俞森權 胡佳麗 高文倉

肺癌在全球范圍內是發(fā)生率和病死率最高的惡性腫瘤，并且近年來其發(fā)生率仍在不斷上升[1]。肺癌主要分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌，其中后者占大多數(shù)[2]。據(jù)統(tǒng)計很多患者在晚期階段才被確診，因此錯過了疾病的最佳治療時間[3]。盡管現(xiàn)有的治療方法多樣，但非小細胞肺癌患者的預后較差，生存率仍較低，5年生存率為30%左右[4]。因此，尋找有效的藥物和治療手段對降低非小細胞肺癌病死率，提高預后生存率至關重要。

中醫(yī)藥防治腫瘤有數(shù)千年歷史，能夠在干預癌前病變、預防轉移復發(fā)、帶瘤生存等方面發(fā)揮重要作用[5, 6]。已有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者若能夠配合正規(guī)的中醫(yī)藥進行穩(wěn)定長期治療，生活質量和存活時間得到顯著改善[7]。中藥能夠通過多種機制抗腫瘤，如抑制腫瘤細胞增殖，促進凋亡，逆轉藥物耐藥等[8]。

苦參堿是中草藥苦參活性成分的提取物質，為四環(huán)噻嗪啶類化合物，屬于生物堿類物質[9]。有研究證明苦參素在多種癌癥治療中發(fā)揮作用，如肝癌、胃癌、乳腺癌、前列腺癌等[10～12]。苦參堿能夠促進抗腫瘤免疫反應、誘導多種腫瘤細胞凋亡和自噬、抑制腫瘤細胞浸潤轉移、逆轉腫瘤細胞耐藥性等[13]。本研究探討了苦參堿在非小細胞肺癌中對腫瘤生長和轉移侵襲的影響及其分子機制，為非小細胞肺癌的中藥治療及其相關研究提供了理論基礎和科學依據(jù)。

材料與方法

1.人肺癌細胞培養(yǎng)：從中國科學院購入人肺癌細胞株A549和H1650(上海生命科學研究院細胞庫)。使用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基(美國賽默飛世爾科技公司)按照常規(guī)方法培養(yǎng)細胞，隔天換液，長滿時進行傳代。取處于對數(shù)生長期的A549和H1650細胞進行實驗。

2.非小細胞肺癌小鼠模型構建:本實驗所用BALB/c裸鼠來自杭州醫(yī)學院實驗動物中心。本實驗操作通過浙江省實驗動物中心實驗動物福利倫理學委員會審核(倫理學審批號：ZJCLA-IACUC-20020019)。首先制備了濃度為1×106個/毫升的A549單細胞懸液，皮下注射于裸鼠右側腋下，飼養(yǎng)10天。待造模成功后，隨機分為對照組和實驗組，每組6只。實驗組小鼠將苦參堿溶液按75mg/kg進行連續(xù)腹腔注射2周。對照組小鼠注射10ml/kg 0.9%氯化鈉注射液。小鼠處死后，剝離腫塊，測量體積及重量并采集圖片。每次測量重復3次以上。

3.MTT比色法:將A549和H1650接種至96孔板中，使用不同濃度(0.5、1.0、2.0mg/ml)苦參堿進行孵育。MTT法檢測細胞活力改變，每孔添加5mg/ml MTT溶液(美國賽默飛世爾科技公司)20μl，繼續(xù)孵育4h后去上清液。使用酶聯(lián)免疫檢測儀于490nm處檢測吸光度(A)值。

4.AnnexinV/PI染色:1.0mg/ml苦參堿處理A549和H1650后，收集細胞。先后加入Annexin V-FITC和PI(美國賽默飛世爾科技公司)進行避光孵育，流式細胞儀檢測凋亡細胞。

5.劃痕實驗：待A549和H1650細胞密度飽和，垂直平板劃痕，PBS洗滌脫落的細胞。加入1.0mg/ml苦參堿培養(yǎng)48h后，倒置顯微鏡下觀察并計算細胞遷移距離。

