姚紅兵 吳嘉興 郭 威 文雪霖 蔣建暉 劉翔峰

肝細(xì)胞癌(肝癌)是常見的惡性腫瘤，缺氧是惡性腫瘤微環(huán)境的主要特征之一，肝癌細(xì)胞在缺氧環(huán)境下可通過增強(qiáng)糖酵解代謝方式，維持細(xì)胞增殖的能量需求，從而促進(jìn)肝癌進(jìn)程[1,2]。糖原合成激酶(glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β)介導(dǎo)的信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞的增殖、分化及能量代謝具有重要作用，其活性受到Akt的調(diào)控。黏著斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)是一種胞質(zhì)非受體蛋白酪氨酸激酶，與腫瘤的多種生物學(xué)行為密切相關(guān)，磷酸化的FAK可通過結(jié)合PI3K/Akt促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖[3]。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AK在肝癌組織中異常表達(dá)及活化，并與肝癌進(jìn)展有顯著相關(guān)性，可作為肝癌藥物開發(fā)的新靶標(biāo)[4]。多激酶抑制劑CT-707是一種新型FAK抑制劑，可通過抑制FAK的磷酸化發(fā)揮良好的抗腫瘤活性[5]。筆者前期研究已證實(shí)CT-707在肝癌動(dòng)物模型中可抑制肝癌細(xì)胞的增殖以及腫瘤形成，促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡[6]。故本研究結(jié)合肝癌細(xì)胞在缺氧微環(huán)境中的代謝特點(diǎn)，基于PI3K/Akt/GSK-3β信號(hào)通路，旨在進(jìn)一步探討新型FAK抑制劑CT-707的抗肝癌作用及機(jī)制。

材料與方法

1.試驗(yàn)材料：人肝癌HepG2細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，使用含10%胎牛血清及1%雙抗的改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)培養(yǎng)基，于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。6周齡BALB/c裸鼠購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，在SPF級(jí)條件下飼養(yǎng)。CT-707購(gòu)自美國(guó)MCE公司；DMEM、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；cyclin D1、cyclin E、p-FAK、FAK、PI3K、Akt、p-GSK-3β、GSK-3β、PCNA、β-actin抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；p-PI3K、p-Akt抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；HE染色試劑盒、己糖激酶(HK)試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自北京Solarbio公司；乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒購(gòu)自南京建成生物；CCK-8試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物公司。

2.HepG2缺氧培養(yǎng)及分組：將HepG2細(xì)胞接種于6孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)2×105，參照文獻(xiàn)[5,7]按CT-707劑量范圍(0～6μmol/L)分為control(對(duì)照)組以及處理組[CT-707高(6μmol/L)、中(3μmol/L)、低(1.5μmol/L)劑量組]。根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組，處理組分別加入相應(yīng)劑量的含藥DMEM，對(duì)照組則加入無(wú)藥DMEM，各組均于37℃缺氧培養(yǎng)箱(2%O2、5%CO2、93%N2)中培養(yǎng)48h。

3.CCK8：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2接種于96孔板中，根據(jù)分組進(jìn)行相應(yīng)處理，并設(shè)置空白對(duì)照(空白組)，培養(yǎng)48h后，每孔加入10μl CCK8工作液，37℃培養(yǎng)2h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞活性(%)=(A處理組-A空白組) /(A對(duì)照組-A空白組)×100%。

4.HK酶活性檢測(cè)：收集各組細(xì)胞，培養(yǎng)基稀釋為5×106/ml，加入1ml提取液，冰浴超聲提取，重復(fù)操作多次使細(xì)胞充分破碎，8000×g4℃離心10min，取上清待測(cè)。取50μl待測(cè)液于EP管中，加入950μl工作液，混勻后快速移至微量石英比色皿中，紫外分光光度儀測(cè)定340nm波長(zhǎng)下吸光度A1。將反應(yīng)液置于37℃中水浴2min，立即測(cè)定吸光度A2。計(jì)算HK酶活[U/(gpro)]=(A2-A1)/毫摩爾消光系數(shù)/反應(yīng)時(shí)間/比色光徑×(反應(yīng)液總體積/取樣量)×1000。

