氮肥對鎘脅迫下龍葵葉綠素含量和葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊?/h1>
2021-12-11 04:36唐星林劉光正
西南林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) 2021年6期
唐星林 劉 斌 劉光正 王 莉 嚴(yán) 晶
（江西省林業(yè)科學(xué)院，江西 南昌 330032）
土壤重金屬污染是我國面臨的主要環(huán)境問題之一[1]?！度珖寥牢廴緺顩r調(diào)查公報(bào)》[2]顯示我國土壤總的點(diǎn)位超標(biāo)率為16.1%，其中，鎘（Cd）的點(diǎn)位超標(biāo)率高達(dá)7.0%。土壤Cd易被植物吸收，并通過食物鏈傳遞給人或者動物，嚴(yán)重威脅著人類的健康[3]。Cd是植物非必需元素，其生物毒性很強(qiáng)[4]。研究表明，Cd脅迫會損害植物器官，抑制植物生長[5]。植物體內(nèi)Cd過量積累會破壞生物膜[6]，影響植物體內(nèi)各種酶的活性[7]。Cd脅迫還會導(dǎo)致植物葉綠素含量、光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）量子轉(zhuǎn)化效率、電子傳遞速率等降低，光合作用受到抑制，最終導(dǎo)致植物生物量下降[8]。氮素是植物生長所必需的大量元素。研究表明，Cd脅迫會減少植物對氮、磷等營養(yǎng)元素的吸收[9]，而增施氮肥可以增強(qiáng)植物對Cd脅迫的抗性[10]。研究表明：合理施用氮肥能有效提高Cd脅迫下植物葉綠素含量，保護(hù)葉綠體結(jié)構(gòu)，防止葉片出現(xiàn)失綠癥[11-13]；以增大PSⅡ反應(yīng)中心光化學(xué)效率和電子傳遞速率[14-15]，增強(qiáng)光合作用；進(jìn)而緩解Cd對植物的毒害，提高植物生物量和Cd積累量[16]。此外，人們發(fā)現(xiàn)Cd脅迫下低中氮處理能有效提高葉綠素含量和PSⅡ?qū)嶋H光化學(xué)量子產(chǎn)量，但高氮處理沒有顯著的促進(jìn)作用[17]。這說明氮肥對Cd脅迫的緩解作用還與氮肥施用濃度有關(guān)。
龍葵（Solanum nigrum）為茄科（Solanaceae）茄屬（Solanum）多年生草本植物，是我國發(fā)現(xiàn)的Cd超積累植物，具有生物量大、適于刈割等特性，是實(shí)施土壤重金屬植物修復(fù)的優(yōu)良材料[18]。研究表明，氮肥對Cd脅迫下龍葵生長、抗氧化系統(tǒng)和Cd積累等均有顯著促進(jìn)作用[16,19]。光合生理是植物最重要的生理活動之一，研究施氮對Cd脅迫下龍葵光合生理的影響，可以更好地揭示氮肥在植物緩解Cd毒害過程中的作用。但Cd脅迫下施氮對龍葵葉綠素含量和PSⅡ功能的影響仍不清楚。葉綠素?zé)晒鈪?shù)可以反映逆境脅迫下葉片PSⅡ功能的改變情況，是研究植物光合生理特性與逆境脅迫關(guān)系的內(nèi)在探針[20]。捕光色素分子內(nèi)稟特性決定了葉片對光能的吸收、激發(fā)和轉(zhuǎn)換等過程，可以反映葉片對光能的吸收與利用，同一植物在不同環(huán)境條件下具有不同的內(nèi)稟特性[21]。為此，本研究以龍葵為試驗(yàn)材料，分析不同濃度氮添加對Cd脅迫下龍葵葉綠素含量、葉綠素?zé)晒馓匦院筒豆馍胤肿觾?nèi)稟特性等的影響，得出適宜的氮肥施用濃度，為進(jìn)一步利用龍葵修復(fù)Cd污染土壤提供參考依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 供試土壤
供試土壤為黃壤，取自江西省林業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)基地，取土深度為0～20 cm。土壤風(fēng)干、磨碎并過5 mm篩。將黃壤和泥炭按質(zhì)量比1∶1均勻混合成試驗(yàn)種植土，其基本理化性質(zhì)為pH值5.75、水解性氮53.7 mg/kg、有效磷95.0 mg/kg、速效鉀110.0 mg/kg、有機(jī)質(zhì)75.58 mg/kg。
1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)
試驗(yàn)在江西省林業(yè)科學(xué)院科研大棚內(nèi)進(jìn)行。參考江西省農(nóng)用土壤Cd污染現(xiàn)狀[22]和魏朵花等[15]的研究進(jìn)行Cd脅迫和施氮處理，采用完全隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共設(shè)置5個(gè)處理（見表1）。其中，Cd濃度以Cd2+計(jì)。按設(shè)定濃度將重金屬Cd2+以CdCl2·2H2O形式拌入種植土，并施入不同濃度的CO（NH2）2，充分混勻，平衡18 d后裝入塑料花盆（上口徑18 cm、下口徑13 cm、高15 cm）。2019年5月28號，將飽滿的龍葵種子用10 g/L KNO3溶液浸泡24 h，超純水沖洗干凈，播種于育苗穴盤中，育苗基質(zhì)為泥炭，放置于江西省林業(yè)科學(xué)院科研大棚（28°45′N, 115°49′E）。待幼苗長出5片真葉后（萌發(fā)后20 d），選擇長勢一致的幼苗移栽到塑料花盆中進(jìn)行試驗(yàn)處理，單株定植，每個(gè)處理重復(fù)6盆。在盆下放置塑料托盤，將滲漏液倒回盆中，防止污染物和營養(yǎng)物質(zhì)損失。進(jìn)行日常養(yǎng)護(hù)管理，試驗(yàn)期間不追施任何肥料。
