劉維兵 楊 林 包曉瑋

1.青島德慧海洋生物科技有限公司 山東青島 266000

2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院 新疆烏魯木齊 830000

肉類(lèi)制品因含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，且存在殺菌不徹底的情況，極易發(fā)生腐敗變質(zhì)。與其它防腐保鮮技術(shù)相比，添加防腐劑對(duì)肉制品進(jìn)行防腐保鮮，具有操作簡(jiǎn)便、成本低廉的優(yōu)點(diǎn)，是肉制品加工中經(jīng)常使用的方法。目前市面上防腐劑大多為化學(xué)防腐劑，過(guò)量使用極易產(chǎn)生毒副作用，因此需要一種無(wú)毒副作用，且能達(dá)到抑菌防腐作用的天然防腐劑。近年來(lái)，從天然植物中提取的有效活性物質(zhì)被驗(yàn)證抑菌譜廣，可以有效地抑制肉類(lèi)產(chǎn)品中微生物的生長(zhǎng)，應(yīng)用于肉類(lèi)產(chǎn)品中可以滿(mǎn)足人類(lèi)對(duì)綠色、健康、安全的產(chǎn)品需求[1，2]。

目前從天然植物提取物中提出的有效活性物質(zhì)又被稱(chēng)作為“植物源”，從天然植物中提出的單體成分，如茶多酚等單獨(dú)使用無(wú)法做到廣譜抑菌，且抑菌防腐效果一般，添加量小無(wú)法達(dá)到抑菌效果，而添加量增大又會(huì)影響肉制品的感官品質(zhì)[3～6]。

本試驗(yàn)采用粗獷提取方法，從多種天然植物中提取各種有效活性成分。以總黃酮為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)不斷優(yōu)化提取工藝參數(shù)，最終得到一款天然植物抑菌劑，通過(guò)驗(yàn)證該天然植物抑菌劑具有抑制肉制品中微生物生長(zhǎng)的作用，且能延緩肉制品中揮發(fā)性鹽基氮含量的增長(zhǎng)速率[7～9]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

決明子，青島德慧海洋生物科技有限公司；

迷迭香、刺梨根、刺山柑，新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)；

沙棘種皮，青河縣惠華商貿(mào)有限公司；

綠茶，嶗山區(qū)山海游農(nóng)漁特產(chǎn)經(jīng)銷(xiāo)處；

雞胸肉，青島市城陽(yáng)蔬菜水產(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng)；

平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基，上海保藏生物技術(shù)中心；

化學(xué)試劑均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 設(shè)備、儀器

電子天平LE2002E/02，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-3000E，上海耀特儀器設(shè)備有限公司；

立式高壓滅菌器LDZX-50KBS，上海申安醫(yī)療器械廠；

生物安全柜HR40-IIA2，青島海爾特種電器有限公司；

紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)TU-1810，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 試驗(yàn)方法

將天然決明子種子胚芽、迷迭香地上部分、刺山柑、刺梨根、沙棘種皮、綠茶等分別粉碎，過(guò)60目篩分離雜質(zhì)，按質(zhì)量比1∶1∶1∶1∶1∶1，混勻備用。

1.2.1 設(shè)計(jì)天然提取物單因素試驗(yàn)

1.2.1.1 提取溫度對(duì)總黃酮含量的影響

依據(jù)以往研究，控制超聲提取時(shí)間為3h，料液比為1∶30，乙醇濃度為65%，將超聲提取溫度分別設(shè)為20、35、50、75、90℃。提取結(jié)束后測(cè)定提取物的總黃酮含量確定最佳提取溫度。

1.2.1.2 提取時(shí)間對(duì)總黃酮含量的影響

控制超聲提取溫度為50℃，料液比為1∶30，乙醇濃度為65%，將超聲提取時(shí)間分別設(shè)為1、2、3、4、5h。提取結(jié)束后測(cè)定提取物的總黃酮含量確定最佳超聲提取時(shí)間。

1.2.1.3 料液比對(duì)總黃酮含量的影響

控制超聲提取時(shí)間為3h，超聲溫度為50℃，乙醇濃度為65%，將料液比分別設(shè)為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50。提取結(jié)束后測(cè)定提取物的總黃酮含量確定最佳料液比。

1.2.1.4 乙醇濃度對(duì)總黃酮含量的影響

控制超聲提取時(shí)間為3h，超聲溫度為50℃，料液比為1∶20，將乙醇濃度分別設(shè)為35%、50%、65%、80%、95%，提取結(jié)束后測(cè)定提取物的總黃酮含量確定最佳料液比。

1.2.2 設(shè)計(jì)天然提取物正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，影響總黃酮含量的主要因素有提取溫度、提取時(shí)間、料液比、乙醇濃度。故以此四因素設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)，以提取物中總黃酮含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定提取的最佳工藝條件(見(jiàn)表1)。

表1 L9(34)正交試驗(yàn)的因素與水平

1.2.3 天然植物提取物總黃酮含量測(cè)定

天然植物提取物中黃酮含量的測(cè)定采用改良比色法。將萃取液或(+)兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液的樣品(0.25mL)與蒸餾水(1.25mL)在試管中混合，然后加入5%NaNO2溶液(75mL)。靜置5min后，加入10%AIC13.6H2O溶液(150mL)，然后將混合物靜置另外6min，加入1M NaOH(0.5mL)。用蒸餾水將混合物稀釋至2.5mL，并充分混合。與類(lèi)似制備的含有已知(β)-兒茶素濃度的標(biāo)準(zhǔn)品相比，立即用分光光度法在510nm處對(duì)空白進(jìn)行了吸光度測(cè)量。

1.2.4 天然植物提取物抑菌防腐測(cè)定試驗(yàn)