5.LDH含量檢測(cè)：胰酶消化收集各組HepG2，進(jìn)行計(jì)數(shù)，離心棄上清，按5×106個(gè)細(xì)胞加入1ml提取液的比例加入提取液，冰浴超聲波提取2min，8000×g4℃離心10min，根據(jù)LDH試劑盒試劑盒說明書配置標(biāo)準(zhǔn)品和樣品，按步驟加入樣本和基質(zhì)緩沖液、輔酶Ⅰ，37℃反應(yīng)15min，加入2，4-二硝基苯肼，漩渦混勻，37℃孵育15min，加入NaOH溶液室溫放置3min，440nm波長(zhǎng)，1cm光徑比色，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算LDH含量。

6.Western blot法檢測(cè)：各組HepG2用預(yù)冷的PBS洗滌2次，RIPA裂解液冰上裂解30min，低溫離心取上清，行BCA蛋白定量。每孔蛋白上樣量為20μg，SDS-PAGE電泳，濕法轉(zhuǎn)膜。5%脫脂牛奶室溫封閉1h，一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次。二抗室溫孵育1h，洗膜3次，用ECL檢測(cè)液發(fā)光顯影定影后，Image J分析灰度值。

7.裸鼠皮下成瘤及藥物治療：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2胰酶消化收集，1000×g離心5min，取細(xì)胞沉淀重懸，制成細(xì)胞濃度為2.5×107/ml懸液。于無(wú)菌環(huán)境下，采用1ml注射器抽取0.2ml細(xì)胞懸液，在常規(guī)消毒的裸鼠腋部皮膚進(jìn)行細(xì)胞懸液接種。根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3R原則，將接種HepG2細(xì)胞懸液的裸鼠隨機(jī)分為4組，分為模型組和CT-707高(100mg/kg)、中(50mg/kg)、低(25mg/kg)劑量組，每組8只，CT-707按照劑量腹腔注射給藥，每天兩次，模型組則注射等量0.9%氯化鈉溶液[7]。給藥14天后處死動(dòng)物，取腫瘤組織進(jìn)行稱重及體積測(cè)量。

8.HE染色：腫瘤組織于4%多聚甲醛中固定，行石蠟切片，根據(jù)HE試劑盒說明進(jìn)行染色，封片，鏡檢，觀察組織病理結(jié)構(gòu)。

9.免疫組化：取各組腫瘤組織切片進(jìn)行免疫組化染色。采用微波抗原修復(fù)后，滴加3% H2O2以去除內(nèi)源性過氧化物酶活性，蒸餾水洗凈。滴加封閉液室溫孵育，一抗4℃過夜孵育。棄去一抗，PBS沖洗，滴加二抗，室溫孵育20min，棄去二抗。滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，室溫孵育20min，PBS洗凈后滴加DAB顯色。著色后浸入水中終止反應(yīng)，自來水反復(fù)沖洗后，蘇木精復(fù)染；梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察并拍照。Image J軟件分析PCNA的陽(yáng)性表達(dá)。

結(jié) 果

1.缺氧環(huán)境下CT-707對(duì)肝癌細(xì)胞活性、能量代謝及細(xì)胞周期的影響：與對(duì)照組比較，CT-707高、中、低劑量組HepG2細(xì)胞活性下降，HK活性及LDH含量顯著下調(diào)，細(xì)胞周期蛋白cyclin D1、cyclin E顯著下調(diào)(P<0.05)，中、高劑量組的效應(yīng)明顯優(yōu)于低劑量組(P<0.05)，中、高劑量組間結(jié)果比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1、圖2)。

圖1 各組細(xì)胞活性、HK活性及LDH含量檢測(cè)結(jié)果A.細(xì)胞活性；B.HK活性；C.LDH含量。與對(duì)照組比較，*P<0.05；與CT-707(1.5μmol/L) 組比較，#P<0.05

圖2 各組細(xì)胞中cyclin D1和cyclin E的蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較，*P<0.05；與CT-707(1.5μmol/L) 組比較，#P<0.05

2.缺氧環(huán)境下CT-707對(duì)FAK/PI3K信號(hào)通路的影響：與對(duì)照組比較，CT-707高、中、低劑量組HepG2中FAK、PI3K、GSK-3β、p-FAK/FAK、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β水平均明顯下調(diào)，中、高劑量組的效應(yīng)明顯優(yōu)于低劑量組(P<0.05)，中、高劑量組間結(jié)果比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，各組Akt蛋白表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖3)。