表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Experimantal design mg/kg
1.3 試驗(yàn)方法
1.3.1 葉片色素含量的測定
葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定結(jié)束后，取植物葉片，擦拭干凈，采用打孔法測定葉片色素含量[23]。
1.3.2 葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定
葉綠素?zé)晒鈪?shù)采用便攜式脈沖調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨xPAM?2500（Walz，德國）測定。在Cd脅迫和施氮處理35 d后選取植株頂部生長旺盛的全展葉，測定其熒光誘導(dǎo)動力學(xué)參數(shù)。先將葉片暗適應(yīng)30 min以上，打開測量光（小于1 μmol/(m2·s)）測定初始熒光（Fo），再在飽和脈沖（脈沖強(qiáng)度為10 000 μmol/(m2·s)，脈沖時(shí)間0.8 s）激發(fā)下測定最大熒光（Fm）。隨后，葉片在光化光（光強(qiáng)為1 160 μmol/(m2·s)）照射5 min以上，采用內(nèi)置程序?qū)⒐饣夤夂嫌行л椛洌≒AR）梯度設(shè)置為1 160、1 663、785、619、363、271、141、101、64、31、6 μmol/(m2·s)，測定光下穩(wěn)態(tài)熒光（Fs）、光下最大熒光（Fm′）和光下最小熒光（Fo′），每個(gè)光化光梯度照射30 s。計(jì)算參數(shù)：PSⅡ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量（Fv/Fm）、PSⅡ有效光化學(xué)量子產(chǎn)量（Fv′/Fm′）、光化學(xué)淬滅系數(shù)（qP）、非光化學(xué)淬滅系數(shù)（NPQ）和電子傳遞速率（ETR）、天線熱耗散（D）、光化學(xué)反應(yīng)耗散（PH）和非光化學(xué)反應(yīng)耗散（E）[24-25]。每個(gè)處理隨機(jī)選擇3株進(jìn)行測定。
1.3.3 光合電子流對光響應(yīng)的機(jī)理模型模擬
利用光合電子流機(jī)理模型擬合龍葵光合電子流對光響應(yīng)的曲線，得出初始斜率（a）、最大電子傳遞速率（ETRmax）和飽和光強(qiáng)（PARsat），以及描述捕光色素分子物理特性的參數(shù)（捕光色素分子數(shù)（N0）、處于最低激發(fā)態(tài)的捕光色素分子數(shù)（Nk）、捕光色素分子本征光能吸收截面（σik）、捕光色素分子有效光能吸收截面（σik′）），模型的擬合效果用決定系數(shù)（R2）表示[26-27]。
1.4 分析方法
光合電子流對光的響應(yīng)曲線基于光合計(jì)算平臺（http://photosynthetic.sinaapp.com/）進(jìn)行處理。采用單因素方差分析和Tukey HSD法對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和差異顯著性檢驗(yàn)（P<0.05）。數(shù)據(jù)處理和作圖由R語言（R?3.5.1）完成。圖和表中的數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。
2 結(jié)果與分析
2.1 不同施氮量對Cd脅迫下龍葵葉片色素含量的影響
由表2可知，與CK相比，Cd脅迫下龍葵葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量和N0無顯著變化，但均有下降趨勢。Cd脅迫下龍葵σik顯著大于CK（P<0.05）。與CdN0相比，CdN1、CdN2和CdN3龍葵葉綠素a含量分別顯著增大了52.5%、87.6%和102.2%（P<0.05），葉綠素b含量分別顯著增大了60.5%、92.0%和105.8%（P<0.05），類胡蘿卜素含量分別顯著增大了53.2%、83.3%和91.6%（P<0.05），N0分別顯著增大了68.9%、137.4%和94.5%，σik分別顯著減少了37.3%、52.1%和58.7%（P<0.05）。龍葵葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量、N0、σik在CdN2與CdN3處理間無顯著差異。這說明Cd脅迫下增施氮肥對龍葵葉片色素含量和捕光色素分子數(shù)有顯著的促進(jìn)作用。
表2 氮肥對Cd脅迫下龍葵葉片色素含量的影響Table 2 Effects of nitrogen supply on pigment contents of S. nigrum under cadmium stress
2.2 氮肥對Cd脅迫下龍葵葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響