取20mL天然植物提取液，按體積比1∶10加入無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行稀釋?zhuān)?00g雞胸肉，將雞胸肉浸泡在天然植物提取稀釋液中20min，文火煮熟取出雞胸肉再次浸泡20min，對(duì)照組采用同體積的生理鹽水浸泡處理，置36℃霉菌培養(yǎng)箱中貯藏。

1.2.4.1 天然植物提取物抑制雞肉中菌落總數(shù)試驗(yàn)

每隔24h取肉樣2g溶于200mL無(wú)菌生理鹽水中，做梯度稀釋?zhuān)∠♂屢?00μL涂布于平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基上，48h后觀察菌落總數(shù)。

1.2.4.2 雞肉中揮發(fā)性鹽基氮含量測(cè)定試驗(yàn)

稱(chēng)取2～5g試樣(精確到0.0001g)于50mL具塞錐形瓶中，加蒸餾水30mL，旋渦振蕩10min，4 000r/m離心10min，上清液為樣液，取20mL的2%硼酸溶液于150mL錐形瓶中，加混合指示劑2滴，使凱氏蒸餾裝置的冷凝管末端浸入此溶液,蒸餾裝置的蒸汽發(fā)生器的水中應(yīng)加甲基紅指示劑數(shù)滴，硫酸數(shù)滴，且保持此溶液為橙紅色，否則補(bǔ)加硫酸，準(zhǔn)確移取10mL樣液注入蒸餾裝置的反應(yīng)室中，用少量蒸餾水沖洗進(jìn)樣入口，塞好入口玻璃塞，再加入10mL的氧化鎂溶液，小心提起玻璃塞使其流入反應(yīng)室，將玻璃塞塞好，且在入口處加水封好，防止漏氣，蒸餾10min，使冷凝管末端離開(kāi)吸收液面，再蒸餾1min，用蒸餾水洗冷凝管末端，洗液均流入吸收液，吸收氨后的吸收液立即用0.01mol L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液滴定，溶液由藍(lán)綠色變?yōu)榛壹t色為終點(diǎn)，同時(shí)進(jìn)行試劑空白測(cè)定。按照公式(1)進(jìn)行計(jì)算。

(1)

式中：

X—樣品中揮發(fā)性鹽基氮的含量，mg/100g；

V1—滴定試樣時(shí)所需鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL；

V2—滴定空白時(shí)所需鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL；

c—鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，mol/L；

m—試樣重量，g；

V—試樣分解液蒸餾用體積，mL；

V0—樣液總體積，mL；

14—與1.00mL鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液[c(HCI)=1.000mol/L]相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量，mg。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每次實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)操作，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行顯著性分析，處理結(jié)果均以X±SD表示，圖表制作利用Excel 2003軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溫度對(duì)總黃酮含量的影響

如圖1所示，隨提取溫度的升高，總黃酮含量也在不斷上升。當(dāng)提取溫度升高到50℃時(shí)，隨著提取溫度的不斷上升，總黃酮含量反而出現(xiàn)下降的趨勢(shì)；提取溫度在50℃時(shí)，總黃酮含量達(dá)到最高峰。故將提取溫度初步定為50℃。

圖1 提取溫度對(duì)總黃酮含量影響

2.2 提取時(shí)間對(duì)總黃酮含量的影響

如圖2所示，隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)，總黃酮含量也在不斷上升；當(dāng)提取時(shí)間延長(zhǎng)到3h時(shí)，隨著提取時(shí)間的再次延長(zhǎng)，總黃酮含量基本保持不變。故將提取時(shí)間初步定為3h。

圖2 提取時(shí)間對(duì)總黃酮含量影響

2.3 料液比對(duì)總黃酮含量的影響

如圖3所示，隨著溶劑液體的不斷增大，總黃酮提取含量在不斷下降，當(dāng)料液從1∶10減小到1∶20時(shí)，總黃酮含量基本保持不變；但將1∶20的料液比繼續(xù)稀釋?zhuān)傸S酮含量出現(xiàn)下降趨勢(shì)。故初步將料液比定位1∶20。

圖3 料液比對(duì)總黃酮含量影響

2.4 乙醇濃度對(duì)總黃酮含量的影響

如圖4所示，隨著乙醇濃度的不斷增大，總黃酮提取含量也在不斷上升，但當(dāng)乙醇濃度達(dá)到65%時(shí)，出現(xiàn)拐點(diǎn)；隨著乙醇濃度的繼續(xù)增長(zhǎng)，總黃酮含量反而出現(xiàn)下降的趨勢(shì)。故初步將乙醇濃度定為65%。

圖4 乙醇濃度對(duì)總黃酮含量影響

2.5 正交結(jié)果分析

通過(guò)分析試驗(yàn)極差值可以看出(見(jiàn)表2)，影響提取物總黃酮含量的因素主次順序?yàn)锳>B>D>C，提取溫度為主要控制因素，其次是提取時(shí)間，最優(yōu)組合是A2B3C1D2。綜合來(lái)說(shuō)，對(duì)因素A、B、C、D分析，確定優(yōu)水平為A2、B3、C1、D2。以最佳工藝A2B3C1D2進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得出提取液總黃酮含量為8.26g/100mL。故選擇配方為A2B3C1D2為最佳配方，即提取溫度為50℃，提取時(shí)間為4h，料液比為1∶20，乙醇濃度為65%。

表2 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

3 總結(jié)

天然植物提取物的最佳工藝條件為，提取溫度為50℃，提取時(shí)間為4h，料液比為1∶20，乙醇濃度為65%，得出提取液總黃酮含量達(dá)到最大值為8.26g/100mL。應(yīng)用天然植物提取物的肉制品，TVB-N、菌落總數(shù)與對(duì)照組相比顯著降低(p<0.01)。天然植物提取液具有明顯抗菌活性。