6.Transwell實驗：在涂有Matrigel膠的Transwell小室上室中加入細胞懸液，下室中則加入含藥高濃度血清培養(yǎng)基。48h后，取出Transwell小室，使用甲醛固定細胞，結晶紫進行染色。PBS洗滌2遍，在倒置顯微鏡下進行細胞計數(shù)。

7.Western blot法檢測：提取A549、H1650和腫瘤組織的總蛋白。12%SDS-PAGE分離蛋白質，然后電轉至 PVDF膜(美國賽默飛世爾科技公司)。5%脫脂牛奶進行膜封閉，隨后選用一級抗體在4冰箱搖床孵育。次日，HRP標記二抗孵育，用ECL試劑盒檢測信號。一級抗體購自美國Cell Signaling Technology公司：Bax(1∶1000，#5023)、Bcl-2(1∶1000，#15071)、E-cadherin(1∶1000，#3195)、N-cadherin(1∶1000，#13116)、vimentin(1∶1000，#5741)、Snail(1∶1000，#3879)、PTEN(1∶1000，#9188)、p-Akt(1∶1000，#4060)、Akt(1∶1000，#4685)。

結 果

1.苦參堿降低了人肺癌細胞A549和H1650的細胞活性：本研究將人肺癌細胞A549和H1650作為體外細胞模型。用0.5、1.0、2.0mg/ml濃度的苦參堿處理細胞后，MTT 結果發(fā)現(xiàn)細胞活性伴隨著苦參堿濃度不斷升高而顯著降低，細胞增殖被抑制(圖1A)。AnnexinV/PI染色和Western blot法檢測結果表明，苦參堿誘導細胞凋亡，細胞凋亡率不斷升高，促凋亡蛋白Bax表達上調以及抗凋亡蛋白Bcl-2表達下調(圖1)。同時，研究發(fā)現(xiàn)，當苦參堿處理濃度為1.0和2.0mg/ml時，細胞活性沒有很顯著差異，因此選取1.0mg/ml作為后續(xù)研究濃度。

圖1 苦參堿對細胞活性和細胞凋亡的影響A.MTT檢測細胞活性; B.Annexin V/PI染色結果; C.Western blot法檢測凋亡相關蛋白表達。與對照組比較，*P<0.05,**P<0.01, ***P=0.000

2.苦參堿抑制A549和H1650的細胞遷移和侵襲：本研究中，苦參堿(1.0mg/ml)處理A549和H1650細胞48h后，劃痕實驗顯示苦參堿處理后，細胞運動距離變短，遷移能力減弱(圖2A)；Transwell實驗表明細胞侵襲能力也隨之減弱(圖2B)。

圖2 苦參堿抑制細胞遷移和侵襲A.劃痕實驗表明苦參堿減弱細胞遷移能力; B.Transwell實驗表明苦參堿減弱細胞侵襲能力(結晶紫染色，×100)

3.苦參堿抑制A549和H1650的上皮間質轉化(EMT)過程:苦參堿(1.0mg/ml)處理A549和H1650細胞48h后，應用Western blot法檢測EMT相關蛋白E-cadherin、N-cadherin、vimentin和Snail表達(圖3)，結果表明，E-cadherin表達顯著上調，N-cadherin、vimentin和Snail表達顯著下調。

圖3 Western blot法檢測EMT相關蛋白表達

4.苦參堿調控PTEN/PI3K/Akt通路：本研究用苦參堿(1.0mg/ml)處理A549和H1650細胞48h后，Western blot法和qRT-PCR檢測相關蛋白PTEN，p-Akt和Akt表達(圖4)。

圖4 Western blot法檢測PTEN/PI3K/Akt通路相關蛋白

5.體內實驗研究苦參堿對非小細胞肺癌的影響：本研究成功構建了非小細胞肺癌小鼠模型，并用苦參堿溶液(75mg/kg)腹腔注射處理，連續(xù)給藥2周。測量小鼠的腫瘤體積及重量(圖5A)，并且觀察腫瘤形態(tài)(圖5B)。發(fā)現(xiàn)苦參堿溶液處理后，腫瘤體積和重量均減小。Western blot法檢測結果發(fā)現(xiàn)，PTEN和E-cadherin表達上調，p-Akt、N-cadherin、vimentin和Snail蛋白表達下調(圖5C～D)。

