于 航，李豐超，李金梁，秦小萍*，劉全俊

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院,云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 水利學(xué)院，云南 昆明 650201)

0 引言

大菜粉蝶(Pierisbrassicae)屬鱗翅目(Lepidoptera)粉蝶科(Pieridae)，又名歐洲粉蝶、甘藍(lán)粉蝶、大白蝶，其幼蟲俗稱甘藍(lán)毛蟲，寄主為油菜、白菜、蘿卜和甘藍(lán)等十字花科植物，危害特點(diǎn)為小齡幼蟲群集于葉背啃食葉肉，齡期大后則分散成小群暴食葉片，甚至連葉脈和葉柄都吃光，嚴(yán)重影響了油菜和蔬菜的質(zhì)量和產(chǎn)量(吳祖銀等[1]，1982)。大菜粉蝶(Pierisbrassicae)是十字花科蔬菜上的主要害蟲之一，目前對其仍以化學(xué)農(nóng)藥防治為主，不合理的施用方式以及大劑量、多次施藥，造成了害蟲抗性逐年升高、農(nóng)藥殘留等問題。因此，開發(fā)防治大菜粉蝶的植物源農(nóng)藥，了解植物源農(nóng)藥作用機(jī)制，探究坡柳皂苷對大菜粉蝶中腸組織的影響具有重要的意義。坡柳皂苷是一種從坡柳種子中提取出來的齊墩果烷型三萜皂苷、萜烯類物質(zhì)。學(xué)者們研究發(fā)現(xiàn)坡柳皂苷具有抗炎癥(Arun等[2]，2008；Bernays等[3]，2001)和抗?jié)?Getie等[4]，2003；Khalil等[5]，2006)的活性，之后也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)其具有抗蟲活性。在殺蟲作用研究中發(fā)現(xiàn)，坡柳皂苷對大菜粉蝶幼蟲具有較強(qiáng)的拒食作用(張余杰等[6]，2014)。秦小萍等[7](2007)研究發(fā)現(xiàn)：坡柳種子的乙醇提取物對小菜蛾具有非選擇性拒食作用，對菜青蟲的生長發(fā)育有影響。楊美林等[8](2003)研究得出：坡柳乙醇提取物對小菜粉蝶4齡幼蟲24 h選擇拒食作用的AFC50值為691.6 mg/L，完全拒食作用的AFC50值為398.0 mg/L。付立新[9](2010)、秦小萍[7]等(2015)從坡柳種子中分離鑒定了拒食活性成分坡柳皂苷A(圖1)，齊墩果烷三萜皂苷類物質(zhì)含量為7.89%。代玉玲等[10](2012)通過正交設(shè)計優(yōu)選出坡柳(總)皂苷提取方法。廉喜紅等[11](2005)發(fā)現(xiàn)苦皮藤素對粘蟲中腸腸壁細(xì)胞的內(nèi)膜和質(zhì)膜系統(tǒng)有一定影響，在苦皮藤素作用下，試蟲的柱狀細(xì)胞頂膜微絨毛出現(xiàn)擴(kuò)張、線粒體膨大腫脹、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊泡化、杯狀細(xì)胞與柱狀細(xì)胞之間的間隙增大。周琳等[12](2009)發(fā)現(xiàn)雷公藤總堿對粘蟲的中腸細(xì)胞及細(xì)胞器有一定的影響，表現(xiàn)為微絨毛混亂脫落、線粒體腫脹、雙層膜不完整、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨大囊泡化。本課題組在研究前期發(fā)現(xiàn)，坡柳皂苷對鱗翅目昆蟲具有拒食作用以及胃毒作用，對坡柳皂苷的殺蟲機(jī)制研究較少。研究發(fā)現(xiàn)，使用較高濃度處理大菜粉蝶幼蟲，會使部分試蟲在短期內(nèi)出現(xiàn)死亡的現(xiàn)象，猜測在較高濃度下，坡柳皂苷對大菜粉蝶幼蟲有一定的胃毒活性，本文研究了坡柳皂苷對大菜粉蝶中腸的影響，以揭示其對胃毒作用的貢獻(xiàn)。