表3中光下葉綠素?zé)晒鈪?shù)均采用1 663 μmol/(m2·s) PAR下測定的數(shù)據(jù)。與CK相比，Cd脅迫下龍葵Fv/Fm、Fv′/Fm′和ETR無顯著變化，但均有下降趨勢。CdN2、CdN3處理下龍葵Fv/Fm、Fv′/Fm′顯著大于CdN0（P<0.05），NPQ顯著小于CdN0（P<0.05）。CdN3處理下龍葵qP顯著大于CdN0（P<0.05）。不同處理間ETR的大小順序?yàn)镃dN3>CdN2>CdN1>CdN0、CK（P<0.05）。Cd龍葵Fv/Fm、Fv′/Fm′、qP、NPQ在CdN2與CdN3處理間（或CdN1與CdN0處理間）均無顯著差異。
表3 氮肥對Cd脅迫下龍葵葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響Table 3 Effects of nitrogen supply on chlorophyll fluorescence parameters of S. nigrum under cadmium stress
2.3 氮肥對Cd脅迫下龍葵快速光曲線的影響
由圖1可知，不同處理下龍葵葉片ETR隨PAR的增大而逐漸增大。當(dāng)PAR<800 μmol/(m2·s)時(shí)，ETR幾乎呈線性增加，當(dāng)PAR>800 μmol/(m2·s)時(shí)，ETR呈緩慢增大。當(dāng)PAR<141 μmol/(m2·s)時(shí)，不同處理間ETR差異不顯著。當(dāng)PAR>141 μmol/(m2·s)時(shí)，Cd脅迫下施氮處理ETR顯著大于CK和CdN0處理（P<0.05）。
圖1 Cd脅迫下增施氮肥龍葵ETR光響應(yīng)曲線Fig. 1 Light-response curves of ETR in S. nigrum under cadmium stress by supplement nitrogen
由表4可知，龍葵a、ETRmax和PARsat在不同處理間均存在顯著差異（P<0.05）。與CK相比，Cd脅迫下龍葵ETRmax和PARsat無顯著變化，但均有所減小。不同處理間a的大小順序?yàn)镃K、CdN0、CdN1>CdN2>CdN3，ETRmax的大小順序?yàn)镃dN3>CdN2>CdN1>CdN0、CK。CdN3的PARsat顯著大于CdN0（P<0.05）。
表4 氮肥對Cd脅迫下龍葵葉片a、ETRmax和PARsat光合參數(shù)的影響Table 4 Effects of nitrogen supply on a, ETRmax, and PARsat of S. nigrum under cadmium stress
2.4 氮肥對Cd脅迫下龍葵捕光色素分子內(nèi)稟特性的影響
由圖2可知，隨PAR的增大，不同處理下龍葵葉片Nk逐漸增大，σik′逐漸減小。與CK相比，Cd脅迫下Nk有增大趨勢，σik′有減小趨勢。Cd脅迫下增施氮肥導(dǎo)致Nk增大，σik′減小。CdN2的Nk高于CdN1、CdN3。CdN3的σik′低于CdN1、CdN2。
圖2 Cd脅迫下增施氮肥龍葵葉片Nk和σik′的光響應(yīng)曲線Fig. 2 Light-response curves of Nk and σik′ for S. nigrum under cadmium stress by supplement nitrogen
2.5 葉片吸收光能的分配
由圖3可知，隨著PAR的增加，不同處理龍葵葉片D和E分別從（26.8%～30.3%）、（0.6%～3.4%）增加到（40.2%～53.7%）、（33.7%～39.3%），PH從（12.6%～23.2%）減小到（69.0%～70.2%）。PAR≤363 μmol/(m2·s)時(shí)不同處理下龍葵葉片吸收光能的分配均表現(xiàn)為PH>D>E，當(dāng)PAR≥1 160 μmol/(m2·s)時(shí)表現(xiàn)為D>E>PH。當(dāng)PAR=619 μmol/(m2·s)時(shí)，CK、CdN0和CdN1處理表現(xiàn)為D>PH>E，CdN2和CdN3處理為PH>D>E。
圖3 Cd脅迫下增施氮肥龍葵葉片D、PH和E的光響應(yīng)變化Fig. 3 Light-response curves of thermal energy dissipation, photochemical reaction and non-photochemical energy dissipation in S. nigrum under cadmium stress by supplement nitrogen
表5所示為飽和光強(qiáng)下龍葵葉片吸收光能的分配情況。在1 663 μmol/(m2·s) PAR下，龍葵葉片吸收的光能有40.0%～53.7%用于天線熱耗散，12.6%～23.2%用于光化學(xué)反應(yīng)，33.7%～39.3%用于非光化學(xué)反應(yīng)。在1 663 μmol/(m2·s) PAR下，龍葵D和PH在不同處理間差異顯著（P<0.05），E無顯著差異。與CK相比，Cd脅迫下龍葵D、PH和E無顯著變化，但D有增大趨勢，PH和E有減小趨勢。CdN2、CdN3處理下龍葵D顯著小于CdN0（P<0.05）。不同處理間PH的大小順序?yàn)镃dN3>CdN2>CdN1>CdN0、CK（P<0.05）。
表 5 氮肥對Cd脅迫下龍葵葉片吸收光能分配的影響Table 5 Effects of nitrogen supply on distribution of absorbed light energy in S. nigrum under cadmium stress
3 結(jié)論與討論
