李 婷，王 玥，劉中珊，劉 奇，徐赫男，李沖偉

（1黑龍江大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，哈爾濱 150080；2黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院黑龍江省寒地生態(tài)修復(fù)與資源利用重點實驗室，哈爾濱 150500；3哈爾濱華美億豐復(fù)合材料有限公司，哈爾濱 150500）

0 引言

堆肥發(fā)酵作為農(nóng)業(yè)廢棄物規(guī)范化、集中化和資源化利用的主要途徑之一，因其具有成本低、有機(jī)物降解快、無害化程度高等優(yōu)勢，在國內(nèi)外農(nóng)業(yè)廢棄物處理方面得到廣泛應(yīng)用[1]。在中國北方地區(qū)，由于低溫持續(xù)時間較長（4～6個月），導(dǎo)致腐熟過程無法快速啟動和有效發(fā)酵，降低了堆肥材料的代謝和反應(yīng)速度，堆肥效果受到抑制[2-3]。有研究表明，堆體溫度低于20℃，大多數(shù)微生物的新陳代謝減慢，堆肥周期延長；環(huán)境溫度≤15℃，堆肥過程難以自發(fā)進(jìn)行[4]。早在1985年，Strom等[5]發(fā)現(xiàn)微生物對堆肥啟動有著重要作用，在堆肥中添加微生物可以使低溫堆肥啟動困難的現(xiàn)象得到緩解。Yousif等[6]在低溫堆肥中接種了低溫纖維素降解真菌，提高了低溫堆肥的啟動溫度，取得了非常好的效果。堆肥過程產(chǎn)生的大部分熱量主要來自微生物對有機(jī)物的酶解作用[7]。Xie等[8]研究表明低溫菌株能促進(jìn)堆肥過程快速通過啟動期，對堆肥過程中溫度的升高、酶活性的提高和有機(jī)質(zhì)的降解均有積極作用。也有研究表明，與接種中溫微生物相比，低溫微生物的添加提高了堆肥的甲烷產(chǎn)量和揮發(fā)性固體的去除率[9-10]。目前為止，在堆肥中添加的啟動菌大多數(shù)是細(xì)菌和真菌，對放線菌的研究較少。放線菌是堆肥過程中重要的一類微生物，雖然它們生長速度較慢，但具有耐溫、對極端環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)、易于基因改造等優(yōu)點。同時，在堆肥的高溫階段，放線菌可以形成孢子以抵抗惡劣環(huán)境[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，接種放線菌不僅改變了堆肥過程的微生物群落結(jié)構(gòu)，還使得纖維素、木質(zhì)素和半纖維素的降解效率得到了有效提高，這是由于其提高了纖維素酶、木聚糖酶和漆酶的活性,并能使得木質(zhì)素過氧化物酶及錳過氧化物酶等關(guān)鍵酶活性增強(qiáng)[12-13]。篩選有效的低溫纖維素降解菌株，不僅能加快堆肥腐熟進(jìn)程，而且能夠?qū)①Y源利用效率最大化，對環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

本研究從紅松混交林凋落物層采集土壤，采用稻稈粉培養(yǎng)基富集，通過剛果紅平板染色和3`5-二硝基水楊酸法（DNS法）篩選高效降解纖維素的放線菌，通過生理生化試驗和16S rDNA基因序列對菌株進(jìn)行鑒定，采用響應(yīng)面法對菌株的產(chǎn)酶能力進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

土壤樣品，采集于哈爾濱東亞之窗公園落葉闊葉紅松混交林，采集時間2019年10月9日，樣品采集后保存在-80℃冰箱中備用。

1.2 培養(yǎng)基及配方

秸稈粉培養(yǎng)基、羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基、高氏一號培養(yǎng)基、液體發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基配制參考吳靜、沈大春等[14-15]的方法。

1.3 低溫纖維素降解菌的分離與篩選

稱取8.0 g土樣與3.0 g秸稈粉，加入100 mL蒸餾水，160 r/min振蕩10天。

取培養(yǎng)的富集液1 mL進(jìn)行稀釋，將10-3，10-4，10-5和10-6稀釋液依次于高氏一號培養(yǎng)基上進(jìn)行涂布，于15℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天，挑取單菌落，純化培養(yǎng)。

將純化后長勢較好的單一菌落挑出，經(jīng)CMC固體培養(yǎng)基培養(yǎng)時間2～3天后，利用剛果紅染色液(1 mg/mL)進(jìn)行覆蓋染色15 min，棄上層染色液，并利用NaCl洗脫液(1 mol/L)洗脫15 min，棄掉洗脫液，可得到未被著色的透明圈，分別記錄透明圈直徑(D)與菌落直徑(d)，每個實驗重復(fù)3次。

