楊德潔，余鳳玉，牛曉慶，宋薇薇，唐慶華，覃偉權

(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院椰子研究所/海南省檳榔產(chǎn)業(yè)工程研究中心，海南文昌，571339)

檳榔是我國四大南藥之首，其果、種子、皮、花均可入藥[1]。目前，中國已躍居為世界第二大檳榔生產(chǎn)國，而中國檳榔產(chǎn)量的95%以上都來自海南省[2]。近年來，檳榔病蟲害頻發(fā)，對海南省檳榔產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展造成嚴重威脅。受檳榔病蟲害等因素影響，2020年海南省檳榔產(chǎn)量較2019年下降約2.9%，打破了連續(xù)多年檳榔產(chǎn)量持續(xù)增長的趨勢[3]。其中檳榔根腐病為害嚴重，一度成為海南島檳榔主產(chǎn)區(qū)影響檳榔生產(chǎn)的主要障礙之一[4]。引起檳榔根腐病的病原菌種類多樣，目前國內(nèi)已報道的檳榔根腐病病原菌包括Phellinusnoxius、Ustulinadeusta、Ganodermalucidum[4-5]，以及鐮刀菌可引起檳榔鐮刀菌根頸腐爛病[6]等。

大部分根腐病菌感染檳榔后都會引起檳榔根部壞死，地上部葉片變色發(fā)黃或枯死，甚至全株枯死，嚴重影響檳榔生長。2019—2020年筆者在海南島東部地區(qū)調查檳榔根腐病發(fā)現(xiàn)，一種不常見的檳榔根腐病癥狀根部病害。通過采集樣品、組織分離培養(yǎng)、致病性測定、形態(tài)學觀察等明確該病原菌為可可毛色二孢菌Lasiodiplodiatheobromae，并對該病原菌的生物學特性進行初步研究，以期為該病害發(fā)生規(guī)律探究和綜合防治措施制訂提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株為分離自發(fā)病檳榔根部的菌株，供試植物為中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院椰子研究所“熱研1號”檳榔苗(3～4片葉)。

1.2 方法

1.2.1 田間樣品采集 2019—2020年調查中，在海南島瓊海市檳榔種植區(qū)發(fā)現(xiàn)一種與已報道檳榔根腐病癥狀不同的根部病害，進行田間癥狀觀察與記錄后，對病株整體形態(tài)與根部進行拍照，將采集的樣品放入冰盒帶回實驗室。

1.2.2 病原菌的分離純化 采用常規(guī)組織分離法對發(fā)病植株進行病原物分離純化。用清水將病根表面泥土沖洗后，再用75%酒精脫脂棉擦洗表面，用無菌刀片在病健交界處切取長約1.0 cm的病根組織，置于75%酒精中浸泡30 s，用1%NaClO表面消毒3～5 min，無菌水漂洗3次，將其放在無菌濾紙上吸干水分，用無菌刀片去除表皮后切成約2 mm×5 mm的組織塊，然后轉移到PDA平板上培養(yǎng)；待長出菌落后，挑取菌落邊緣菌絲轉接至新鮮PDA平板上培養(yǎng)，多次轉接直至菌落形態(tài)一致，最后將純化好的菌落轉移到PDA斜面保存待用[7]。

1.2.3 病原菌的致病性測定 采用柯赫氏法則對分離純化菌株進行致病性測定。采用蘸根法[8]接種：用滅菌針頭損傷健康檳榔幼苗根部，將損傷的植株于13 g/L菌絲懸浮液中浸泡30 min，無菌濕潤脫脂棉包裹后移至無菌塑料盒中，根部遮光培養(yǎng)，以無菌水浸泡30 min作為對照，每處理重復3次。自然光照，定期補充水分并觀察記錄植株發(fā)病狀態(tài)，發(fā)病后對發(fā)病組織進行病原菌分離培養(yǎng)，鑒定再次分離到的病菌性狀是否與原始分離菌相同。

1.2.4 病原菌的形態(tài)學鑒定 進行致病性驗證的同時，將純化菌株接種到PDA平板上，參照Alves等[9]培養(yǎng)條件，分別在全黑暗及全光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)和色澤，測量菌落直徑，并在顯微視野下觀察分生孢子等形態(tài)特征，并測量孢子大小。

1.2.5 病原菌的分子學鑒定 將純化后的菌株28 ℃培養(yǎng)5～7 d后，采用真菌DNA提取試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)提取DNA。利用rDNA-ITS序列引物ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)/ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)進行PCR擴增，引物均委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。50 μL PCR反應體系：2×Taq PCR Master Mix 25 μL(北京索萊寶科技有限公司)、引物各2 μL、DNA模板1.5 μL，加去離子水[天根生化科技(北京)有限公司]補足至50 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min，10 ℃保存。擴增產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳30 min，PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。測序所得序列進行BLAST比對分析，并從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載與待測菌株同屬的標準菌株ITS序列以及外群標準菌株ITS序列，運用MEGA-X軟件進行序列比對及構建系統(tǒng)發(fā)育樹(鄰接法)。

2 結果與分析

2.1 田間癥狀

該病原菌主要為害檳榔根部，同時葉部會有變色或枯死。發(fā)病初期病根表面發(fā)黑有菌絲纏繞，但無明顯壞死；隨著病菌擴展，病根木質部逐漸變褐腐爛且易與皮層分離，下部葉片變黃并自下而上、由葉尖向內(nèi)部發(fā)展，最終整株變色或枯死(見圖1)。

圖1 檳榔根腐病發(fā)病植株葉部、根部癥狀(左)和致病性驗證的葉部、根部癥狀(右)