光合色素是葉片進(jìn)行光合作用所必需的物質(zhì)，主要包括葉綠素和類胡蘿卜素。其中，葉綠素在光能的吸收、傳遞和轉(zhuǎn)化過程中起主導(dǎo)作用，類胡蘿卜素則參與光能捕獲和光破壞防御過程[28]。重金屬脅迫會抑制葉片光合色素的合成，進(jìn)而影響植物光合作用[29]。本研究發(fā)現(xiàn)Cd脅迫下龍葵葉綠素和類胡蘿卜素含量均呈現(xiàn)下降趨勢，這與蒼耳（Xanthium sibiricum）[30]和洋常春藤（Hedera helix）[20]等植物的研究結(jié)果類似。對Cd脅迫導(dǎo)致葉片色素含量下降的原因，主要有3種觀點(diǎn)：一是Cd脅迫影響Fe、Zn、Mg等營養(yǎng)元素的吸收，Cd2+取代葉綠素中的Mg2+而導(dǎo)致葉綠素破壞[31-32]；二是Cd脅迫抑制葉綠素合成酶活性，增大葉綠素降解酶活性[33-34]；三是Cd抑制了葉綠素合成前體物氨基乙酰丙酸（ALA）的合成[32]。研究表明，Cd脅迫下增施氮肥后，龍葵葉綠素和類胡蘿卜素含量顯著增加，這與結(jié)縷草（Zoysia japonica）[16]和小麥（Triticum aestivum）[12]等植物的研究結(jié)果一致。氮素能有效促進(jìn)葉片色素的合成[35]，這可以平衡Cd脅迫對葉片色素的抑制作用。張帆等認(rèn)為Cd脅迫下增施氮肥可以解除Cd對葉綠素合成的抑制[13]。這說明增施氮肥可能通過促進(jìn)葉綠素合成來提高龍葵的抗Cd能力。
PSⅡ反應(yīng)中心是一個(gè)對重金屬脅迫比較敏感的光合機(jī)構(gòu)[36]，葉綠素?zé)晒鈪?shù)可以反映重金屬脅迫對PSⅡ光合活性及電子傳遞等功能的影響[37]。有研究表明，Cd脅迫會抑制葉片PSⅡ光化學(xué)功能[38]，而氮素有助于提高PSⅡ的光化學(xué)活性[39]。Fv/Fm可以反映植物是否受到逆境脅迫。本研究表明，Cd脅迫下龍葵葉片F(xiàn)v/Fm呈下降趨勢，說明龍葵受到一定程度的Cd脅迫。而Cd脅迫下增施氮肥使得龍葵Fv/Fm顯著增大，這說明施氮可以有效緩解Cd對龍葵的脅迫作用。Fv′/Fm′反映開放的PSⅡ反應(yīng)中心原初光能捕獲效率，NPQ反映PSⅡ天線色素吸收的光能以熱能形式耗散的部分，對光合機(jī)構(gòu)起保護(hù)作用[25]。本研究發(fā)現(xiàn)Cd脅迫下龍葵葉片F(xiàn)v′/Fm′、ETR下降，NPQ增大，說明Cd脅迫下龍葵葉片PSⅡ光合反應(yīng)中心實(shí)際量子產(chǎn)量下降，PSⅡ向PSI的電子傳遞受阻，使得同化力（NADPH和ATP）形成受阻，PSⅡ過剩光能增加，非光化學(xué)淬滅保護(hù)機(jī)制發(fā)揮作用，這與紫花香薷（Elsholtzia argyi）[40]和結(jié)縷草[16]等植物的研究結(jié)果一致。而Cd脅迫下增施氮肥后龍葵Fv′/Fm′、ETR上升，NPQ減小，說明氮肥能有效緩解Cd脅迫對PSⅡ功能的影響，提高葉片光能捕獲效率和電子傳遞速率，增加同化力（NADPH和ATP）的形成，為固碳反應(yīng)提供更多的能量，進(jìn)而增強(qiáng)對Cd毒害的抵抗能力。
葉片的光能吸收能力同時(shí)受N0、σik和σik′的影響，其中，光能吸收截面反映捕光色素分子吸收光子的能力[26]。葉片捕光色素分子在吸收光能后會從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)的捕光色素分子通過光化學(xué)反應(yīng)、葉綠素?zé)晒夂蜔崮艿?種方式退回基態(tài)[41]。因此，處于激發(fā)態(tài)的捕光色素分子越多，處于基態(tài)的捕光色素分子就越少，不利于葉片光能的吸收[26]。本研究發(fā)現(xiàn)Cd脅迫下龍葵N0、Nk減小，σik、σik′增大，說明Cd脅迫下龍葵在捕光色素分子總數(shù)下降的情況下，可以通過增大捕光色素分子光子吸收能力和處于基態(tài)的捕光色素分子的比例來提高植物對光能的吸收。而Cd脅迫下增施氮肥使得龍葵N0、Nk增大，σik和σik′減小。這可能是由于Cd脅迫下施氮使得捕光色素分子總數(shù)增大，植物通過減小其捕光色素分子光能吸收能力和處于基態(tài)的捕光色素分子數(shù)的比例，以防止葉片吸收過量光能。葉片吸收光能的3個(gè)耗散途徑為D、PH和E[21]。D是指植物用于光合生化反應(yīng)的能量。其余過剩的光能主要通過PH和E來消耗，防止其對光合機(jī)構(gòu)的破壞[42]。有研究表明，Cd脅迫使得楨楠幼樹E增大，D和PH減少[42]。本研究發(fā)現(xiàn)Cd脅迫下龍葵D有增大趨勢，PH和E有減小趨勢，而增施氮肥后D顯著減小，PH顯著增大。其中，光化學(xué)耗散能量增大可能與葉綠素含量、Fv′/Fm′和ETR等的增大有關(guān)，說明Cd脅迫下增施氮肥有利于提高葉片吸收光能用于光化學(xué)反應(yīng)的比例，增大葉片吸收光能的利用效率。
綜上所述，增施氮肥有助于提高Cd脅迫下龍葵葉片葉綠素含量、捕光色素分子總數(shù)、Fv/Fm、Fv′/Fm′、ETR、Nk和PH等光合生理指標(biāo)，緩解Cd脅迫對PSⅡ功能和吸收光能分配的影響，進(jìn)而增強(qiáng)龍葵對Cd脅迫的抗性，而且施加300 mg/kg CO(NH2)2對Cd脅迫下龍葵葉綠素合成和PSⅡ功能的促進(jìn)作用大于施加150 mg/kg CO(NH2)2，但與施加450 mg/kg CO(NH2)2無明顯差異，因此，300～450 mg/kg CO(NH2)2是合適的施氮濃度，為進(jìn)一步揭示氮肥對Cd脅迫下龍葵光合生理的影響機(jī)制及Cd污染土壤的治理實(shí)踐提供參考。
