白祥慧

（青海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，青海 西寧 810008）

探索基因在信號(hào)通路中的作用是生命科學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)問(wèn)題之一[1]?；蚯贸夹g(shù)是一種可以驗(yàn)證基因功能的新型技術(shù)手段[2]，是驗(yàn)證基因功能的常用標(biāo)準(zhǔn)[3-4]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為一種新型基因編輯技術(shù)，可以精確、高效地對(duì)基因組進(jìn)行敲除或修飾，可在較短時(shí)間內(nèi)獲得基因敲除突變體，從而更好地完成基因功能的研究[5]。CRISPR/Cas9技術(shù)極大地?cái)U(kuò)展現(xiàn)有模式生物基因操作的可能性，已成為構(gòu)建新動(dòng)物模型必不可少的工具。因此，基因組編輯對(duì)重要農(nóng)業(yè)物種的發(fā)展具有積極作用，如山羊、綿羊、豬和奶牛的育種。使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)可編輯具有復(fù)雜基因組結(jié)構(gòu)的新模式生物[6]。文章綜述近年來(lái)CRISPR/Cas9的應(yīng)用進(jìn)展。

1 CRISPR/Cas9基因敲除作用機(jī)理

CRISPR/Cas9系統(tǒng)由一個(gè)單體蛋白和一個(gè)嵌合RNA組成。序列特異性由gRNA中的20NT序列賦予，裂解由Cas9蛋白介導(dǎo)[7]。CRISPR/Cas9是一種編輯效率較高的新型基因靶向修飾技術(shù)，該技術(shù)可通過(guò)一段sgRNA來(lái)識(shí)別靶位點(diǎn)，利用Cas9蛋白進(jìn)行切割，產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂。真核生物可以通過(guò)非同源末端連接修復(fù)方式和同源重組方式進(jìn)行自我修復(fù)，從而達(dá)到高效的基因編輯效果。CRISPR/Cas9胚胎顯微注射移植法引導(dǎo)Cas9裂解酶裂解相應(yīng)基因，從而刪除外顯子核苷酸，構(gòu)建基因敲除模型。

2 CRISPR/Cas9基因敲除技術(shù)的應(yīng)用

2.1 動(dòng)物模型的構(gòu)建

基因敲除動(dòng)物是指利用基因敲除技術(shù)和胚胎干細(xì)胞技術(shù)制備的某一特定位點(diǎn)基因缺失的動(dòng)物[8]。隨著技術(shù)不斷更新，CRISPR/Cas9基因敲除技術(shù)日趨成熟，為動(dòng)物領(lǐng)域研究提供便利。

馬友才等[9]利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建PDE5基因敲除模型并進(jìn)行表型鑒定，研究PDE5基因在相關(guān)疾病中的生理機(jī)制，為一些疾病的治療及靶向藥物的開(kāi)發(fā)利用提供新思路。黃思嘉等[10]利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)精確編輯雞AMHR2基因。魯國(guó)濤[11]利用CRISPR/Cpf1系統(tǒng)編輯雞DF-1細(xì)胞，為揭示DDX21基因的功能及致病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在人類細(xì)胞中同樣適用，鐮刀型細(xì)胞貧血癥也稱為地中海貧血癥，有研究者利用Cas9編輯技術(shù)修飾sgRNA-RNP，進(jìn)而編輯造血干/祖細(xì)胞（HSPCs）中的HBG1/2啟動(dòng)子，實(shí)現(xiàn)對(duì)β-地中海貧血患者源性熱休克細(xì)胞編輯[12]。

利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建動(dòng)物模型是較常見(jiàn)的操作方法。Ding等[13]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，運(yùn)用顯微注射法將CassnRNA和sgRNAs注射到單細(xì)胞期胚胎中，成功地實(shí)現(xiàn)綿羊MSTN基因的精確基因編輯，結(jié)果顯示，MSTN基因敲除綿羊可以作為理想動(dòng)物模型。龐米米等[14]利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建TLR9基因敲除鼠動(dòng)物模型，研究表明，通過(guò)該技術(shù)成功構(gòu)建TLR9基因敲除動(dòng)物模型，為研究TLR9基因功能和分子機(jī)制提供理想模型。張世陽(yáng)等[15]通過(guò)CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功地獲得Spag6基因編輯的突變體，為進(jìn)一步探討斑馬魚Spag6基因的體內(nèi)功能奠定基礎(chǔ)。

