羅 躍，劉阿麗，劉旭東，韓 磊，姚小龍，胡安龍，吳小毛

(1 貴州大學作物保護研究所，貴陽，550025；2 貴州省山地農業(yè)病蟲害重點實驗室，貴陽，550025；3 貴州大學農學院，貴陽，550025)

葡萄炭疽病又名晚腐病、苦腐病，是葡萄近成熟期的主要真菌病害之一[1]。我國葡萄種植區(qū)內炭疽病普遍發(fā)生，尤其在南方產區(qū)、北方環(huán)渤海產區(qū)等，西北產區(qū)基本不發(fā)生[2-3]。當前研究表明，引起葡萄炭疽病的病原菌主要有膠孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides和尖孢炭疽菌Colletotrichumacutatum，但如殼皮炭疽菌Colletotrichumcrassipes、Colletotrichumfructicola等一些新的致病菌種也在不斷被發(fā)現報道[4-5]。膠孢炭疽菌屬半知菌亞門(Deuteromycotina)、黑盤孢目(Melanconiales)、炭疽菌屬(Colletotrichum)[6]。葡萄炭疽病主要在轉色期至成熟期的果實上發(fā)生，當前報道中不同病原侵染后引發(fā)的病癥描述較為相近，病原菌侵染果實后起初在表面形成褐色斑點，病斑擴大后中心轉黑凹陷并產生輪紋狀黑點，環(huán)境濕度大時病部生出粉色黏狀物，最終導致果實皺縮腐爛[2，7]。

近年來，隨著貴州省農業(yè)產業(yè)結構調整及脫貧攻堅工作的推動，葡萄產業(yè)發(fā)展迅速，貴陽市花溪區(qū)為貴州省的葡萄主要產區(qū)之一，炭疽病隨著種植面積不斷擴大而在葡萄上的危害日益嚴重，高溫多雨季節(jié)最有利于其發(fā)生[8]，每年造成葡萄產業(yè)的損失達10%～20%，嚴重時可達30%以上，對葡萄的品質和產量影響較大[9]?；瘜W藥劑仍是當前防治炭疽病的主要措施[10]，但化學農藥長期單一及不合理使用，導致葡萄炭疽病病原菌對部分藥劑產生了不同程度的抗藥性[11-12]。如鄧維萍等[13]發(fā)現烯唑醇和腈菌唑在不合理使用情況下，使得炭疽病菌產生抗藥性；葉佳等[14]研究表明，浙江葡萄炭疽病病菌對甲基硫菌靈已產生了嚴重抗藥性，防治效果明顯降低。引起葡萄發(fā)生炭疽病的病原菌種類不一，不同病原對同種藥劑的敏感性存在差異的可能較大，且病原菌的抗藥性存在時空差異，因此，明確貴陽市花溪區(qū)葡萄炭疽病的病原種類，篩選出具有針對性的高效防治藥劑，并將作用機理不同的藥劑進行混配，選出共毒系數較高的組合供生產上施藥參考，對當地葡萄炭疽病的防治和延緩病原抗藥性的產生具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試分離物：葡萄品種為巨玫瑰，葡萄炭疽病病樣采于貴陽市花溪區(qū)葡萄基地。

7種供試殺菌劑原藥：97%苯醚甲環(huán)唑(江蘇耕耘有限責任公司)；98%吡唑醚菌酯(湖北康寶泰精細化工有限公司)；98%肟菌酯、95%啶氧菌酯、98%雙苯菌胺、95%唑菌酯、96%丁香菌酯(沈陽化工研究院有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 葡萄炭疽病病原鑒定

采用組織分離法[15]進行分離。在葡萄果皮表面病健交界處剪取適當大小組織塊放在無菌濾紙上，用75%乙醇表面消毒35 s，無菌水沖洗3次，置于PDA培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)3 d后，挑取菌落邊緣菌絲進行純化，重復純化直至得到單一菌株，將純化后的菌株轉接于PDA試管斜面4 ℃保存。

觀察記錄PDA平板上該病原菌菌落的形態(tài)、顏色等特征。黑光燈照射產孢培養(yǎng)后，在光學顯微鏡下觀察分生孢子的大小形態(tài)并拍照。

根據柯赫氏法則進行回接試驗，測定分離菌株的致病性。采用注射法將孢子懸浮液接種在葡萄果實上。將接種后的葡萄果實置于含濾紙和脫脂棉的保鮮盒中保濕培養(yǎng)，控制培養(yǎng)的溫度和濕度條件，觀察發(fā)病癥狀。