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（江西省林業(yè)科學(xué)院，江西 南昌 330032）
土壤重金屬污染是我國面臨的主要環(huán)境問題之一[1]?！度珖寥牢廴緺顩r調(diào)查公報(bào)》[2]顯示我國土壤總的點(diǎn)位超標(biāo)率為16.1%，其中，鎘（Cd）的點(diǎn)位超標(biāo)率高達(dá)7.0%。土壤Cd易被植物吸收，并通過食物鏈傳遞給人或者動物，嚴(yán)重威脅著人類的健康[3]。Cd是植物非必需元素，其生物毒性很強(qiáng)[4]。研究表明，Cd脅迫會損害植物器官，抑制植物生長[5]。植物體內(nèi)Cd過量積累會破壞生物膜[6]，影響植物體內(nèi)各種酶的活性[7]。Cd脅迫還會導(dǎo)致植物葉綠素含量、光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）量子轉(zhuǎn)化效率、電子傳遞速率等降低，光合作用受到抑制，最終導(dǎo)致植物生物量下降[8]。氮素是植物生長所必需的大量元素。研究表明，Cd脅迫會減少植物對氮、磷等營養(yǎng)元素的吸收[9]，而增施氮肥可以增強(qiáng)植物對Cd脅迫的抗性[10]。研究表明：合理施用氮肥能有效提高Cd脅迫下植物葉綠素含量，保護(hù)葉綠體結(jié)構(gòu)，防止葉片出現(xiàn)失綠癥[11-13]；以增大PSⅡ反應(yīng)中心光化學(xué)效率和電子傳遞速率[14-15]，增強(qiáng)光合作用；進(jìn)而緩解Cd對植物的毒害，提高植物生物量和Cd積累量[16]。此外，人們發(fā)現(xiàn)Cd脅迫下低中氮處理能有效提高葉綠素含量和PSⅡ?qū)嶋H光化學(xué)量子產(chǎn)量，但高氮處理沒有顯著的促進(jìn)作用[17]。這說明氮肥對Cd脅迫的緩解作用還與氮肥施用濃度有關(guān)。
龍葵（Solanum nigrum）為茄科（Solanaceae）茄屬（Solanum）多年生草本植物，是我國發(fā)現(xiàn)的Cd超積累植物，具有生物量大、適于刈割等特性，是實(shí)施土壤重金屬植物修復(fù)的優(yōu)良材料[18]。研究表明，氮肥對Cd脅迫下龍葵生長、抗氧化系統(tǒng)和Cd積累等均有顯著促進(jìn)作用[16,19]。光合生理是植物最重要的生理活動之一，研究施氮對Cd脅迫下龍葵光合生理的影響，可以更好地揭示氮肥在植物緩解Cd毒害過程中的作用。但Cd脅迫下施氮對龍葵葉綠素含量和PSⅡ功能的影響仍不清楚。葉綠素?zé)晒鈪?shù)可以反映逆境脅迫下葉片PSⅡ功能的改變情況，是研究植物光合生理特性與逆境脅迫關(guān)系的內(nèi)在探針[20]。捕光色素分子內(nèi)稟特性決定了葉片對光能的吸收、激發(fā)和轉(zhuǎn)換等過程，可以反映葉片對光能的吸收與利用，同一植物在不同環(huán)境條件下具有不同的內(nèi)稟特性[21]。為此，本研究以龍葵為試驗(yàn)材料，分析不同濃度氮添加對Cd脅迫下龍葵葉綠素含量、葉綠素?zé)晒馓匦院筒豆馍胤肿觾?nèi)稟特性等的影響，得出適宜的氮肥施用濃度，為進(jìn)一步利用龍葵修復(fù)Cd污染土壤提供參考依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 供試土壤
供試土壤為黃壤，取自江西省林業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)基地，取土深度為0～20 cm。土壤風(fēng)干、磨碎并過5 mm篩。將黃壤和泥炭按質(zhì)量比1∶1均勻混合成試驗(yàn)種植土，其基本理化性質(zhì)為pH值5.75、水解性氮53.7 mg/kg、有效磷95.0 mg/kg、速效鉀110.0 mg/kg、有機(jī)質(zhì)75.58 mg/kg。
1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)
試驗(yàn)在江西省林業(yè)科學(xué)院科研大棚內(nèi)進(jìn)行。參考江西省農(nóng)用土壤Cd污染現(xiàn)狀[22]和魏朵花等[15]的研究進(jìn)行Cd脅迫和施氮處理，采用完全隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共設(shè)置5個(gè)處理（見表1）。其中，Cd濃度以Cd2+計(jì)。按設(shè)定濃度將重金屬Cd2+以CdCl2·2H2O形式拌入種植土，并施入不同濃度的CO（NH2）2，充分混勻，平衡18 d后裝入塑料花盆（上口徑18 cm、下口徑13 cm、高15 cm）。2019年5月28號，將飽滿的龍葵種子用10 g/L KNO3溶液浸泡24 h，超純水沖洗干凈，播種于育苗穴盤中，育苗基質(zhì)為泥炭，放置于江西省林業(yè)科學(xué)院科研大棚（28°45′N, 115°49′E）。待幼苗長出5片真葉后（萌發(fā)后20 d），選擇長勢一致的幼苗移栽到塑料花盆中進(jìn)行試驗(yàn)處理，單株定植，每個(gè)處理重復(fù)6盆。在盆下放置塑料托盤，將滲漏液倒回盆中，防止污染物和營養(yǎng)物質(zhì)損失。進(jìn)行日常養(yǎng)護(hù)管理，試驗(yàn)期間不追施任何肥料。
