接入PDA培養(yǎng)基進(jìn)行純化，2～3次點(diǎn)接純化直到菌落單一。由于不同真菌的繁殖速度不同，可以優(yōu)先分離純化生長較快的菌株，生長較慢的待其穩(wěn)定后再進(jìn)行分離純化。

1.3.2 云煙87內(nèi)生真菌的鑒定

參照CTBA 法[11]提取真菌基因組DNA。ITS擴(kuò)增使用的通用引物為ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′) 和 ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)，由昆明擎科生物科技有限公司合成，使用的PCR試劑盒為T5 Direct PCR Kit(Plant)，由昆明擎科生物科技有限公司生產(chǎn)。PCR 反應(yīng)體系為：25 μL T5酶，2 μL ITS4，2 μL ITS5，1 μL DNA 模板，用 ddH2O 補(bǔ)足至50 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?8 ℃ 3 min，98 ℃ 10 s，54 ℃10 s，72 ℃ 10 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 5 min，4 ℃保存。對(duì)瓊脂糖凝膠電泳分析后的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，測序結(jié)果通過BLAST比對(duì)鑒定菌種所屬種類，并參考文獻(xiàn)[12]，結(jié)合內(nèi)生真菌的菌落特征和顯微形態(tài)特征確定所屬菌種。在GenBank核苷酸數(shù)據(jù)庫中挑選出同源性較為相近的真菌DNA序列，再通過軟件MEGA 4.0按鄰接法(neighbor-joining)構(gòu)建所有種屬以及促生菌株的內(nèi)生真菌的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3 云煙87內(nèi)生真菌的液體發(fā)酵

將分離純化的全部內(nèi)生真菌菌株各取大小約1.5 cm2的菌塊接入100 mL液體PDA培養(yǎng)基中，裝入250 mL錐形瓶內(nèi)，瓶口封膜，于搖床振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度30 ℃，轉(zhuǎn)速220 r/min，培養(yǎng)48～72 h，備用。

1.3.4 云煙87內(nèi)生促生菌株的篩選

前期在適宜條件下培育煙苗，育苗盤規(guī)格為12 cm×16 cm，12孔穴，每盤每列從左到右分別種植云煙97、云煙87、K326和紅花大金元，每穴播種3顆煙草種子，待煙苗生長到5～6片真葉時(shí)，挑選長勢一致的煙苗進(jìn)行促生試驗(yàn)，每穴保留1株煙苗。每穴取3 mL內(nèi)生真菌發(fā)酵液搖晃均勻，對(duì)煙苗的地上部分和根部土壤進(jìn)行澆施處理；澆菌后，育苗盤上部蓋上透明隔離罩，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。另設(shè)置對(duì)照煙苗，正常培養(yǎng)，不澆施菌液。待煙苗生長到7片真葉時(shí)，統(tǒng)計(jì)煙苗的鮮質(zhì)量、根鮮質(zhì)量、地上部鮮質(zhì)量、株高、最大葉長、最大葉寬和根長共7個(gè)指標(biāo)的數(shù)據(jù)，挑選促生效果顯著的菌株。按照增長率公式計(jì)算各個(gè)指標(biāo)的增長率(3次重復(fù)試驗(yàn)的均值)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 2010、SPSS 23.0、MEGA 4.0和Origin 2018軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與作圖分析，顯著性分析應(yīng)用LSD新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 云煙87內(nèi)生真菌的分離與鑒定