參照陳吉良等[16]的方法提取病原菌DNA。利用真菌通用引物ITS4和ITS5對病原菌rDNA的ITS區(qū)域進行PCR擴增。25 μLPCR反應體系包括：正反向引物各1.0 μL；DNA模板1.0 μL；ddH2O 9.5 μL；2×PCR Master Mix (含2xTaq DNA Polymerase，2×PCR Buffer，2xdNP)12.5 μL。PCR反應擴增程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，52 ℃退火40 s，72 ℃延伸90 s，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至生工(上海)生物工程股份有限公司測序，用Chromas軟件分析序列并上傳到GenBank核酸數據庫中，通過BLAST進行同源序列比對分析，采用MEGA6.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2 防治藥劑篩選

采用菌絲生長速率法[17]進行藥劑毒力測定。將7種藥劑都配制成母液后，將母液稀釋成至少5個濃度梯度，然后以體積比1∶9加入PDA培養(yǎng)基中，充分搖勻后制成含藥平板。使用直徑5 mm的打孔器打出菌餅接種于含5個濃度供試藥劑的9 cm PDA平板中央，以等量無菌水與PDA混勻制成平板作為空白對照，每個處理重復3次，28 ℃恒溫培養(yǎng)。3～5 d后，采用十字交叉法測量各平板的菌落直徑，運用DPS 13.0數據處理系統(tǒng)計算各藥劑對葡萄炭疽病菌菌絲生長抑制的回歸方程、EC50值。

菌絲生長抑制率=

將苯醚甲環(huán)唑與吡唑醚菌酯，苯醚甲環(huán)唑與啶氧菌酯進行組合配比，按質量濃度8∶1、4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、1∶8等不同比例混合并稀釋到試驗所需要的各濃度處理，分別以混合的單劑作為對照，并設空白對照，每個處理重復3次，求得各配比的毒力回歸方程及其EC50值。根據共毒系數法求出毒力指數、理論毒力指數、實際毒力指數及混劑的共毒系數CTC值，并以此進行綜合評價，CTC>120表示增效作用，80

實測藥劑毒力指數(ATI)=

混劑的理論毒力指數(TTI)

=(藥劑A的毒力指數×Ax)

+(藥劑B的毒力指數×Bx)

Ax—藥劑A在混劑中的百分含量；Bx—藥劑B在混劑中的百分含量。

2 結果與分析

2.1 葡萄炭疽病病原鑒定結果

試驗結果看出，病原菌在PDA平板上的菌落呈圓形，菌落邊緣平整，菌絲為白色或灰白色，絨狀或絮狀(如圖1a、圖1b)。光學顯微鏡觀察發(fā)現，該菌株分生孢子橢圓形，無色、單孢，有隔，具1～2個油球，圓筒形，兩端鈍圓，大小為(13.1～17.2) μm×(3.4～4.8)μm(如圖1c)。分生孢子萌發(fā)時產生的附著孢深褐色，為球形或橢圓形。

注：a、b為菌落形態(tài)，c為分生孢子。

用注射法將孢子懸浮液回接到健康的葡萄果實上，癥狀與自然發(fā)病的炭疽病無異。根據柯赫氏法則，將發(fā)病果實重新進行組織分離，純化培養(yǎng)，其菌落形態(tài)特征與接種菌株一致。

對供試菌株的基因組rDNA-ITS進行PCR擴增，擴增產物經測序獲得大小為566 bp的DNA片段，瓊脂糖凝膠電泳結果如圖2a所示。將其與GenBank中已有序列進行同源性比對，發(fā)現該菌株rDNA-ITS序列與膠孢炭疽菌的同源性達100%。采用MEGA6.0構建系統(tǒng)發(fā)育樹(如圖2b)，菌株與膠孢炭疽菌有較高的支持率聚在一支，鑒定結果表明該病原菌為膠孢炭疽菌。

注：a中1表示DNA marker (D2000)，2為對照，3表示分離菌株PCR擴增產物。

2.2 防治葡萄炭疽病化學藥劑篩選結果

試驗結果看出，7種供試藥劑對菌株均有一定的抑制作用，但敏感性存在差異。從藥劑的EC50值來看，丁香菌酯的抑制作用最強，EC50值為0.18 mg/L；其次為苯醚甲環(huán)唑和雙苯菌胺，EC50值分別為1.18 mg/L和1.34 mg/L；吡唑醚菌酯和啶氧菌酯也較敏感，EC50值分別為4.01 mg/L和5.09 mg/L；而肟菌酯和唑菌酯的敏感性相對較低，其EC50值分別為14.37 mg/L和25.88 mg/L(見表1)。