2.2 致病性測定

對分離得到的菌株進行致病性驗證，蘸根7 d后，健康檳榔苗下部葉片從葉尖開始變黃，并逐漸向上擴展，根部木質部變褐且易與皮層分離，針刺處較為明顯(見圖1)；對照均未發(fā)病。取發(fā)病植株根部樣品，對病健交界處組織進行分離培養(yǎng)，獲得與最初分離的病原菌一致的菌株。根據(jù)柯赫氏法則，說明分離的病原菌為檳榔根腐病的致病菌。

2.3 病原菌形態(tài)鑒定

該病原菌在PDA平板上生長迅速，光照和黑暗條件下2～3 d均可長滿整皿(直徑9 cm)，菌絲發(fā)達，絨毛狀，菌落邊緣不整齊。光照和黑暗條件下，菌落初期灰白色，隨著培養(yǎng)時間增加，菌落顏色不斷變深，最后呈灰黑色(見圖2)，顯微觀察發(fā)現(xiàn)菌絲分隔且有分支。黑暗和光照培養(yǎng)菌株有差異，光照培養(yǎng)的菌株培養(yǎng)后期會產(chǎn)生墊狀子座，而黑暗培養(yǎng)的菌株產(chǎn)生子座數(shù)量極少或不產(chǎn)生子座。將子座內(nèi)的分生孢子器切開，在顯微鏡下觀察，可看到大量未成熟和成熟的分生孢子。未成熟分生孢子為橢圓形或卵形，單孢，顏色淺，細胞壁較薄，大小為(11.83～17.02) μm×(20.95～30.90) μm；成熟分生孢子為橢圓形或卵形，中間有一分隔(雙孢)，顏色深，細胞壁厚，大小為(11.36～15.19) μm×(21.45～27.56) μm(見圖3)。這些形態(tài)特點都基本符合可可毛二色孢菌的特征[10]，試驗過程中未觀察到其有性階段。

圖2 檳榔根腐病病原菌在PDA培養(yǎng)基上的菌落性狀

圖3 檳榔根腐病病原菌分生孢子器(a)、分生孢子(b)及菌絲(c)形態(tài)特征

2.4 病原菌分子鑒定

將測序得到的rDNA-ITS序列通過BLAST進行比對分析，結果顯示其與多個Lasiodiplodiatheobromae菌株的相似度高達99%以上。為了進一步鑒定菌株，我們在NCBI中下載了10個Lasiodiplodia屬標準菌株的ITS序列，并將Botryosphaeriadothidea(NR-111146.1)和Botryosphaeriascharifii(NR-111719.1)作為外群，通過MEGA-X軟件進行序列比對與構建系統(tǒng)發(fā)育樹[11]。結果顯示目標菌株Q-7-1與Lasiodiplodiatheobromae聚為一類(見圖4)，且具有很高的自舉支持率，從而在系統(tǒng)學角度證明了Q-7-1為可可毛色二孢菌Lasiodiplodiatheobromae。

圖4 檳榔根腐病病原菌株Q-7-1基于rDNA-ITS序列構建的Lasiodiplodia屬系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結論與討論

本研究通過生物學與分子學鑒定方法，最終確定可可毛色二孢菌為導致檳榔根腐病的新病原菌，這是可可毛色二孢菌引起檳榔根腐病的首次報道?？煽擅呔鶯．theobromae是子囊菌門(Ascomycota)葡萄座腔菌Botryosphaeriarhodina的無性態(tài)，為多寄主土傳病原真菌，它能引起林木、蔬菜、水果和大田作物等280多種植物田間和貯藏病害[12]，且在不同寄主上癥狀表現(xiàn)不同，包括梢枯、枝枯、根腐、果腐、葉斑、潰瘍、流膠、變色、壞死等，在我國主要引起葉斑、潰瘍、流膠、梢枯和根腐等癥狀[13]。可可毛色二孢菌為弱寄生茵，一般在寄主植物長勢衰弱、樹體產(chǎn)生傷口或外界脅迫時更易被侵染致病[14]。本研究分離到的病原菌均來自3～4年生幼齡檳榔樹，暫未在壯年大樹根部分離到該病原菌，猜測可能與幼齡檳榔樹體較弱有關。

可可毛色二孢菌的菌絲生長和產(chǎn)孢是否需要光照是目前研究者較為關注的問題。有學者認為連續(xù)光照24 h條件下更有利于其菌絲生長[15]，但也有研究認為光照對其菌絲生長、分生孢子器和分生孢子的形成沒有影響[16]。而本研究發(fā)現(xiàn)光照和黑暗對其菌絲生長沒有明顯影響，但連續(xù)24 h光照更有利于其分生孢子器和分生孢子的產(chǎn)生，這與謝紅輝等對可可毛色二孢菌的研究結論一致[17]，并且這兩者均分離自發(fā)病根部，是否由于寄主或寄生部位的不同而導致其對光照需求差異，這需要進一步研究。

筆者在調查過程中還在檳榔根部分離到了一種與可可毛色二孢菌培養(yǎng)性狀極為相似的菌株，經(jīng)鑒定為假可可毛色二孢菌Lasiodiplodiapseudotheobromae，致病性驗證試驗中其并未引起檳榔植株發(fā)病。這兩株菌分別來自海南的不同市縣，在PDA培養(yǎng)基上菌落形態(tài)幾乎一樣，僅通過肉眼無法區(qū)分。有相關研究表明，假可可毛色二孢菌可以引起藍莓、龍眼、橡膠、桂花、蓮霧等多種作物的潰瘍、枝枯及果腐等癥狀[18]，后續(xù)可在兩種菌的區(qū)分方法以及生物學特性分析上再進行相關深入研究。