圖3 FAK/PI3K信號(hào)通路關(guān)鍵因子的Western blot法檢測(cè)結(jié)果

3.CT-707對(duì)HepG2裸鼠移植瘤的抑制作用：與模型組比較，CT-707高(100mg/kg)、中(50mg/kg)、低(25mg/kg)劑量組瘤質(zhì)量、瘤體積明顯下降(P<0.05)，其中中、高劑量組的效應(yīng)明顯優(yōu)于低劑量組(P<0.05)，中、高劑量組間結(jié)果比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖4)。

圖4 裸鼠移植瘤質(zhì)量和體積A.移植瘤質(zhì)量；B.移植瘤體積；與模型組比較, *P<0.05; 與CT-707(25 mg/kg) 組比較, #P<0.05

4.CT-707對(duì)HepG2裸鼠移植瘤細(xì)胞增殖及壞死的影響：采用HE染色檢測(cè)HepG2裸鼠移植瘤細(xì)胞壞死情況。鏡下觀察模型組細(xì)胞核清晰可見，細(xì)胞排列整齊致密；CT-707高(100mg/kg)、中(50mg/kg)、低(25mg/kg)劑量組細(xì)胞排列松散，部分細(xì)胞核消失，出現(xiàn)壞死區(qū)域，且隨著CT-707劑量增加，壞死區(qū)域增加，細(xì)胞核消失增加。采用免疫組化檢測(cè)HepG2裸鼠移植瘤中PCNA的表達(dá)情況，結(jié)果表明，與模型組比較，CT-707高(100mg/kg)、中(50mg/kg)、低(25mg/kg)劑量組PCNA陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率均顯著降低(P<0.05)，中、高劑量組的效應(yīng)明顯優(yōu)于低劑量組(P<0.05)，中、高劑量組間結(jié)果比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖5、圖6)。

圖5 各組移植瘤的HE染色比較(×400)A.模型組；B.CT707(25mg/kg)組；C.CT707(50mg/kg)組；D.CT707(100mg/kg)組

圖6 各組移植瘤中PCNA的陽(yáng)性表達(dá)比較(×400)與模型組比較, *P<0.05; 與CT-707(25mg/kg) 組比較, #P<0.05

討 論

肝癌發(fā)病隱匿且病情進(jìn)展迅速，患者確診時(shí)大多已在進(jìn)展期或晚期。肝癌細(xì)胞的快速增殖，是導(dǎo)致肝癌病情進(jìn)展迅速的重要原因[8]。惡性腫瘤增殖過程伴隨高速代謝，在快速生長(zhǎng)的同時(shí)，氧耗劇增，且腫瘤內(nèi)新生血管滯后引起血氧供應(yīng)不足，從而造成腫瘤組織局部缺氧，此時(shí)癌細(xì)胞可通過增強(qiáng)糖酵解，并轉(zhuǎn)而依賴糖酵解途徑作為主要能量供給來源，適應(yīng)缺氧微環(huán)境。腫瘤在缺氧微環(huán)境中的持續(xù)增殖，是多種蛋白作用的結(jié)果，其中缺氧可誘導(dǎo)FAK激活，F(xiàn)AK可通過PI3K/Akt等多條信號(hào)通路參與增殖和腫瘤的形成[9]。CT-707是一種新型多激酶抑制劑，可抑制FAK、ALK和Ply2蛋白的活性，研究表明，CT-707在缺氧環(huán)境下對(duì)HepG2具有更強(qiáng)的增殖抑制效果，但其作用機(jī)制尚未完全闡明[7]。因此，本研究通過建立HepG2缺氧模型及皮下成瘤動(dòng)物模型，進(jìn)一步觀察CT-707對(duì)HepG2糖酵解途徑及細(xì)胞周期的影響，探討其抗肝癌細(xì)胞增殖的作用機(jī)制。