從田間采摘的3株云煙87的不同部位共分離出103株內(nèi)生真菌，包括：尖孢鐮刀菌、土曲霉、Aspergillus lentulus、球毛殼菌、互隔交鏈孢菌、廣生莖點(diǎn)霉和朱黃籃狀菌等53種真菌，其菌群結(jié)構(gòu)以及不同菌種之間的進(jìn)化關(guān)系見圖1。其中，尖孢鐮刀菌和土曲霉為主要優(yōu)勢種，分別占分離菌落總數(shù)的13.59%和12.62%。內(nèi)生真菌隸屬于鐮孢菌屬(Fusarium)、毛殼菌屬(Chaetomium)、曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicilium)、鏈格孢屬(Alternaria)、木霉菌屬(Trichotderma)、擬盤多毛孢屬(Pestalotiopsis)、莖點(diǎn)霉屬(Phoma)和籃狀菌屬(Talaromyces)等29屬，其中，曲霉屬、鐮孢菌屬、籃狀菌屬和鏈格孢屬為主要優(yōu)勢屬，分別占總屬數(shù)的23.30%、20.39%、7.77%和6.80%。由表1可知：在云煙87上部葉共分離出10屬11種內(nèi)生真菌，中部葉和下部葉分別分離出7屬8種內(nèi)生真菌，莖部共分離出8屬11種內(nèi)生真菌，主根共分離出13屬22種內(nèi)生真菌，須根共分離出5屬7種內(nèi)生真菌。

表1 云煙87不同部位煙草內(nèi)生菌種類Tab.1 Endophytic fungi in different parts of Yunyan87

圖1 云煙87內(nèi)生真菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of endophytic fungi in Yunyan87

2.2 云煙87不同部位內(nèi)生真菌的群落差異

由圖2可知：從成熟健康的云煙87分離出的103株內(nèi)生真菌中，從葉部分離出25種共30株內(nèi)生真菌，占分離菌落總數(shù)的29.13%，包括上部葉11株，中部葉10株，下部葉9株，鏈格孢屬(Alternaria)是葉部內(nèi)生真菌的主要優(yōu)勢屬；從莖部分離出11種共20株內(nèi)生真菌，占分離菌落總數(shù)的10.68%，尖孢鐮刀菌和朱黃籃狀菌為莖部內(nèi)生真菌的主要優(yōu)勢種；從根部分離出27種共53株內(nèi)生真菌，占分離菌落總數(shù)的51.46%，包括主根38株，須根15株，土曲霉為根部內(nèi)生真菌的主要優(yōu)勢種?？傮w而言，內(nèi)生真菌種類和數(shù)量為根部>葉部>莖部。其中，在云煙87的根、莖、葉中有2種內(nèi)生真菌共同存在，分別為尖孢鐮刀菌和Aspergillus lentulus；在根、葉中有4種內(nèi)生真菌共同存在，分別為尖孢鐮刀菌、A.lentulus、煙曲霉和草酸青霉菌；在根、莖中有5種內(nèi)生真菌共同存在，分別為尖孢鐮刀菌、A.lentulus、土曲霉、廣生莖點(diǎn)霉和毛栓菌；在莖、葉中有3種內(nèi)生真菌共同存在，分別為尖孢鐮刀菌、A.lentulus和互隔交鏈孢菌。

圖2 不同部位內(nèi)生真菌的種數(shù)和差異Fig.2 Species and differences of endophytic fungi in different parts

2.3 促生菌株的篩選、鑒定

由圖3可知：經(jīng)篩選的001E-5、001H-10和001I-26等3株促生菌株處理的煙苗與對(duì)照存在明顯差異，促生效果良好。

圖3 3種促生菌株對(duì)不同品種煙苗的促生效果Fig.3 Promotion effect of three plant-promoting fungi on toabcco seedlings

對(duì)3株促生效果最明顯的內(nèi)生真菌進(jìn)行序列同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建(圖4)，并結(jié)合其菌落特征和顯微形態(tài)特征分析，結(jié)果表明：3株具有顯著促生作用的內(nèi)生真菌分別為尖孢鐮刀菌(001E-5)、土曲霉(001H-10)和朱黃籃狀菌(001I-26)。

圖4 促生菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹及形態(tài)特征Fig.4 Phylogenetic tree and morphological characteristics of growth-promoting fungi

2.4 促生菌株對(duì)不同品種煙苗的影響

由表2可知：經(jīng)尖孢鐮刀菌處理的云煙97煙苗的株高、鮮質(zhì)量及地上部鮮質(zhì)量增長最為顯著，分別比對(duì)照增長107.64%、153.97%和167.09%，分別比紅花大金元煙苗顯著高98.58%、135.14%和147.23%，云煙87和K326之間的上述3項(xiàng)指標(biāo)增長率沒有顯著差異；云煙97煙苗的最大葉長增長最為顯著，比對(duì)照增長61.02%；在最大葉寬方面，云煙97增長率顯著高于其他3個(gè)品種，比對(duì)照煙苗增長53.03%；K326煙苗的根長和根鮮質(zhì)量增長最為明顯，分別比對(duì)照顯著增長50.75%和111.75%。