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在人類疾病研究中被廣泛使用。Shalem等[16]使用慢病毒轉(zhuǎn)染人細(xì)胞構(gòu)建CRISPR-Cas9敲除（GeCKO）文庫(kù)，篩選出目標(biāo)基因，進(jìn)行基因編輯，最終證明Cas9具有廣闊的應(yīng)用前景。Platt等[17]為使Cas9在體內(nèi)得到廣泛的應(yīng)用，建立一個(gè)Cre依賴的Cas9敲除小鼠，用于癌癥動(dòng)物模型。

2.2 細(xì)胞系的構(gòu)建

伴隨分子細(xì)胞水平研究的深入，許多難以傳代的細(xì)胞嚴(yán)重影響試驗(yàn)進(jìn)度，影響后續(xù)試驗(yàn)的順利開(kāi)展。因此，構(gòu)建細(xì)胞系迫在眉睫。構(gòu)建細(xì)胞系的方法有多種，而CRISPR/Cas9是其中之一。孫謹(jǐn)?shù)萚18]利用CRISPR/Cas9基因敲除系統(tǒng)，構(gòu)建IL-12p35基因C6細(xì)胞系，為膠質(zhì)腫瘤細(xì)胞的發(fā)生提供理論依據(jù)。有研究表明，利用該技術(shù)手段介導(dǎo)豬相關(guān)細(xì)胞，成功構(gòu)建細(xì)胞系[19]。張紅等[20]利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功構(gòu)建FSTL1基因敲除的SiHa細(xì)胞穩(wěn)定株。李浩可等[21]利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建穩(wěn)定敲除Lrtm1基因的C2C12細(xì)胞系，為研究Lrtm1基因的作用提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。這些細(xì)胞系的構(gòu)建為試驗(yàn)研究提供基礎(chǔ)資料。

2.3 微生物的構(gòu)建

CRISPR/Cas9為細(xì)菌和古細(xì)菌抗噬菌和質(zhì)粒提供分子免疫。蔣成輝等[22]利用CRISPR/Cas9基因敲除技術(shù)成功構(gòu)建耐甲氧西林金黃色葡萄球USA300菌株，闡明金黃色葡萄球菌的作用機(jī)理。楊行堂等[23]運(yùn)用基因敲除技術(shù)建立幽門螺旋桿菌感染的C57BL基因小鼠模型，為相關(guān)研究提供理論依據(jù)。CRISPR/Cas是一種微生物適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，使用RNA引導(dǎo)的核酸酶切割外來(lái)遺傳元素[24-26]。3種類型的CRISPR系統(tǒng)（I-III）已經(jīng)在廣泛的細(xì)菌和古細(xì)菌宿主中被鑒定出來(lái)，其中每個(gè)系統(tǒng)包括一組CRISPR相關(guān)（Cas）基因、非編碼RNA和一系列獨(dú)特的重復(fù)元素（直接重復(fù)）。這些重復(fù)序列由短的可變序列組成[27]，來(lái)自稱為原間隔區(qū)的外源DNA靶點(diǎn)，一起構(gòu)成CRISPR RNA（crRNA）陣列。在DNA靶區(qū)內(nèi)，每個(gè)原間隔區(qū)總是與一個(gè)原間隔區(qū)相鄰基序（PAM）相關(guān)聯(lián)，而PAM的變化取決于特定的CRISPR系統(tǒng)[28-30]。

3 展望

通過(guò)基因敲除技術(shù)逐漸明確大量模式生物和重要功能微生物的全基因組，并能準(zhǔn)確定位功能基因，從基因水平上更加清楚地認(rèn)識(shí)微生物的代謝規(guī)律。同時(shí)，敲除載體及相關(guān)技術(shù)的完善可進(jìn)一步推動(dòng)微生物代謝工程的廣泛應(yīng)用，通過(guò)基因敲除手段改變微生物細(xì)胞的代謝流向，阻斷有害代謝產(chǎn)物積累，有望降低成本，大幅度提高生產(chǎn)水平及產(chǎn)品純度。

近年來(lái)，由于抗生素濫用，多種常見(jiàn)病均出現(xiàn)耐藥性，因此可以嘗試從功能基因角度研究耐藥基因，利用CRISPR/Cas9基因敲除技術(shù)，敲除相應(yīng)基因，進(jìn)而探討耐藥機(jī)制，并開(kāi)發(fā)研制抑制耐藥性、增強(qiáng)抗菌的藥物，也可研制具有預(yù)防和治療作用的功能性食品。利用基因敲除技術(shù)敲除調(diào)控腫瘤的相關(guān)基因，或抑制腫瘤的生長(zhǎng)或促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。基因敲除技術(shù)可以研究基因結(jié)構(gòu)和功能，可應(yīng)用于調(diào)控細(xì)胞周期、疫苗的研發(fā)與制備等領(lǐng)域。由此可見(jiàn)，基因敲除技術(shù)具有廣闊的發(fā)展前景。