1.4 纖維素酶活力測定

纖維素酶活力測定采用DNS法，參照國標(biāo)GB-T 35808—2018。

1.5 生理生化試驗

將高效降解纖維素的放線菌菌株T23-B，經(jīng)LB培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)72 h，取菌液1 mL梯度稀釋后依次涂布于秸稈粉培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)72 h得到單菌落，觀察并記錄菌落形狀、透明度、隆起形狀、顏色、邊緣、表面以及革蘭氏染色。

1.6 分子鑒定

菌株T23-B進(jìn)行純培養(yǎng)，利用CTAB法提取總DNA，PCR擴(kuò)增并測序。引物為通用引物，正向引物為27F(5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)，反向引物為 1492R(5’TACGGCTACCTTGTACGACTT-3’)。PCR反應(yīng)體系（共25 μL）：DNA(70 ng/μL)模板1 μL；dNTP Mixture(2.5 mmol/L)12.5 μL；27F(20 μmol/L)1 μL；1492R(20 μmol/L)1 μL；補(bǔ) 足 ddH2O 到25 μL[16]。將所得產(chǎn)物經(jīng)試劑盒純化，送至哈爾濱奧恒生物科技有限公司測序。

1.7 纖維素酶活力單因素實驗

選取溫度15、20、25、30、35、40℃，時間24、48、72、96、120 h，培養(yǎng)液pH 5、6、7、8、9，氮源種類（硫酸銨、牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉、硝酸鉀、硝酸鈉、酵母膏），碳源種類（蔗糖、纖維素、可溶性淀粉、CMC-Na、甘露醇），氮源濃度2、4、6、8、10 g/L，碳源濃度5、10、15、20、25 g/L單因素，考察不同單因素對纖維素酶活力的影響。

1.8 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

結(jié)合單因素試驗結(jié)果，響應(yīng)值(Y)采用纖維素酶活力，進(jìn)行Box-Behnken試驗設(shè)計。選取pH(A)、氮源濃度(B)、碳源濃度(C)3個變量設(shè)計響應(yīng)面試驗，具體因素與水平設(shè)計見表1。

表1 Box-Behnken設(shè)計因素水平表

1.9 統(tǒng)計分析

使用Design Experts 8.0軟件繪制響應(yīng)面圖，使用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，使用MEGA7.0軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素降解菌的篩選

利用CMC瓊脂平板培養(yǎng)24 h，經(jīng)染色脫色后菌落周圍形成纖維素-溶劑區(qū)的透明圈，通過透明圈直徑(D)與菌落直徑(d)比值初步鑒定纖維素酶活。結(jié)果如表2所示，從凋落物層土壤中初步篩選出了7株D/d比值大于3的放線菌菌株，其中T23-B的比值最大為5.40，T23-B透明圈的結(jié)果如圖1所示。T23-B菌株的纖維素酶活力最高為28.34 U/mL，選擇該菌株進(jìn)一步鑒定。

表2 透明圈大小和CMC酶的活性

圖1 T23-B菌落透明圈

2.2 T23-B生理生化指標(biāo)及分子鑒定

菌株T23-B菌落呈圓形，不透明，表面粗糙，具有褶皺，邊沿不平整，淡藍(lán)綠色。生理生化鑒定表明，該菌為革蘭氏陽性菌，明膠液化和V-P實驗顯陽性，生理生化具體特征見表3。

表3 T23-B菌株的生理生化特性

T23-B菌株經(jīng)PCR擴(kuò)增后DNA片段均為單片段，每單片長度約為1500 bp。PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，得到全長1407 bp基因序列，與電泳結(jié)果一致（圖2）。16S rRNA基因序列與核糖體數(shù)據(jù)庫比對T23-B菌株與遠(yuǎn)青鏈霉菌(Streptomyces azureus)菌的同源性為99%，系統(tǒng)進(jìn)化樹由MEGA7.0進(jìn)行聚類并構(gòu)建，如圖3所示。

圖2 T23-B菌株電泳圖

圖3 T23-B菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 T23-B產(chǎn)酶條件優(yōu)化

2.3.1 產(chǎn)酶條件單因素優(yōu)化 選擇最佳溫度、最佳培養(yǎng)時間及最佳pH對菌株T23-B的產(chǎn)酶條件進(jìn)行單因素優(yōu)化，結(jié)果如圖4(a-c)，溫度低于25℃，酶活力隨著生物量的增長而增大，25℃菌株最大生物量，菌株的生物量及酶活均隨溫度的升高下降，當(dāng)溫度達(dá)到35℃，酶活力升至最高，為28.77 U/mL(P<0.01)，96 h時酶活力趨于平緩為40.3 U/mL(P<0.01)；當(dāng)pH 5.0時酶活力最高為32.5 U/mL(P<0.01)。

