潘靜，孟凱，秦曉冰

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院/山東省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點實驗室，山東 青島 266109；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，山東 濟(jì)南 250100）

2015年7月以來，以包涵體肝炎和心包內(nèi)出現(xiàn)淡黃色透明液體為主要臨床癥狀的“雞心包積水綜合癥”（hydropericardium-hepatitis syndrome，HHS）在中國大面積暴發(fā)流行，該病是由禽腺病毒4型（fowl avianadenovirus serotype 4，F(xiàn)AdV-4）引起的急性傳染病，對我國家禽綠色健康養(yǎng)殖構(gòu)成巨大的威脅和挑戰(zhàn)［1］。被FAdV-4感染的家禽出現(xiàn)急性死亡，死亡高峰集中在1周之內(nèi)，死亡家禽出現(xiàn)典型的心包積液以及包涵體肝炎癥狀。此外，F(xiàn)AdV-4感染能夠?qū)е滤拗鞯拿庖咭种疲纱藢?dǎo)致的免疫失敗、繼發(fā)感染、混合感染進(jìn)一步加劇了HHS的危害［2］。目前亟待有效檢測該病毒的商業(yè)產(chǎn)品。FAdV-4包括3種主要結(jié)構(gòu)蛋白，分別為纖突蛋白Fiber、六鄰體蛋白Hexon和五鄰體基座Penton［3］。其中FAdV-4的基因組中有2個Fiber基因開放閱讀框，能夠編碼2個Fiber蛋白——Fiber-1和Fiber-2［4］。纖突蛋白Fiber-2和六鄰體蛋白Hexon可作為免疫原性蛋白起到一定的保護(hù)作用，通過比較其保護(hù)效率發(fā)現(xiàn)Fiber-2蛋白的免疫原性和保護(hù)原性最好［5］。

血清學(xué)診斷技術(shù)已被用于家禽FAdV感染的檢測，其進(jìn)展主要集中在ELISA檢測技術(shù)的改進(jìn)上。早期間接ELISA采用全病毒作為包被抗原，但病毒抗原的制作繁瑣、低效且靈敏度和特異性低。而基于重組蛋白的ELISA方法更靈敏、特異和準(zhǔn)確，易形成標(biāo)準(zhǔn)化并適于大規(guī)模運用［6］。

本研究以從山東省某肉雞場分離到的一株FAdV-4毒株（命名為FAdV-4 SDJN0105株，于2021年1月29日保藏于武漢大學(xué)菌種保藏中心，保藏號為CCTCC No：V202114）為模板擴(kuò)增Fiber-2基因，通過原核表達(dá)Fiber-2蛋白作為包被抗原，優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了FAdV-4間接ELISA抗體檢測方法，豐富了當(dāng)前檢測FAdV-4的方法，為定量測定免疫雞體內(nèi)抗體水平提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒、血清、載體及試驗動物

禽腺病毒4型毒株SDJN0105株由本實驗室分離；FAdV-4陽性血清和陰性血清由本實驗室利用SPF雞制備和保存；雞傳染性法氏囊病病毒（IBDV）、雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）、雞新城疫病毒（NDV）、禽白血病病毒（ALV）、H5和H9亞型禽流感病毒陽性血清由本實驗室保存；FAdV-8b陽性血清由濟(jì)南飛智生物技術(shù)有限公司惠贈；表達(dá)載體pET-30a（+）購自上海捷瑞生物工程有限公司；大腸桿菌BL21（DE3）購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；SPF雞購自濟(jì)南斯派福瑞禽業(yè)科技有限公司。

1.2 主要試劑

DL5000 DNA Marker、DL2000 DNA Marker、限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和Hin dⅢ、Taq DNA聚合酶購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒、DNA膠回收純化試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；Bradford蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE電泳液、5×蛋白上樣緩沖液、SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒、脫脂奶粉、BSA、一抗稀釋液購自碧云天生物技術(shù)有限公司；明膠購自Sigma-Aldrich（上海）貿(mào)易有限公司；ECL發(fā)光液購自環(huán)亞生物科技有限公司；蛋白Marker購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；無縫克隆試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；HRP標(biāo)記的兔抗雞二抗購自Proteintech中國公司。