表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Experimantal design mg/kg
1.3 試驗(yàn)方法
1.3.1 葉片色素含量的測定
葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定結(jié)束后，取植物葉片，擦拭干凈，采用打孔法測定葉片色素含量[23]。
1.3.2 葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定
葉綠素?zé)晒鈪?shù)采用便攜式脈沖調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨xPAM?2500（Walz，德國）測定。在Cd脅迫和施氮處理35 d后選取植株頂部生長旺盛的全展葉，測定其熒光誘導(dǎo)動力學(xué)參數(shù)。先將葉片暗適應(yīng)30 min以上，打開測量光（小于1 μmol/(m2·s)）測定初始熒光（Fo），再在飽和脈沖（脈沖強(qiáng)度為10 000 μmol/(m2·s)，脈沖時(shí)間0.8 s）激發(fā)下測定最大熒光（Fm）。隨后，葉片在光化光（光強(qiáng)為1 160 μmol/(m2·s)）照射5 min以上，采用內(nèi)置程序?qū)⒐饣夤夂嫌行л椛洌≒AR）梯度設(shè)置為1 160、1 663、785、619、363、271、141、101、64、31、6 μmol/(m2·s)，測定光下穩(wěn)態(tài)熒光（Fs）、光下最大熒光（Fm′）和光下最小熒光（Fo′），每個(gè)光化光梯度照射30 s。計(jì)算參數(shù)：PSⅡ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量（Fv/Fm）、PSⅡ有效光化學(xué)量子產(chǎn)量（Fv′/Fm′）、光化學(xué)淬滅系數(shù)（qP）、非光化學(xué)淬滅系數(shù)（NPQ）和電子傳遞速率（ETR）、天線熱耗散（D）、光化學(xué)反應(yīng)耗散（PH）和非光化學(xué)反應(yīng)耗散（E）[24-25]。每個(gè)處理隨機(jī)選擇3株進(jìn)行測定。
1.3.3 光合電子流對光響應(yīng)的機(jī)理模型模擬
利用光合電子流機(jī)理模型擬合龍葵光合電子流對光響應(yīng)的曲線，得出初始斜率（a）、最大電子傳遞速率（ETRmax）和飽和光強(qiáng)（PARsat），以及描述捕光色素分子物理特性的參數(shù)（捕光色素分子數(shù)（N0）、處于最低激發(fā)態(tài)的捕光色素分子數(shù)（Nk）、捕光色素分子本征光能吸收截面（σik）、捕光色素分子有效光能吸收截面（σik′）），模型的擬合效果用決定系數(shù)（R2）表示[26-27]。
1.4 分析方法
光合電子流對光的響應(yīng)曲線基于光合計(jì)算平臺（http://photosynthetic.sinaapp.com/）進(jìn)行處理。采用單因素方差分析和Tukey HSD法對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和差異顯著性檢驗(yàn)（P<0.05）。數(shù)據(jù)處理和作圖由R語言（R?3.5.1）完成。圖和表中的數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。
2 結(jié)果與分析
2.1 不同施氮量對Cd脅迫下龍葵葉片色素含量的影響
由表2可知，與CK相比，Cd脅迫下龍葵葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量和N0無顯著變化，但均有下降趨勢。Cd脅迫下龍葵σik顯著大于CK（P<0.05）。與CdN0相比，CdN1、CdN2和CdN3龍葵葉綠素a含量分別顯著增大了52.5%、87.6%和102.2%（P<0.05），葉綠素b含量分別顯著增大了60.5%、92.0%和105.8%（P<0.05），類胡蘿卜素含量分別顯著增大了53.2%、83.3%和91.6%（P<0.05），N0分別顯著增大了68.9%、137.4%和94.5%，σik分別顯著減少了37.3%、52.1%和58.7%（P<0.05）。龍葵葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量、N0、σik在CdN2與CdN3處理間無顯著差異。這說明Cd脅迫下增施氮肥對龍葵葉片色素含量和捕光色素分子數(shù)有顯著的促進(jìn)作用。
表2 氮肥對Cd脅迫下龍葵葉片色素含量的影響Table 2 Effects of nitrogen supply on pigment contents of S. nigrum under cadmium stress
2.2 氮肥對Cd脅迫下龍葵葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響
表3中光下葉綠素?zé)晒鈪?shù)均采用1 663 μmol/(m2·s) PAR下測定的數(shù)據(jù)。與CK相比，Cd脅迫下龍葵Fv/Fm、Fv′/Fm′和ETR無顯著變化，但均有下降趨勢。CdN2、CdN3處理下龍葵Fv/Fm、Fv′/Fm′顯著大于CdN0（P<0.05），NPQ顯著小于CdN0（P<0.05）。CdN3處理下龍葵qP顯著大于CdN0（P<0.05）。不同處理間ETR的大小順序?yàn)镃dN3>CdN2>CdN1>CdN0、CK（P<0.05）。Cd龍葵Fv/Fm、Fv′/Fm′、qP、NPQ在CdN2與CdN3處理間（或CdN1與CdN0處理間）均無顯著差異。
