林 凱，胡重怡，郭 平，王 棟*

(1.江西農(nóng)業(yè)大學，江西 南昌 330045；2.江西省食品檢驗檢測研究院，江西 南昌 330001)

柚[Citrusmaxima(Burm)Merr.]是蕓香科、柑橘屬植物，喬木。柚子是其開花后成熟果實,又名朱欒、雪柚、氣柑、文旦等[1]，在我國已有3000多年栽培歷史，廣泛分布于我國的廣東、廣西、福建、臺灣、浙江、四川、江西等省份[2]。柚子清香、酸甜、涼潤，營養(yǎng)豐富，藥用價值很高[3]，是人們喜食的水果之一，也是醫(yī)學界公認的最具食療效果的水果之一。柚子具有抗腫瘤、抗氧化、清除自由基和治療糖尿病的藥理作用，同時具有抑制細菌增長、抗炎癥和鎮(zhèn)痛的功效[4]。柚皮質(zhì)量占整個柚子質(zhì)量的30%～40%，傳統(tǒng)中醫(yī)認為，柚果皮具有止咳、化痰、理氣、抗炎等功效[5]。柚子富含多種活性成分，包括橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷、柚皮素及橙皮素等黃酮類化合物，還富含生物堿類、香豆素類、檸檬苦素類和其他三萜類化合物，柚子的果皮中富含多種揮發(fā)油類物質(zhì)[2]。

研究柚子的代謝組分有利于深入挖掘柚子的活性成分。萬建[6]選擇了包括柚子在內(nèi)的4種柑橘類型，利用液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用(Liquid Chromatography Mass Spectrometry，LC-MS)技術(shù)進行代謝物的非靶向鑒定與檢測，共鑒定出54個代謝物，主要包括氨基酸類、黃酮類和檸檬苦素類物質(zhì)。目前，關(guān)于柚子代謝組分的研究主要集中在多酚類物質(zhì)，其中又以類黃酮和酚酸物質(zhì)為主。李汀等[7]在柚果肉膳食多酚粗提物中共鑒定出7種可精確定量的多酚單體：柚皮苷、蕓香柚皮苷、野漆樹苷、香草酸、甲基橙皮苷、新西蘭牡荊苷和阿魏酸，其中柚皮苷含量為50.54 mg/g，顯著高于其他6種多酚。柚皮苷是一種二氫黃酮類物質(zhì)，存在于柚及其變種的果皮及果實中，且是該類水果中的主要黃酮類物質(zhì)[8]。柚皮苷及其苷元柚皮素在降血脂、鎮(zhèn)靜、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗真菌、抗動脈粥樣硬化、抗脂過氧化和保護肝蛋白等方面具有較強的生物活性和很高的藥用價值[9-13]。同時，柚皮苷和柚皮素是造成柑橘類水果苦味的主要物質(zhì)[14-15]，這也造就了柚子獨特的風味。方波等[16]利用超高效液相色譜法同時快速測定柑橘果實中11種類黃酮的含量，結(jié)果表明：柚果實中類黃酮含量豐富且各種類之間組分含量差異顯著。聶嘉琳等[17]采用超高效液相色譜三重四級桿質(zhì)譜法，對不同柚子品種的不同部位的酚酸、類黃酮和香豆素類物質(zhì)進行靶向篩查和定量分析，結(jié)果表明：柚子果肉和果皮的活性物質(zhì)的種類和含量也不盡相同。

原產(chǎn)于福建省漳州市平和縣的琯溪蜜柚和原產(chǎn)于廣西容縣沙田村的沙田柚是目前市場上深受消費者喜愛的2種蜜柚品種，市場占有率高，果肉飽滿，味道甜蜜。近年來，經(jīng)過長期的選育，江西省的特色農(nóng)產(chǎn)品吉安市周邊的井岡蜜柚也開始受到消費者的喜愛，目前與南豐蜜桔、贛南臍橙并稱為江西果業(yè)三寶，相比于琯溪蜜柚和沙田柚，井岡蜜柚入口偏苦，但回甘明顯，味道清甜，與琯溪蜜柚、沙田柚相比，更有柚子味，清甜風味明顯具備地理標志性特征。高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜是獲得植物代謝物譜的有效技術(shù)[18-19]，本研究通過超高液相色譜與飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，對比不同產(chǎn)地的蜜柚非靶向代謝組分，從中挖掘江西省特色農(nóng)產(chǎn)品井岡蜜柚風味物質(zhì)代謝基礎(chǔ)，為進一步深入挖掘井岡蜜柚農(nóng)產(chǎn)品附加值提供了堅實的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