糖酵解代謝模式為癌細(xì)胞的增殖提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，使得癌細(xì)胞在缺氧等環(huán)境中存活和增殖[10]。HK是糖酵解途徑的關(guān)鍵酶，可將葡萄糖轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖，在缺氧條件下為癌細(xì)胞提供碳源，HK在包括肝癌在內(nèi)的癌組織中大量表達(dá)，可促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖及糖酵解[11]。LDH是催化糖酵解的限速酶之一，可將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸排至胞外。LDH在多種腫瘤組織中表達(dá)升高，其表達(dá)與腫瘤組織的大小顯著相關(guān)，可作為腫瘤診斷的標(biāo)志物[12]。此外，癌細(xì)胞通過調(diào)控細(xì)胞周期的時(shí)相分布從而實(shí)現(xiàn)快速增殖。細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)和調(diào)控，是控制細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換，影響增殖的關(guān)鍵因素。

細(xì)胞周期蛋白cyclin D1、cyclin E可引起DNA復(fù)制，推動(dòng)細(xì)胞周期由G1期進(jìn)入S期，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，CT-707在缺氧培養(yǎng)條件下抑制HepG2細(xì)胞增殖的同時(shí)，可降低HK和LDH的含量，抑制cyclin D1、cyclin E的表達(dá)，表明CT-707可阻斷缺氧環(huán)境下肝癌細(xì)胞糖酵解代謝途徑，并誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，具有顯著的抗肝癌細(xì)胞增殖的效應(yīng)。

cyclin D1、cyclin E及HK、LDH的表達(dá)受GSK-3β的調(diào)控[14, 15]。GSK-3β通過介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，磷酸化使底物蛋白失活發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用，是細(xì)胞內(nèi)糖代謝、細(xì)胞增殖、分化及凋亡調(diào)控的關(guān)鍵因子[16]。研究發(fā)現(xiàn)，GSK-3β在肝癌組織中的表達(dá)水平低于正常肝組織及癌旁組織，其表達(dá)與組織病理學(xué)評(píng)分、腫瘤分級(jí)相關(guān)[17]。PI3K/Akt是GSK-3β上游信號(hào)通路，Akt可磷酸化GSK-3β Ser9位點(diǎn)，抑制GSK-3β的活性，促進(jìn)糖酵解及細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖[18]。抑制PI3K/Akt/GSK-3β信號(hào)通路是多種藥物的抗腫瘤作用機(jī)制，而FAK可參與調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路，因此推測(cè)FAK抑制劑CT-707可通過抑制PI3K/Akt/GSK-3β發(fā)揮抗肝癌作用。本研究發(fā)現(xiàn)CT-707可顯著下調(diào)缺氧培養(yǎng)下HepG2中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt和p-GSK-3β/ GSK-3β表達(dá)水平，且CT-707中、高濃度時(shí)作用更明顯，表明CT-707抑制PI3K/Akt/GSK-3β信號(hào)通路可能是其抑制肝癌細(xì)胞增殖的關(guān)鍵機(jī)制。

為進(jìn)一步研究CT-707對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制，本研究對(duì)皮下種植HepG2的裸鼠給予CT-707治療，發(fā)現(xiàn)CT-707可顯著減小移植瘤的體積和質(zhì)量，破壞癌組織結(jié)構(gòu)，表明CT-707具有顯著的抗肝癌作用。PCNA是DNA復(fù)制的必須物質(zhì)，與細(xì)胞中DNA合成及細(xì)胞周期密切相關(guān)。PCNA的表達(dá)從G1期開始升高，S期表達(dá)達(dá)到高峰，到G2期逐漸下降，是反映細(xì)胞增殖的主要生物學(xué)指標(biāo)[19]。本研究發(fā)現(xiàn),CT-707可顯著下調(diào)PCNA陽(yáng)性細(xì)胞比例，進(jìn)一步從體內(nèi)研究證實(shí)CT-707可引起肝癌細(xì)胞周期阻滯，抑制細(xì)胞增殖活性，從而發(fā)揮抗肝癌作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)FAK抑制劑CT-707在缺氧環(huán)境下可通過抑制PI3K/Akt/GSK-3β信號(hào)通路，阻斷肝癌細(xì)胞糖酵解代謝途徑，并誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，抑制肝癌細(xì)胞增殖及腫瘤生長(zhǎng)，表明CT-707作為一種FAK靶向抑制劑具有良好的抑癌作用，可能是潛在的腫瘤靶向藥物，值得深入研究。