1.3 包被抗原的制備

1.3.1 SDJN0315株FAdV-4基因組提取 將病變雞的肝組織剪碎研磨，離心過濾后，稀釋1 000倍接種LMH細(xì)胞，72 h凍融細(xì)胞3次，接種下一代細(xì)胞，如此盲傳3代，收集細(xì)胞上清，用病毒基因組提取試劑盒提取FAdV-4基因組DNA，于-80℃保存。

1.3.2 Fiber-2基因克隆與優(yōu)化 根據(jù)NCBI上Fiber-2基因保守區(qū)序列設(shè)計一對Fiber-2全長擴(kuò)增引物，上游引物：5′-ATGCTCCGGGCCCCTAAAAGAAGACATTC-3′，下游引物：5′-TTACGGGAGGGAGGCCGCTGGACAGC-3′。以FAdV-4基因組DNA為模板，PCR克隆Fiber-2基因。利用密碼子優(yōu)化軟件MaxCodonTMOptimization Program（V13）對Fiber-2核苷酸序列進(jìn)行優(yōu)化，使之更易在大腸桿菌中表達(dá)。由生工生物工程（上海）股份有限公司合成含目的基因的pUC57-Fiber-2質(zhì)粒，并用無縫克隆引物擴(kuò)增優(yōu)化后的Fiber-2基因，無縫克隆上、下游引物，分別為5′-TGGTGCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTATGCTCCG GGCCCCTAAAAGA-3′和5′-GGCCATGGCTGAT ATCGGATCCAATTCTTACGGGAGGGAGGCCGCTG GACAG-3′。本試驗所用引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3.3 pET-30a（+）-Fiber-2重組質(zhì)粒的構(gòu)建 將pET-30a（+）質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和Hin dⅢ酶切，經(jīng)核酸電泳鑒定正確后用DNA膠回收純化試劑盒回收線性載體質(zhì)粒。將線性載體質(zhì)粒pET-30a（+）、目的基因Fiber-2用無縫克隆試劑盒連接，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆菌落搖菌提質(zhì)粒，經(jīng)PCR、瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，送北京六合華大基因科技有限公司測序。

1.3.4 Fiber-2蛋白表達(dá)純化與鑒定 將測序正確的重組質(zhì)粒pET-30a（+）-Fiber-2轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆菌落培養(yǎng)，測序鑒定陽性后對其進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。當(dāng)菌液OD600值達(dá)到0.8時，加入IPTG，使之終濃度為0.2 mmol/L，15℃誘導(dǎo)16 h，離心收集菌體。超聲裂解，4℃離心3 min，分別取上清和沉淀，沉淀用等量PBS重懸，分別取出80μL，加蛋白上樣緩沖液煮沸后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，分析蛋白的表達(dá)方式。將表達(dá)產(chǎn)物通過Ni-IDA親和層析柱進(jìn)行純化，用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定目的蛋白濃度。純化后的蛋白用Western-Blot試驗鑒定其免疫原性，一抗用鼠源His單克隆抗體孵育，二抗用羊抗鼠抗體孵育。

1.4 Fiber-2間接ELISA方法的建立

采用方陣法優(yōu)化抗原最佳包被量和血清稀釋梯度。用pH 9.6、0.05 mol/L PBS作包被液稀釋Fiber-2蛋白，使其濃度分別為1、2、4、8、10 μg/mL，包被96孔酶標(biāo)板，每個濃度包被3個孔，100μL/孔，37℃放置1 h后4℃包被過夜。次日棄去孔內(nèi)液體，用PBST洗滌，200μL/孔，靜置1 min后棄去拍干，重復(fù)5次。用1%BSA作封閉液，100μL/孔，37℃封閉1 h，洗滌，同上。將FAdV-4陰性血清、陽性血清分別按1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400、1∶12800稀釋加入96孔板中，100μL/孔，每個梯度3個重復(fù)，混勻，37℃溫育30 min。洗滌拍干加入1∶10000稀釋的HRP標(biāo)記的兔抗雞二抗，100 μL/孔，37℃溫育30 min。洗滌拍干加入TMB底物顯色液，37℃避光反應(yīng)10 min。加入2 mol/L濃硫酸終止液，50μL/孔，15 min內(nèi)讀取OD450值，并計算陽性與陰性O(shè)D450的比值（P/N值）。陽性O(shè)D450值接近1.0，陰性O(shè)D450小于0.2，且P/N值最大時為最佳抗原包被量和血清稀釋梯度。