選取7種不同的氮源，探究氮源對纖維素酶活的影響，如圖4d所示，以酵母浸粉為氮源時，最高酶活力可達(dá)到81.9 U/mL(P<0.01)，明顯高于其他氮源種類。以酵母浸粉為氮源，進(jìn)一步考察不同氮源含量對纖維素酶活產(chǎn)量的影響，如圖4e所示，酵母浸粉含量為8 g/L時，酶活力可達(dá)到92.7 U/mL，因此選擇8 g/L作為最佳氮源含量。

選取5種不同的碳源，考察不同碳源對纖維素酶活產(chǎn)量的影響，如圖4f所示，甘露醇以為唯一碳源時，酶活力達(dá)到75.6 U/mL(P<0.01)，顯著高于其他碳源種類，因此選擇甘露醇作為最適碳源。以甘露醇為唯一碳源，考察不同碳源含量對對纖維素酶活產(chǎn)量的影響，如圖4g所示，甘露醇含量為15 g/L時，菌株T23-B產(chǎn)纖維素酶能力最強(qiáng)，酶活力達(dá)到109.7 U/mL，因此15 g/L作為最佳碳源含量。

圖4 T23-B產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

2.3.2 產(chǎn)酶條件響應(yīng)面優(yōu)化 為了進(jìn)一步優(yōu)化菌株T23-B的產(chǎn)酶條件，以單因素試驗結(jié)果為基礎(chǔ)，纖維素酶活力為響應(yīng)評價指標(biāo)，選取pH、氮源濃度和碳源濃度作為主要影響因素，進(jìn)行Box-Behnken實驗，實驗設(shè)計與結(jié)果如表4所示。回歸模型方差分析P(Pr>F)<0.0001，模型效應(yīng)極顯著，模型失擬項的顯著性水平P=0.8840＞0.05，表明模型失擬不顯著。回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2=0.9922，R2Adj=0.9821，變異系數(shù)為1.72%表明該模型與實際試驗擬合程度較好，實驗誤差較小方程擬合良好，變異幾率低。二次回歸擬合方程(1)。

表4 Box-Behnken試驗結(jié)果

式中y為預(yù)測值，A、B和C分別為pH、氮源濃度和碳源濃度。

以各因素對試驗結(jié)果的影響程度為：B（氮源濃度）＞C（碳源濃度）＞A(pH)，利用響應(yīng)面擬合方程得到3個關(guān)鍵因素的擬合值分別為：pH 5.2，氮源濃度為7.8 g/L，碳源濃度為15.6 g/L。該擬合值條件下模型的預(yù)測酶活力最大，為120.5 U/mL。在該擬合值條件下進(jìn)行培養(yǎng)，測定纖維素酶活為123.43 U/mL，與響應(yīng)面的預(yù)測酶活一致。

3 討論

森林凋落物層土壤中的多種纖維素分解菌，是非常寶貴的微生物資源。本研究從落葉闊葉紅松混交林凋落物層土壤中分離出1株產(chǎn)纖維素酶活力較強(qiáng)的低溫放線菌菌株，命名為T23-B，通過生理生化和分子生

物學(xué)鑒定結(jié)果可知，T23-B菌株為遠(yuǎn)青鏈霉菌(Streptomyces azureus)，其同源性為100%。1959年，Kelly等[17]首次發(fā)現(xiàn)并命名了遠(yuǎn)青鏈霉菌(Streptomyces azureus)，并另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)該菌株可產(chǎn)硫化氫，蛋白水解作用強(qiáng)，淀粉水解實驗呈陽性，與本實驗結(jié)果一致[18]。有研究指出該菌株屬于Streptomyces cyaneus集群，能夠生產(chǎn)硫鏈絲菌素，具有一定抗菌活性，尤其能夠抗多種條件致病菌，是一種較好的硫肽類抗生素[19-21]。有研究表明，當(dāng)外界條件變得惡劣時，放線菌能夠以孢子的形式存在，相較于其他細(xì)菌和真菌，對溫度和pH的耐受性較高，并且接種鏈霉菌可以使堆肥的溫度顯著提升，加快整個堆肥發(fā)酵周期[22-23]。鏈霉菌屬能夠高效分泌大量穩(wěn)定性高和底物特異性強(qiáng)的纖維素酶，可被用來生產(chǎn)酶制劑和抗生素等，或用于造紙污水處理等行業(yè)，鏈霉菌屬微生物分泌的纖維素酶耐受溫度在40～50℃，耐受pH 5～12，其穩(wěn)定性在放線菌