表1 不同殺菌劑對病原菌菌絲生長的抑制作用

試驗結果看出，吡唑醚菌酯與苯醚甲環(huán)唑不同比例組合對供試菌株的菌絲生長抑制差異明顯。吡唑醚菌酯與苯醚甲環(huán)唑的質量比為8∶1和4∶1時CTC>120，CTC值分別為168.69和152.89，表現為增效作用，增效效果顯著。吡唑醚菌酯與苯醚甲環(huán)唑的質量比為1∶4時，其CTC值為112.62，表現為相加作用。此外，當質量比為2∶1、1∶2、1∶1和1∶8時，表現為拮抗作用(見表2)。

表2 吡唑醚菌酯與苯醚甲環(huán)唑混配抑制效果

試驗結果看出，啶氧菌酯和苯醚甲環(huán)唑不同比例組合對供試菌株表現出不同程度的抑制效果。其中啶氧菌酯與苯醚甲環(huán)唑的質量比為8∶1和1∶4時，增效作用最好，CTC值分別為192.69和197.21，明顯大于120，增效效果顯著。啶氧菌酯與苯醚甲環(huán)唑的質量比為4∶1、2∶1時，其CTC值分別為103.30和108.29，表現為相加作用。此外，當質量比為1∶1、1∶2和1∶8時，表現為拮抗作用(見表3)。

表3 啶氧菌酯與苯醚甲環(huán)唑混配抑制效果

3 結論與討論

本研究對采自貴陽市花溪區(qū)葡萄基地的葡萄炭疽病病樣進行病原菌的分離純化，通過致病性測定發(fā)現，該菌株具有較強的致病能力，所分離菌株形態(tài)特征與李洋等[18]、鄧維萍[5]等研究結果相一致。結合rDNA-ITs序列分析，鑒定該菌株為膠孢炭疽菌。采用菌絲生長速率法對7種殺菌劑原藥進行了室內毒力測定，結果表明，7種殺菌劑對葡萄炭疽病病菌均有一定的抑制作用，其中丁香菌酯對膠孢炭疽菌菌絲生長的抑制作用最強，EC50值為0.18 mg/L，病原菌對苯醚甲環(huán)唑、雙苯菌胺、吡唑醚菌酯和啶氧菌酯也較敏感，EC50值分別為1.19、1.34、4.01、5.09 mg/L，而對肟菌酯和唑菌酯的敏感性相對較低。孫行杰等[19]、楊敬輝等[12]研究表明，苯醚甲環(huán)唑和吡唑醚菌酯對葡萄炭疽病病菌菌絲具有較強的抑制作用，與本試驗結果基本相一致，但本試驗中苯醚甲環(huán)唑和吡唑醚菌酯的EC50值于高孫行杰等[19]、楊敬輝等[12]的研究結果，可能是由于不同地區(qū)病原菌抗藥性水平差異導致。

苯醚甲環(huán)唑屬三唑類殺菌劑，主要通過干擾病原菌細胞麥角甾醇的合成達到抑菌效果，而啶氧菌酯和吡唑醚菌酯是線粒體呼吸抑制劑，通過阻止病原菌細胞中細胞色素b和C1間電子傳遞而抑制線粒體呼吸作用。將吡唑醚菌酯與苯醚甲環(huán)唑、啶氧菌酯與苯醚甲環(huán)唑等作用機理不同的殺菌劑進行混配組合，結果表明，吡唑醚菌酯與苯醚甲環(huán)唑的質量比為8∶1和4∶1時，共毒系數(CTC)分別為168.69和152.89，表現為增效作用；啶氧菌酯與苯醚甲環(huán)唑的質量比為8∶1和1∶4時，CTC值分別為192.69和197.21，增效效果顯著；其中啶氧菌酯與苯醚甲環(huán)唑質量比1∶4時，增效最明顯。通過藥劑間混配，不僅可以擴大協同增效藥劑的殺菌譜，還可延緩葡萄炭疽病菌抗藥性的產生，延長藥劑的使用壽命。本研究結果表明，丁香菌酯、苯醚甲環(huán)唑、雙苯菌胺、吡唑醚菌酯和啶氧菌酯對該病原菌均有較好的抑制作用，該結果可為葡萄炭疽病的田間選藥防治提供一定的理論參考。