最適抗原濃度包被96孔板后，從不同包被方式（37℃包被1 h、37℃包被3 h、4℃包被過夜）中確定最佳包被方式。以同樣的方法確定最佳封閉液（0.5%BSA、1%BSA、5%脫脂奶粉、1%明膠），最佳封閉時間（30 min、1、2 h），待檢血清和二抗最佳孵育時間（30 min、1、2 h），最佳底物顯色時間（5、10、15 min）。

1.5 陰陽性臨界值的確定

采取50只SPF雞的陰性血清，根據(jù)建立的ELISA方法對50份血清進(jìn)行OD450值檢測，計算平均值）和標(biāo)準(zhǔn)方差（SD），陰陽性臨界值的判定為：大于等于+3SD）為陽性，小于為陰性［7］。

1.6 特異性試驗

利用建立的ELISA方法，以FAdV-4陽性血清為陽性對照，陰性血清為陰性對照，PBS為空白對照，以檢測陽性（經(jīng)試劑盒鑒定）的NDV、IBV、IBDV、H5、H9、ALV、FAdV-8b血清為試驗組，均設(shè)3個重復(fù)孔，驗證該方法的特異性。

1.7 重復(fù)性試驗

批內(nèi)重復(fù)性檢測：用制備的同一批次ELISA試劑盒檢測5份FAdV-4陽性血清和2份FAdV-4陰性血清，每個樣品3次重復(fù)，計算同一份血清樣品OD450值得變異系數(shù)，確定間接ELISA方法的批內(nèi)重復(fù)性。

批間重復(fù)性檢測：對上述7份血清用不同批次的ELISA試劑盒進(jìn)行檢測，每個樣品3次重復(fù)，計算同一份血清樣品OD450值得變異系數(shù)，確定間接ELISA方法的批間重復(fù)性。

1.8 臨床樣品檢測

利用建立的間接ELISA方法以陽性血清為陽性對照，以陰性血清為陰性對照，對30份疑似感染禽腺病毒4型雞的血清進(jìn)行檢測，測定OD450值，同時利用PCR方法檢測相應(yīng)肝臟組織，比較這兩種方法對FAdV-4感染的檢出率，間接判斷建立的間接ELISA方法的準(zhǔn)確性。

1.9 穩(wěn)定性檢測

將同一批次試劑盒4℃保存，分別在6、12、18個月后再次鑒定新鮮的血清樣品，檢測結(jié)果同PCR方法檢測相應(yīng)肝臟組織比較，確定該試劑盒的保質(zhì)期。

2 結(jié)果與分析

2.1 pET-30a（+）-Fiber-2重組蛋白的表達(dá)純化與鑒定

以優(yōu)化的含目的基因的pUC57-Fiber-2為模板，用無縫克隆引物擴(kuò)增Fiber-2基因，經(jīng)核酸電泳檢測得到1 440 bp的條帶（圖1），膠回收得到純化的目的片段。用無縫克隆試劑盒將目的片段和線性載體連接轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌，挑取5個菌落搖菌提質(zhì)粒測序后與優(yōu)化的Fiber-2序列進(jìn)行比對，同源性為100%。將含重組質(zhì)粒的BL21（DE3）菌液進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)后超聲破碎，制備上清與沉淀兩個樣品做SDS-PAGE電泳，結(jié)果（圖2）顯示在上清與沉淀中均有重組蛋白的表達(dá)，蛋白分子量為60 kDa?？紤]蛋白降解、變性、復(fù)性困難等因素，只將上清中表達(dá)的蛋白做純化處理，蛋白純度為90%，濃度為0.24 mg/mL。Western-Blot試驗結(jié)果（圖3）顯示其免疫原性良好。

圖1 優(yōu)化的Fiber-2基因克隆結(jié)果

圖2 SDS-PAGE分析重組蛋白上清純化結(jié)果

圖3 Western-Blot分析重組蛋白免疫原性

2.2 間接ELISA方法的建立

通過方陣優(yōu)化法確定Fiber-2抗原最佳包被量為4μg/mL；最適宜包被條件為37℃包被1 h；最佳封閉液和封閉時間為0.5%BSA封閉1 h；待檢血清最佳稀釋度為1∶400，孵育時間為30 min；HRP標(biāo)記的兔抗雞二抗最佳孵育時間為30 min；最佳顯色時間為10 min。