中最好[24]。在自然堆肥過程中，鏈霉菌屬為堆肥中后期的優(yōu)勢菌屬，使堆體微生物的代謝活性得以提高，增強(qiáng)堆肥中蛋白酶、蔗糖酶的活性，同時，鏈霉菌屬的抗菌活性成為堆肥無害處理的重要因素[25]。以往研究對低溫降解纖維素菌株較少，本次研究結(jié)合寒地堆肥條件，篩選對低溫耐受性較強(qiáng)的可降解纖維素的放線菌菌株，獲得T23-B菌株，其可承受0～40℃及pH 4.5～7.0環(huán)境條件，并在此條件內(nèi)能保持代謝和酶活性[26-27]，因此，T23-B菌株屬于耐冷微生物。

圖5 兩因素交互影響纖維素酶活力響應(yīng)面圖

該菌株最適氮源為8 g/L酵母浸粉，最適碳源為15 g/L甘露醇。酵母浸粉能提供微生物生長必需的優(yōu)質(zhì)氮源，并且有機(jī)氮源相較于無機(jī)氮源具有更為充足的維生素、氨基酸和一些生長因子，因此，酵母浸粉可促進(jìn)纖維素降解菌產(chǎn)生纖維素酶，這與前人的報道一致[28-30]。該菌株屬好氣性鏈霉菌屬，最適轉(zhuǎn)速為160r/min，是由于轉(zhuǎn)速的提高有益于培養(yǎng)基的氧氣含量的增加，從而促進(jìn)好氧微生物的生長，但轉(zhuǎn)速過大時產(chǎn)生的剪切力會對菌體造成損傷。隨著培養(yǎng)時間的增加，菌體生物量逐漸增加，96 h生物量趨于平緩，而酶活力在前24 h迅速升高，隨后酶活力上升變慢，96 h趨于平緩，與生物量變化趨勢一致。pH 6時生物量達(dá)到最大，而酶活在pH 5時達(dá)到最大，這可能是由于酶活受pH影響顯著，或者是pH影響菌株產(chǎn)纖維素酶的能力。pH 5～9的生物量可達(dá)最適pH生長量的80%以上，說明T23-B菌株生長對pH不敏感。菌株T23-B可在15℃下生長，在30℃生長效果最好，當(dāng)溫度達(dá)40℃時，酶活力急劇下降，可能是溫度超出了該菌株的生長溫度。菌株纖維素酶產(chǎn)量受溫度影響較大，溫度會影響菌體生長速度及營養(yǎng)消耗，影響膜內(nèi)外物質(zhì)，如水分、有機(jī)物、各種離子等的交換和吸收[31]。低溫菌會采取適應(yīng)策略，在較低溫度范圍內(nèi)保持活性[32]。本研究證明T23-B在15～40℃均有產(chǎn)纖維素酶能力，在15℃時可保持44.9%的最高酶活力，由于鏈霉菌屬是堆肥中后期的優(yōu)勢菌種，且對環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)，能夠滿足低溫堆肥條件，可見，該菌株在低溫堆肥將具有非常好的應(yīng)用前景。

本研究僅對該菌株的纖維素酶活力進(jìn)行測定及優(yōu)化，未實際作用于秸稈以及未對秸稈的纖維素結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察和進(jìn)一步分析。由于堆肥過程相對復(fù)雜，微生物相互作用受外界條件影響較大，該菌株是否對堆肥過程中的有益微生物產(chǎn)生抑制作用，在堆肥實際應(yīng)用的作用效果有待進(jìn)一步探索。應(yīng)進(jìn)行大田試驗，測定該菌株制備的有機(jī)肥施用后是否對土壤中全氮、有效磷、速效鉀等土壤肥力指標(biāo)及土壤微生物群落產(chǎn)生影響。

4 結(jié)論

從紅松混交林凋落物層篩選到1株低溫纖維素降解菌——遠(yuǎn)青鏈霉菌(Streptomyces azureus)。單因素試驗表明，T23-B最適培養(yǎng)時間為96 h，最適pH 6.0，最適溫度在30℃，最適轉(zhuǎn)速160 r/min。響應(yīng)面分析表明，T23-B最適產(chǎn)酶條件為pH 5.2、96 h、35℃、甘露糖15.6 g/L，酵母浸粉7.8 g/L，在最適產(chǎn)酶條件下纖維素酶活力為123.43 U/mL，較優(yōu)化前提高了4.4倍。Streptomyces azureus是一株低溫產(chǎn)纖維素酶的放線菌，在北方冬季低溫堆肥發(fā)酵中將具有非常好的應(yīng)用價值，對提高農(nóng)業(yè)廢棄物資源利用和保護(hù)寒地生態(tài)環(huán)境具有重要意義。