表3 氮肥對Cd脅迫下龍葵葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響Table 3 Effects of nitrogen supply on chlorophyll fluorescence parameters of S. nigrum under cadmium stress
2.3 氮肥對Cd脅迫下龍葵快速光曲線的影響
由圖1可知，不同處理下龍葵葉片ETR隨PAR的增大而逐漸增大。當(dāng)PAR<800 μmol/(m2·s)時(shí)，ETR幾乎呈線性增加，當(dāng)PAR>800 μmol/(m2·s)時(shí)，ETR呈緩慢增大。當(dāng)PAR<141 μmol/(m2·s)時(shí)，不同處理間ETR差異不顯著。當(dāng)PAR>141 μmol/(m2·s)時(shí)，Cd脅迫下施氮處理ETR顯著大于CK和CdN0處理（P<0.05）。
圖1 Cd脅迫下增施氮肥龍葵ETR光響應(yīng)曲線Fig. 1 Light-response curves of ETR in S. nigrum under cadmium stress by supplement nitrogen
由表4可知，龍葵a、ETRmax和PARsat在不同處理間均存在顯著差異（P<0.05）。與CK相比，Cd脅迫下龍葵ETRmax和PARsat無顯著變化，但均有所減小。不同處理間a的大小順序?yàn)镃K、CdN0、CdN1>CdN2>CdN3，ETRmax的大小順序?yàn)镃dN3>CdN2>CdN1>CdN0、CK。CdN3的PARsat顯著大于CdN0（P<0.05）。
表4 氮肥對Cd脅迫下龍葵葉片a、ETRmax和PARsat光合參數(shù)的影響Table 4 Effects of nitrogen supply on a, ETRmax, and PARsat of S. nigrum under cadmium stress
2.4 氮肥對Cd脅迫下龍葵捕光色素分子內(nèi)稟特性的影響
由圖2可知，隨PAR的增大，不同處理下龍葵葉片Nk逐漸增大，σik′逐漸減小。與CK相比，Cd脅迫下Nk有增大趨勢，σik′有減小趨勢。Cd脅迫下增施氮肥導(dǎo)致Nk增大，σik′減小。CdN2的Nk高于CdN1、CdN3。CdN3的σik′低于CdN1、CdN2。
圖2 Cd脅迫下增施氮肥龍葵葉片Nk和σik′的光響應(yīng)曲線Fig. 2 Light-response curves of Nk and σik′ for S. nigrum under cadmium stress by supplement nitrogen
2.5 葉片吸收光能的分配
由圖3可知，隨著PAR的增加，不同處理龍葵葉片D和E分別從（26.8%～30.3%）、（0.6%～3.4%）增加到（40.2%～53.7%）、（33.7%～39.3%），PH從（12.6%～23.2%）減小到（69.0%～70.2%）。PAR≤363 μmol/(m2·s)時(shí)不同處理下龍葵葉片吸收光能的分配均表現(xiàn)為PH>D>E，當(dāng)PAR≥1 160 μmol/(m2·s)時(shí)表現(xiàn)為D>E>PH。當(dāng)PAR=619 μmol/(m2·s)時(shí)，CK、CdN0和CdN1處理表現(xiàn)為D>PH>E，CdN2和CdN3處理為PH>D>E。
圖3 Cd脅迫下增施氮肥龍葵葉片D、PH和E的光響應(yīng)變化Fig. 3 Light-response curves of thermal energy dissipation, photochemical reaction and non-photochemical energy dissipation in S. nigrum under cadmium stress by supplement nitrogen
表5所示為飽和光強(qiáng)下龍葵葉片吸收光能的分配情況。在1 663 μmol/(m2·s) PAR下，龍葵葉片吸收的光能有40.0%～53.7%用于天線熱耗散，12.6%～23.2%用于光化學(xué)反應(yīng)，33.7%～39.3%用于非光化學(xué)反應(yīng)。在1 663 μmol/(m2·s) PAR下，龍葵D和PH在不同處理間差異顯著（P<0.05），E無顯著差異。與CK相比，Cd脅迫下龍葵D、PH和E無顯著變化，但D有增大趨勢，PH和E有減小趨勢。CdN2、CdN3處理下龍葵D顯著小于CdN0（P<0.05）。不同處理間PH的大小順序?yàn)镃dN3>CdN2>CdN1>CdN0、CK（P<0.05）。
表 5 氮肥對Cd脅迫下龍葵葉片吸收光能分配的影響Table 5 Effects of nitrogen supply on distribution of absorbed light energy in S. nigrum under cadmium stress
3 結(jié)論與討論