經(jīng)土曲霉處理的煙苗在株高和根長方面有所增長，但品種間差異不顯著；紅花大金元煙苗的最大葉長和最大葉寬增長顯著低于其他3個(gè)品種；云煙87煙苗的鮮質(zhì)量、根鮮質(zhì)量和地上部鮮質(zhì)量增長最為顯著，分別比對(duì)照煙苗增長172.85%、209.57%和169.18%。

經(jīng)朱黃籃狀菌處理的K326煙苗的鮮質(zhì)量、根鮮質(zhì)量和地上部鮮質(zhì)量增長最為顯著，增長率分別比紅花大金元高27.62%、10.45%和29.45%；云煙87煙苗株高增長最為明顯，增長率顯著比紅花大金元高31.35%；紅花大金元的最大葉寬增長最明顯，比K326煙苗顯著高20.47%；云煙97煙苗的根長增長率最明顯，顯著高于紅花大金元20.06%。

由表2還可知：尖孢鐮刀菌對(duì)云煙97煙苗株高、鮮質(zhì)量以及地上部鮮質(zhì)量的促生作用最好；而土曲霉對(duì)其煙苗根鮮質(zhì)量促生作用最明顯，比對(duì)照煙苗增長169.21%。就云煙87而言，經(jīng)土曲霉處理后，其煙苗的鮮質(zhì)量、根鮮質(zhì)量及地上部鮮質(zhì)量增長率顯著高于其他2個(gè)菌種；而朱黃籃狀菌處理對(duì)其煙苗株高增長最明顯，比對(duì)照煙苗增長71.66%。就K326而言，尖孢鐮刀菌對(duì)其煙苗根鮮質(zhì)量和根長的促生效果最明顯；土曲霉對(duì)其煙苗的鮮質(zhì)量和地上部鮮質(zhì)量影響最為明顯，分別增長108.53%和109.52%。經(jīng)朱黃籃狀菌處理的紅花大金元煙苗的地上部各項(xiàng)性狀指標(biāo)均顯著高于其他2個(gè)菌種處理的煙苗，其中株高、最大葉長和最大葉寬增長率分別為40.31%、24.21%和28.17%；此外，經(jīng)土曲霉處理的紅花大金元煙苗根鮮質(zhì)量增長率為121.47%。

3 討論

從云南省栽培的成熟云煙87植株分離出103株內(nèi)生真菌，其中曲霉屬和鐮孢菌屬為主要優(yōu)勢屬，這與裴洲洋[13]對(duì)河南9個(gè)煙草品種內(nèi)生真菌的分離結(jié)果不同。同時(shí)，本研究表明：云煙87根部和葉部分離出的內(nèi)生真菌的多樣性高于莖部，這與湖北栽培云煙87莖部內(nèi)生真菌多樣性最高的結(jié)論[14]相反。本研究進(jìn)一步證實(shí)：不同地域土壤條件下的菌群差異可導(dǎo)致內(nèi)生真菌在植株體內(nèi)定殖群落和部位存在差異。有研究表明：內(nèi)生真菌具有不同的組織偏好性[15]，本研究中的優(yōu)勢菌種尖孢鐮刀菌集中分布于根部和莖部，而另一優(yōu)勢菌種土曲霉主要分布于根部，而葉部內(nèi)生真菌主要優(yōu)勢屬為鏈格孢屬(Alternaria)。