圖1 坡柳皂苷A結(jié)構(gòu)圖

1 材料與方法

1.1 試蟲

大菜粉蝶幼蟲：人工累代飼養(yǎng)后挑選蛻皮后第一天的5齡幼蟲。

1.2 試劑

坡柳皂苷為本實(shí)驗(yàn)室自行制備，其中齊墩果烷型皂苷含量為61%。

濃度為2.5%的戊二醛、pH值為7.2～7.4的PBS緩沖液、國產(chǎn)分析乙醇。

1.3 方法

1.3.1 試蟲處理 挑選蛻皮后第一天的5齡幼蟲，饑餓6 h，處理組試蟲以載毒葉碟法飼喂(吳文君[13]，1988)(用1 mg/mL坡柳皂苷水溶液浸漬直徑為1.2 cm的葉碟1 s，待溶劑揮發(fā)后，喂蟲，一蟲一葉)，分別于蟲取食完成24和48 h后，取幼蟲中腸制備樣品，對照組試蟲飼喂同樣大小浸泡過水溶液的葉碟。

1.3.2 標(biāo)本制備 分別取處理組(24和48 h)及對照試蟲，在冰盤上快速解剖，取出中腸，4 ℃下將中腸組織投入戊二醛中進(jìn)行48 h前固定，PBS溶液洗脫，鋨酸后固定，PBS溶液洗脫，梯度酒精(30%、50%、70%、90%、100%)脫水，包埋劑包埋，在常溫下和60 ℃烘箱中各聚合48 h，醋酸鈾和檸檬酸鉛進(jìn)行雙重染色。

1.3.3 生物顯微鏡觀察 將樣品切成半薄切片，在生物顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.4 透射電鏡觀察 將樣品切成超薄切片，在透射電子顯微鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 坡柳皂苷對大菜粉蝶幼蟲顯微結(jié)構(gòu)觀察

由圖2可知，，取食正常飼料的大菜粉蝶幼蟲腸中沒有滯留食物殘?jiān)?，圍食膜依然存在，中腸細(xì)胞除只表現(xiàn)出稍有皺縮、分泌液滴增多外，并無其他明顯的病變(圖2-a-1、圖2-a-2)。取食1 mg/mL坡柳皂苷24 h后，中腸組織開始發(fā)生變化，處理試蟲的圍食膜消失，腸內(nèi)壁微絨毛消失(圖2-b、圖2-c)，48 h后的病變更為明顯。食物和中腸組織接觸甚至可穿透中腸細(xì)胞層。中腸細(xì)胞病變的表現(xiàn)為先稍加厚，變得無明顯細(xì)胞層次，繼而脫落(圖2-b)，直至最后腸細(xì)胞組織全部脫落、消融而僅剩下環(huán)肌層(圖2-c)。解剖時，幼蟲的中腸組織極易斷裂，也證明了縱肌受到了破壞。

a-1.對照24 h×200,a-2.對照48 h×200,b.處理24 h×200,c.處理48 h×200,Vc.中腸細(xì)胞,lm.縱肌,cm.環(huán)肌,f.微絨毛,fa.脂肪體

2.2 坡柳皂苷對大菜粉蝶幼蟲環(huán)肌與底膜的影響

由圖3可知，取食正常葉碟的大菜粉蝶幼蟲的環(huán)肌與底膜緊密的聯(lián)系在一起，通過圖3-A1取食1 mg/mL坡柳皂苷24 h后，環(huán)肌與底膜開始分離(圖3-B1)，取食1 mg/mL坡柳皂苷48 h后，底膜脫落、消融，試蟲僅剩下環(huán)肌層。

A1.環(huán)肌(cm)與底膜(b)×10000,B1.環(huán)肌(cm)與底膜(b)×10000

2.3 坡柳皂苷對大菜粉蝶幼蟲微絨毛的影響

由圖4可知，取食正常葉碟的大菜粉蝶幼蟲中腸杯狀細(xì)胞微絨毛數(shù)量眾多，排列緊密整齊(圖4-A4)，取食1 mg/mL坡柳皂苷24 h后，大菜粉蝶幼蟲中腸細(xì)胞微絨毛腫脹變形，斷裂脫落(圖4-B3)。