光合色素是葉片進(jìn)行光合作用所必需的物質(zhì)，主要包括葉綠素和類胡蘿卜素。其中，葉綠素在光能的吸收、傳遞和轉(zhuǎn)化過程中起主導(dǎo)作用，類胡蘿卜素則參與光能捕獲和光破壞防御過程[28]。重金屬脅迫會抑制葉片光合色素的合成，進(jìn)而影響植物光合作用[29]。本研究發(fā)現(xiàn)Cd脅迫下龍葵葉綠素和類胡蘿卜素含量均呈現(xiàn)下降趨勢，這與蒼耳（Xanthium sibiricum）[30]和洋常春藤（Hedera helix）[20]等植物的研究結(jié)果類似。對Cd脅迫導(dǎo)致葉片色素含量下降的原因，主要有3種觀點(diǎn)：一是Cd脅迫影響Fe、Zn、Mg等營養(yǎng)元素的吸收，Cd2+取代葉綠素中的Mg2+而導(dǎo)致葉綠素破壞[31-32]；二是Cd脅迫抑制葉綠素合成酶活性，增大葉綠素降解酶活性[33-34]；三是Cd抑制了葉綠素合成前體物氨基乙酰丙酸（ALA）的合成[32]。研究表明，Cd脅迫下增施氮肥后，龍葵葉綠素和類胡蘿卜素含量顯著增加，這與結(jié)縷草（Zoysia japonica）[16]和小麥（Triticum aestivum）[12]等植物的研究結(jié)果一致。氮素能有效促進(jìn)葉片色素的合成[35]，這可以平衡Cd脅迫對葉片色素的抑制作用。張帆等認(rèn)為Cd脅迫下增施氮肥可以解除Cd對葉綠素合成的抑制[13]。這說明增施氮肥可能通過促進(jìn)葉綠素合成來提高龍葵的抗Cd能力。
PSⅡ反應(yīng)中心是一個(gè)對重金屬脅迫比較敏感的光合機(jī)構(gòu)[36]，葉綠素?zé)晒鈪?shù)可以反映重金屬脅迫對PSⅡ光合活性及電子傳遞等功能的影響[37]。有研究表明，Cd脅迫會抑制葉片PSⅡ光化學(xué)功能[38]，而氮素有助于提高PSⅡ的光化學(xué)活性[39]。Fv/Fm可以反映植物是否受到逆境脅迫。本研究表明，Cd脅迫下龍葵葉片F(xiàn)v/Fm呈下降趨勢，說明龍葵受到一定程度的Cd脅迫。而Cd脅迫下增施氮肥使得龍葵Fv/Fm顯著增大，這說明施氮可以有效緩解Cd對龍葵的脅迫作用。Fv′/Fm′反映開放的PSⅡ反應(yīng)中心原初光能捕獲效率，NPQ反映PSⅡ天線色素吸收的光能以熱能形式耗散的部分，對光合機(jī)構(gòu)起保護(hù)作用[25]。本研究發(fā)現(xiàn)Cd脅迫下龍葵葉片F(xiàn)v′/Fm′、ETR下降，NPQ增大，說明Cd脅迫下龍葵葉片PSⅡ光合反應(yīng)中心實(shí)際量子產(chǎn)量下降，PSⅡ向PSI的電子傳遞受阻，使得同化力（NADPH和ATP）形成受阻，PSⅡ過剩光能增加，非光化學(xué)淬滅保護(hù)機(jī)制發(fā)揮作用，這與紫花香薷（Elsholtzia argyi）[40]和結(jié)縷草[16]等植物的研究結(jié)果一致。而Cd脅迫下增施氮肥后龍葵Fv′/Fm′、ETR上升，NPQ減小，說明氮肥能有效緩解Cd脅迫對PSⅡ功能的影響，提高葉片光能捕獲效率和電子傳遞速率，增加同化力（NADPH和ATP）的形成，為固碳反應(yīng)提供更多的能量，進(jìn)而增強(qiáng)對Cd毒害的抵抗能力。
葉片的光能吸收能力同時(shí)受N0、σik和σik′的影響，其中，光能吸收截面反映捕光色素分子吸收光子的能力[26]。葉片捕光色素分子在吸收光能后會從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)的捕光色素分子通過光化學(xué)反應(yīng)、葉綠素?zé)晒夂蜔崮艿?種方式退回基態(tài)[41]。因此，處于激發(fā)態(tài)的捕光色素分子越多，處于基態(tài)的捕光色素分子就越少，不利于葉片光能的吸收[26]。本研究發(fā)現(xiàn)Cd脅迫下龍葵N0、Nk減小，σik、σik′增大，說明Cd脅迫下龍葵在捕光色素分子總數(shù)下降的情況下，可以通過增大捕光色素分子光子吸收能力和處于基態(tài)的捕光色素分子的比例來提高植物對光能的吸收。而Cd脅迫下增施氮肥使得龍葵N0、Nk增大，σik和σik′減小。這可能是由于Cd脅迫下施氮使得捕光色素分子總數(shù)增大，植物通過減小其捕光色素分子光能吸收能力和處于基態(tài)的捕光色素分子數(shù)的比例，以防止葉片吸收過量光能。葉片吸收光能的3個(gè)耗散途徑為D、PH和E[21]。D是指植物用于光合生化反應(yīng)的能量。其余過剩的光能主要通過PH和E來消耗，防止其對光合機(jī)構(gòu)的破壞[42]。有研究表明，Cd脅迫使得楨楠幼樹E增大，D和PH減少[42]。本研究發(fā)現(xiàn)Cd脅迫下龍葵D有增大趨勢，PH和E有減小趨勢，而增施氮肥后D顯著減小，PH顯著增大。其中，光化學(xué)耗散能量增大可能與葉綠素含量、Fv′/Fm′和ETR等的增大有關(guān)，說明Cd脅迫下增施氮肥有利于提高葉片吸收光能用于光化學(xué)反應(yīng)的比例，增大葉片吸收光能的利用效率。
綜上所述，增施氮肥有助于提高Cd脅迫下龍葵葉片葉綠素含量、捕光色素分子總數(shù)、Fv/Fm、Fv′/Fm′、ETR、Nk和PH等光合生理指標(biāo)，緩解Cd脅迫對PSⅡ功能和吸收光能分配的影響，進(jìn)而增強(qiáng)龍葵對Cd脅迫的抗性，而且施加300 mg/kg CO(NH2)2對Cd脅迫下龍葵葉綠素合成和PSⅡ功能的促進(jìn)作用大于施加150 mg/kg CO(NH2)2，但與施加450 mg/kg CO(NH2)2無明顯差異，因此，300～450 mg/kg CO(NH2)2是合適的施氮濃度，為進(jìn)一步揭示氮肥對Cd脅迫下龍葵光合生理的影響機(jī)制及Cd污染土壤的治理實(shí)踐提供參考。
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