井岡蜜柚采摘于吉安縣產(chǎn)地，琯溪蜜柚、沙田柚購買于原產(chǎn)地，每個柚子品種分別取6個樣品，分離其柚子肉和柚子皮，-80 ℃真空冷凍干燥后磨至干粉保存。

甲醇(質(zhì)譜純)購自美國Honeywell公司，水購自娃哈哈公司，內(nèi)標利多卡因、橙皮素、柚皮素、橙皮苷、柚皮苷等相應標準品購自美國Sigma公司，蔗糖購自國藥集團。0.22有機系濾膜購自日本Shimadzu公司。

1.2 儀器與設備

Acquity UPLC VION IMS QTOF MS超高液相色譜-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀(UPLC-QTOF-MS)，由美國Waters公司生產(chǎn)；QUINTIX124-1CN電子分析天平(精度≤0.1 mg)，由德國賽多利斯公司生產(chǎn)；Vortex Wizard渦旋儀，由意大利VELP公司生產(chǎn)；Multifuge X1R離心機，由美國賽默飛公司生產(chǎn)。

1.3 樣品的前處理

各品種的柚子肉和柚子皮干粉分別稱取20 mg于1.5 mL離心管內(nèi)，加700 μL 90%甲醇水溶液(含10 μmol/L利多卡因內(nèi)標)后，于渦旋儀渦旋3 min，充分混勻，12000 r/m離心5 min，取上清液，過濾膜后準備上機，每個樣品重復2次。

1.4 儀器分析的條件

利用Waters Acquity UPLC VION IMS QTOF MS進行色譜分離和質(zhì)譜檢測，色譜條件：色譜柱為ACQUITY UPLC Ethylene Bridged Hybrid(BEH)C18 column(2.1 mm×50 mm，1.7 μm particle size，由美國Waters公司生產(chǎn))；流動相：以0.1%甲酸水溶液為流動相A和0.1%甲酸乙腈為流動相B進行梯度洗脫，洗脫梯度：0～3 min，5%～50% B；3～12 min，50%～85% B；12～14 min，85%～95% B；14～15 min，95% B保持1 min，15.01～16.00 min，5% B。柱溫50 ℃，流速0.3 mL/min，進樣量1 μL。質(zhì)譜條件：毛細管電壓3.0 kV，錐孔氣50 L/h，去溶劑氣600 L/h，離子源溫度120 ℃，去溶劑溫度500 ℃，低碰撞能量6.0 eV，高碰撞能量25.0～60 eV，掃描范圍50～1500 m/z。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用Progenesis QI 2.3軟件對數(shù)據(jù)進行峰提取、峰對齊，并用EZInfo 2.0軟件對3種品種柚子肉、柚子皮進行聚類分析，從中找出井岡蜜柚的特征差異化合物，利用Chemspider數(shù)據(jù)庫對特征差異化合物進行匹配，對匹配到的差異化合物，購買相應標準品進行確證，并利用Waters Unifi 1.8.1軟件匹配并篩查黃酮類和酸酚類次生代謝產(chǎn)物。

2 結(jié)果與分析

2.1 UPLC-QTOF-MS分離結(jié)果

在試驗設定的色譜質(zhì)譜條件下，井岡蜜柚的柚子肉和柚子皮的總離子流如圖1所示，出峰主要集中在0.3～7.0 min，隨著梯度洗脫時間的延長，非極性化合物在12.0 min后逐步洗脫出峰。

圖1 井岡蜜柚柚子肉(A)和柚子皮(B)組分的UPLC-QTOF-MS圖譜

2.2 主成分分析

對3種不同品種的柚子肉和柚子皮組分分別利用EZInfo 2.0軟件進行主成分分析，其中，共對柚子肉中9600個代謝物進行了聚類，并對柚子皮中9896個代謝物進行了聚類分析，發(fā)現(xiàn)不同品種的柚子肉和柚子皮組分均能分別聚類在一起，從載荷圖中挑選出各個品種的差異化合物(圖2右圖紅色框選中化合物)在Progenesis QI 2.3軟件中進一步利用Chemspider在線數(shù)據(jù)庫進行匹配確定化合物。