圖5 苦參堿對體內腫瘤生長和轉移侵襲的影響A.腫瘤體積及重量變化; B.腫瘤形態(tài); C.PTEN/PI3K/Akt通路相關蛋白表達; D.EMT相關蛋白表達

討 論

EMT能夠使腫瘤細胞獲得侵襲和向遠處轉移的能力，進而侵入周圍組織并形成轉移灶，與腫瘤轉移密切相關[14]。本研究發(fā)現(xiàn)苦參堿能夠抑制人肺癌細胞遷移和侵襲，因此進一步研究苦參堿對EMT過程的影響。有研究報道PTEN能夠抑制PI3K/Akt通路，進而影響細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲[15,16]。

在EMT過程中，腫瘤上皮細胞轉化為間質細胞，并獲得侵襲和向遠處遷移能力[17]。腫瘤中央處的細胞常為上皮細胞表型，周圍細胞常呈間質細胞表型，周圍的細胞常具有較強的運動能力，使腫瘤細胞侵入循環(huán)系統(tǒng)而轉移至靶器官[18]。這是惡性腫瘤侵襲、轉移過程中關鍵的一步。目前已知苦參堿能夠抑制多種腫瘤生長，而且抑制EMT的發(fā)生，進而抑制腫瘤轉移和侵襲。然而，苦參堿在非小細胞肺癌的作用機制仍不清楚。本研究探討了中藥單體苦參堿對非小細胞肺癌生長和EMT過程的影響及其作用機制。

本研究選取A549和H1650作為人肺癌細胞體外模型。用0.5、1.0、2.0mg/ml濃度的苦參堿處理細胞，發(fā)現(xiàn)苦參堿減弱了人肺癌細胞的細胞活性，促進了細胞凋亡，并且伴隨濃度依賴性。同時，苦參堿能夠抑制人肺癌細胞遷移和侵襲。研究結果表明，苦參堿在非小細胞肺癌治療中能夠發(fā)揮作用。已知EMT過程與腫瘤轉移密切相關，本研究通過進一步檢測EMT相關蛋白表達，確定苦參堿在EMT過程中發(fā)揮的作用。

E-cadherin能夠使腫瘤細胞之間相互黏附，當?shù)鞍妆磉_下降時，腫瘤上皮細胞發(fā)生EMT過程，并且向遠處轉移[19]。本研究發(fā)現(xiàn)苦參堿(1.0mg/ml)處理后，E-cadherin表達顯著上調，N-cadherin、vimentin和Snail表達顯著下調，腫瘤細胞相互間的黏附作用增強，EMT過程被抑制。同時，有研究報道PTEN 能夠抑制PI3K/Akt通路，而PI3K/Akt通路能夠調控EMT 關鍵轉錄因子Snail，進而調控EMT過程[20]。本研究檢測了PTEN/PI3K/Akt通路相關蛋白，發(fā)現(xiàn)苦參堿(1.0mg/ml)處理后PTEN表達增多，p-Akt表達下調，進而影響了EMT過程。

本研究首先通過細胞實驗證明了苦參堿通過PTEN/PI3K/Akt通路調控非小細胞肺癌EMT過程，進而影響細胞遷移和侵襲。成功構建了非小細胞肺癌小鼠模型，并用苦參堿溶液(75mg/kg)腹腔注射處理。連續(xù)給藥一段時間后，處死小鼠，發(fā)現(xiàn)苦參堿抑制了腫瘤生長，并且引起PTEN/PI3K/Akt通路相關蛋白和EMT相關蛋白表達發(fā)生顯著變化。通過體內實驗，證明了苦參堿能夠影響上皮間質轉化過程進而影響腫瘤轉移。

本研究通過體外和體內實驗研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿不僅能夠影響腫瘤細胞生長，而且能夠通過PTEN/PI3K/Akt通路調控非小細胞肺癌上皮間質轉化，進而影響細胞遷移和侵襲。本研究為非小細胞肺癌的中藥治療及其相關研究提供了理論基礎和科學依據(jù)。