A4.整齊排列的微絨毛(m)×10000,B3.微絨毛(m)脫落×10000

2.4 坡柳皂苷對大菜粉蝶幼蟲細(xì)胞器的影響

由圖5可知，取食正常葉碟的大菜粉蝶幼蟲中腸內(nèi)細(xì)胞器發(fā)達(dá)排列整齊有序(圖5-A2)，取食1 mg/mL坡柳皂苷48 h后，中腸內(nèi)各種細(xì)胞器均變形，并被溶酶體包圍而溶解(圖5-C1、圖5-C2)。

A2.細(xì)胞內(nèi)豐富的細(xì)胞器×10000,C1.被溶酶體(ly)包圍的細(xì)胞器×15000,C2.同C1×30000

2.5 坡柳皂苷對大菜粉蝶幼蟲光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的影響

由圖6可知，取食正常葉碟的大菜粉蝶幼蟲光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達(dá)且排列整齊有序(圖6-A3)，而取食1 mg/mL坡柳皂苷24 h后，大菜粉蝶幼蟲的光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨脹(圖6-B2)，取食1 mg/mL坡柳皂苷48 h后，大菜粉蝶幼蟲的光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相比較于取食坡柳皂苷24 h后更加膨大(圖6-C3)。

A3.光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ser)×30000,B2.光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ser)×30000,C3.膨大的光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ser)×30000

3 討論

本研究通過透射電鏡觀察了大菜粉蝶取食坡柳皂苷后中腸細(xì)胞內(nèi)部的變化，發(fā)現(xiàn)1 mg/mL坡柳皂苷對大菜粉蝶幼蟲的腸壁細(xì)胞及其細(xì)胞器均產(chǎn)生了影響。在1 mg/mL坡柳皂苷的作用下，大菜粉蝶幼蟲圍食膜和微絨毛消失，腸細(xì)胞與底膜分離，腔內(nèi)出現(xiàn)大量空泡，溶酶體活動劇增，細(xì)胞器及細(xì)胞體出現(xiàn)自溶，光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)極度膨大。與已報道的川楝素對菜青蟲的中腸系統(tǒng)影響基本一致(張興等[14]，1991)。

本研究發(fā)現(xiàn)，1 mg/mL坡柳皂苷所導(dǎo)致的中腸組織病變與拒食作用無關(guān)，通過生物顯微鏡觀察后發(fā)現(xiàn)，48 h對照組的大菜粉蝶幼蟲中腸組織完好，并沒有表現(xiàn)出任何病變的情況，證明取食了1 mg/mL坡柳皂苷的幼蟲中腸的病變并不是由于拒食作用的影響。中腸組織的自溶是引起病變的主要原因。電鏡觀察結(jié)果表明，試蟲取食了1 mg/mL坡柳皂苷24 h后，中腸開始發(fā)生變化，微絨毛消失，溶酶體活動劇增，細(xì)胞器及細(xì)胞體發(fā)生自溶現(xiàn)象，這可能是后來引起中腸細(xì)胞溶解脫落的原因，但還需要對某些引起自溶的酶進(jìn)行分析，以便進(jìn)一步確認(rèn)。

光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)上的病變與多功能氧化酶有關(guān)。昆蟲中腸內(nèi)的微粒體多功能氧化酶是分解外源毒物的主要酶系，而光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是微粒體的主要組成部分。光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的病變可能標(biāo)志著分解外源毒物功能的降低，但還需要進(jìn)行MFO活性測定，以便進(jìn)一步確認(rèn)。

總之，通過對中腸組織較系統(tǒng)的觀察，證明了取食1 mg/mL坡柳皂苷后，大菜粉蝶幼蟲消化系統(tǒng)的正常功能受到了干擾，中腸組織受到嚴(yán)重破壞而發(fā)生脫落、自溶。坡柳皂苷對中腸這一消化系統(tǒng)主要器官的影響是引起昆蟲死亡的一個重要原因。

4 結(jié)論

大菜粉蝶4齡幼蟲取食坡柳皂苷24和48 h后，中腸組織發(fā)生了明顯的病變，說明這是坡柳皂苷對大菜粉蝶產(chǎn)生胃毒作用的靶點(diǎn)之一。