圖2 3種品種柚子肉(A)和柚子皮(B)主成分分析(左)和載荷圖(右)

2.3 差異化合物的預測

筆者對柚子肉和柚子皮中選出來的115個差異化合物進行在線匹配，與匹配到23個差異化合物，發(fā)現(xiàn)柚子中的2種典型黃酮類物質(zhì)——柚皮素(Naringenin)和柚皮苷(Naringin)主要在柚子皮中且含量較高，但在井岡蜜柚果肉中，與其他2種果肉相比，這2種黃酮類化合物含量較高，達到柚子皮中含量相當?shù)乃?圖3和圖4)。

圖3 3種柚子品種的柚子皮和柚子肉中柚皮素的含量

圖4 3種柚子品種的柚子皮和柚子肉中柚皮苷的含量

2.4 差異化合物的確定和柚子主要風味物質(zhì)的解析

筆者對已報道的柑橘屬中主要的黃酮類物質(zhì)標準品(柚皮苷、柚皮素、橙皮苷、橙皮素)進行了定性分析，并對一些已報道的其他酸酚類化合物進行了匹配預測，在柚子中，共檢測到以下化合物，具體見表1。

表1 3種不同柚子品種果皮和果肉中代謝物相對含量 mg/kg

柚皮苷、柚皮素2種黃酮類化合物在柚子中的含量較高，而橙皮苷和橙皮素在柚子中只有橙皮苷被檢測到，且含量較低。可以看出，雖均為柑橘屬植物，但是柚子味和其他柑橘屬植物明顯不同。井岡蜜柚的蔗糖含量較低，比沙田柚和琯溪蜜柚分別低40.05%和25.57%，而苦味物質(zhì)柚皮素和柚皮苷含量卻比沙田柚和琯溪蜜柚高出4倍左右，在實際品嘗中，井岡蜜柚雖不如沙田柚和琯溪蜜柚那么甜，但卻更具有柚子味，因而別具風味。

3 結(jié)論

柚子是深受消費者喜愛的水果之一，柚子同時也是一種藥食同源食物，具備藥用價值，中藥化橘紅是柚的未成熟或近成熟的干燥外層果皮，具有理氣寬中、燥濕化痰的功效，主要用于咳嗽痰多、食積傷酒、嘔惡痞悶的治療，化橘紅中的黃酮類化合物主要成分為柚皮苷[20]，2015年《中國藥典》將柚皮苷含量作為化橘紅的標志性成分，規(guī)定其含量不得低于3.5%。

本文將井岡蜜柚與沙田柚和琯溪蜜柚這兩個市場占有率最高的品種進行了比較，通過UPLC-QTOF-MS構(gòu)建了3個品種的柚子肉和柚子皮的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫，采用PCA主成分分析進行了聚類分析，找到了三者的差異化合物115個，經(jīng)過Chemspider數(shù)據(jù)庫比對，筆者從中發(fā)現(xiàn)，在井岡蜜柚果肉中富含柚皮素和柚皮苷這2種黃酮類化合物，并利用標品確認并通過內(nèi)標峰面積計算了其相對定量，結(jié)果表明：在井岡蜜柚中的柚皮素和柚皮苷是其他2個柚子品種果肉的4倍，但是井岡蜜柚的蔗糖含量略低于其他2個品種。根據(jù)以往文獻報道，柑橘果實苦味物質(zhì)主要分為2類：一類是檸檬苦素類似物，包括檸檬苦素和諾米林；另一類是黃酮類化合物，包括柚皮苷、新橙皮苷，其中柚皮苷是主要的苦味物質(zhì)[21]。

本文通過非靶向代謝組學解析，井岡蜜柚的微苦風味主要來源柚皮苷和柚皮素。本方法構(gòu)建的代謝組學數(shù)據(jù)庫可以在后續(xù)的研究中繼續(xù)挖掘柚子的其他組分，利用三萜化合物指紋圖譜對不同品種植物油鑒別起到借鑒作用。