通過煙苗促生試驗(yàn)篩選出的3株內(nèi)生真菌對(duì)不同品種煙苗以及煙苗不同生理指標(biāo)的影響也存在差異。云煙87和K326在促生菌株的處理下，除個(gè)別生理指標(biāo)外，整體增長趨勢較為一致，這可能是由于K326是云煙87的父本，親緣關(guān)系較近，真菌促生機(jī)理相似。尖孢鐮刀菌和朱黃籃狀菌分別對(duì)云煙97和紅花大金元的促生效果整體最為顯著，推測2種菌株分別在2個(gè)品種煙草中的菌群密集度更高或者煙草對(duì)菌的適應(yīng)性更強(qiáng)。

尖孢鐮刀菌對(duì)4個(gè)品種煙苗的多項(xiàng)生理指標(biāo)均表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)作用，可能是由于該菌在煙株體內(nèi)的分布較為廣泛，且分離出的尖孢鐮刀菌為非致病性尖孢鐮刀菌。已有研究表明：非致病性尖孢鐮刀菌可以從健康植株根莖部以及土壤中分離出[16]，可促進(jìn)番茄種苗生長[17]；此外，楊猛等[18]研究發(fā)現(xiàn)：非致病性尖孢鐮刀菌可以提高西瓜和黃瓜的株高和鮮質(zhì)量以及植物中赤霉素的含量，這些結(jié)果與本研究中表現(xiàn)出的煙草促生效果一致。在真菌群落豐度較低或未達(dá)到飽和狀態(tài)時(shí)，尖孢鐮刀菌與其他內(nèi)生真菌相比，對(duì)于營養(yǎng)元素以及侵染位點(diǎn)的競爭更大，這就使植物免疫進(jìn)一步提高，從而促進(jìn)植物生長。

本研究表明：土曲霉可促進(jìn)4個(gè)煙草品種的根部生長。已有研究表明：土曲霉通過產(chǎn)生一系列抑菌代謝產(chǎn)物，在根部土壤微環(huán)境中創(chuàng)造一個(gè)促進(jìn)根生長的菌群環(huán)境，進(jìn)而限制其他菌種對(duì)植物體內(nèi)營養(yǎng)的消耗，促進(jìn)根部生長[19-20]。因此，在煙草漂浮育苗過程中適當(dāng)施加土曲霉，將有效促進(jìn)煙苗根部生長，達(dá)到促根壯苗的效果。

朱黃籃狀菌大多分離自玉米和石榴等植物，本研究首次從煙草中分離出該菌。研究表明：朱黃籃狀菌可產(chǎn)生較多的淀粉酶[21]，云南籃狀菌(Talaromyces yunnanensis)能夠溶磷[22]，經(jīng)朱黃籃狀菌處理煙苗的地上部分促生效果相對(duì)更為顯著，這可能是由于產(chǎn)生的大量淀粉酶使煙葉中的淀粉加速水解為糖類或者促進(jìn)土壤中的礦化磷轉(zhuǎn)化為水溶性磷，為煙苗地上部生長提供更多的能量。此外，LIMA等[23]和CHEN等[24]研究發(fā)現(xiàn)：朱黃籃狀菌的次生代謝產(chǎn)物中包含許多萜類化合物，但目前對(duì)于該菌的研究較少，其次生代謝物作用有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，不同促生菌株的具體作用部位存在差異，因此，在煙草生長的不同時(shí)期施加可促進(jìn)不同部位生長的功能菌株，有針對(duì)性的單獨(dú)或混合使用促生菌株，可達(dá)到促進(jìn)根部生長、調(diào)節(jié)煙苗根莖比例和葉片數(shù)的目的，從而提高煙苗成活率和煙草質(zhì)量。

4 結(jié)論

本研究從云南烤煙主栽品種云煙87不同部位分離到53種103株內(nèi)生真菌，其中曲霉屬和鐮孢菌屬為主要優(yōu)勢屬。3株顯著促進(jìn)煙苗生長的菌株經(jīng)分子生物學(xué)鑒定為尖孢鐮刀菌(001E-5)、土曲霉(001H-10)和朱黃籃狀菌(001I-26)，001E-5和001H-10對(duì)云煙97、云煙87和K326的鮮質(zhì)量提高均在91%以上。研究結(jié)果為煙草內(nèi)生菌株的促生菌劑研發(fā)提供了理論依據(jù)。