2.3 ELISA陰陽性臨界值的確定

50份FAdV-4抗體陰性血清樣品OD450值的平均值（）為0.206，標(biāo)準(zhǔn)方差（SD）為0.038，根據(jù)公式得出陰陽性的臨界值為0.320。因此，當(dāng)待檢血清樣品OD450值≥0.320即可判為陽性。

2.4 特異性試驗結(jié)果

如表1所示，間接ELISA方法測定的NDV、IBV、IBDV、H5、H9、ALV、FAdV-8b血清OD450值均小于0.32，為陰性，說明本試驗建立的間接ELISA方法具有很好的特異性。

表1 特異性試驗結(jié)果

2.5 敏感性試驗結(jié)果

結(jié)果如表2所示，陽性血清按1∶6400稀釋后結(jié)果仍為陽性，說明本試驗建立的間接ELISA方法具有很好的敏感性。

表2 敏感性試驗結(jié)果

2.6 批內(nèi)與批間重復(fù)性試驗結(jié)果

用建立的ELISA方法對5份FAdV-4陽性血清和2份FAdV-4陰性血清進(jìn)行檢測，結(jié)果（表3）表明，批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于5%，表明本試驗建立的間接ELISA方法具有很好的重復(fù)性。

表3 重復(fù)性試驗結(jié)果

2.7 臨床樣品檢測結(jié)果

用建立的間接ELISA方法對30份疑似感染FAdV-4雞的血清進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示28份血清陽性，2份血清陰性，與PCR鑒定結(jié)果完全一致，說明本試劑盒準(zhǔn)確性高，結(jié)果可靠。

2.8 穩(wěn)定性結(jié)果

在與PCR結(jié)果100%符合的條件下，4℃保存12個月的試劑盒結(jié)果仍可靠，證明其穩(wěn)定性好，保質(zhì)期長。

3 討論與結(jié)論

新型FAdV-4自2015年在我國暴發(fā)以來，給禽養(yǎng)殖業(yè)帶來了嚴(yán)重的危害，病雞主要表現(xiàn)為心包內(nèi)有積液，肝臟出血，虎斑腎。目前預(yù)防該疾病的疫苗是FAdV-4滅活苗，但是免疫效果不明顯，還需要開發(fā)新型有效、成本低廉的疫苗［9］。檢測雞體內(nèi)特異性抗體水平是評估疫苗免疫有效性的一個重要指標(biāo)，酶聯(lián)免疫吸附試驗具有通量大、操作簡便、結(jié)果易于判定的優(yōu)點，并且高效的ELISA試劑盒可快速診斷疾病，凈化種群。研制出準(zhǔn)確度高的ELISA試劑盒是當(dāng)前養(yǎng)雞業(yè)和科學(xué)研究領(lǐng)域的迫切需求［10，11］。

桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的蛋白雖然具有最接近病毒的天然蛋白結(jié)構(gòu)的優(yōu)點，但操作程序繁瑣，成本也較高［12］。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)周期短、易于培養(yǎng)和操作，為了降低ELISA試劑盒的成本，需要用便宜、產(chǎn)量高的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)目的蛋白［13，14］。

ELISA一般以全病毒或病毒相關(guān)蛋白、病原特異性抗體作為包被抗原或抗體，對血清抗體及抗原進(jìn)行檢測［15］。有文章指出，可用FAdV-4病毒作為包被抗原建立間接ELISA方法，但用全病毒包被增加了散毒的危險，不利于生物安全［16］。謝泉［17］利用Hexon蛋白作為包被抗原建立了間接ELISA方法，但陽性血清檢出率不高，可能是Hexon蛋白對機(jī)體刺激性不夠，未能產(chǎn)生相應(yīng)抗原［18］。FAdV-4的短纖維蛋白是一種保護(hù)性抗原，具有誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的能力［19］。唐秋霞［5］比較了腺病毒4種免疫原蛋白的免疫原性，表明Fiber-2蛋白的免疫原性更高，和劉建勛等［20］的研究結(jié)果一致。

TMB作為底物與HPR作用后顯藍(lán)色，對人體安全，對光照條件的要求不高，故選TMB作為本方法的顯色底物［21］。間接法ELISA檢測方法使得信號放大，靈敏度高，而且對試劑要求小。本研究以原核表達(dá)的Fiber-2蛋白為包被抗原，建立了檢測抗體的間接ELISA方法。該方法特異性強，可重復(fù)性好，保質(zhì)期長，具有良好的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，可用作商品化ELISA試劑盒應(yīng)用于臨床檢測、診斷和科研中。